紅光/近紅外LED光療抑制疼痛相關(guān)機(jī)制的研究

易 斌，吳 昊，張涵旭，郭慶霞，何 軍，宋 楠，張鳳民，宋武琦*

（1. 北京創(chuàng)盈光電醫(yī)療科技有限公司，北京 1001762； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，人體自身免疫疾病診療技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，哈爾濱 150081）

慢性疼痛包括多種類型，其中非特異性頸肩腰痛是指既找不到確切的組織結(jié)構(gòu)、病理改變，又無法明確病因的頸肩腰背部疼痛，主要原因可能包括肌肉的勞損、肌筋膜炎、椎小關(guān)節(jié)紊亂等［1］。常在較長時間固定姿勢，如低頭伏案工作、受涼、異?；顒踊虍惓Ｊ芰蟀l(fā)生，表現(xiàn)為局部酸脹、鈍痛或刺痛，以及無力或發(fā)沉感，如未得到及時合適的治療或反復(fù)發(fā)作，易導(dǎo)致疼痛慢性化，并發(fā)牽涉痛以及頸、肩、腰背等部位功能障礙，嚴(yán)重影響工作效率和生活質(zhì)量［2］。

目前，非特異性頸肩腰痛主要采取綜合康復(fù)治療，例如：手法按摩可以選擇性地進(jìn)行軟組織松解術(shù)或關(guān)節(jié)松動術(shù)，以及深部肌肉刺激治療緩解筋膜炎和肌肉勞損［3］；口服或者外用非甾體抗炎藥物治療，并在醫(yī)師指導(dǎo)下進(jìn)行運(yùn)動康復(fù)治療等；超短波療法、激光、中頻電療等物理治療也廣泛用于臨床和社區(qū)［4-7］。

在炎癥相關(guān)慢性疼痛患者和動物模型中，局部組織和神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥因子以表達(dá)升高為主，使用藥物或者其他輔助治療方法抑制炎癥因子或者進(jìn)行鎮(zhèn)痛處理之后，炎癥因子的表達(dá)水平下降，且與患者或者動物模型中疼痛評分呈正相關(guān)［8-9］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上選取疼痛相關(guān)趨化因子和炎癥因子為指標(biāo)，以正常人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和人單核細(xì)胞THP-1為研究模型開展體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，以明確630 nm紅光和850 nm近紅外LED光療的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對象

本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，取20～24歲健康男性志愿者的外周血，使用人淋巴細(xì)胞分離液提取PBMC進(jìn)行后續(xù)光照處理和細(xì)胞因子檢測。人單核細(xì)胞THP-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 儀器設(shè)備

發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）陣列式光源為北京創(chuàng)盈光電醫(yī)療科技有限公司制造（CY-1004C），光源紅光波長為630 nm、近紅外波長為850 nm。兩種波長的光同時照射，平均光功率密度為25 mW/cm2，其中630 nm和850 nm光的光功率密度比例為10∶1。

1.3 試劑

熒光定量PCR引物由黑龍江省博仕生物公司合成，具體序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄試劑使用賽默飛世爾科技（中國）有限公司（Invitrogen）的SuperScript III Kit；熒光定量PCR試劑使用寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）的2×SYBR Premix Ex Taq；RNA提取試劑盒購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。具體操作參見試劑盒說明書。

表1 相關(guān)引物序列Tab. 1 Sequence of the primers

1.4 試驗(yàn)分組

單核細(xì)胞THP-1用于評價光照劑量對細(xì)胞的安全性。22.5 J/cm2功率密度下分別照射3次和5次，最后一次光照結(jié)束后，細(xì)胞立即與細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）溶液孵育，37℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度。通過CCK-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞活性，并與對照組進(jìn)行對比。將每位志愿者的PBMC分為對照組和LED組，共4例，LED組的細(xì)胞接受22.5 J/cm2的固定劑量照射5次，間隔90 min，對照組采用相同操作，但是不進(jìn)行LED光療處理。最后一次照射30 min后，提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.5 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。所有試驗(yàn)中差異的統(tǒng)計學(xué)意義均采用未配對t檢驗(yàn)。每個分析的顯著性水平設(shè)為0.05。使用GraphPad Prism（5.0版）統(tǒng)計程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光/近紅外LED光療對單核細(xì)胞活性的影響分析

為了評價紅光/近紅外LED光療對單核細(xì)胞活性的影響，常規(guī)培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，接種鋪板24 h后選擇兩種方式進(jìn)行LED照射：照射3次，每次15 min（22.5 mW/cm2），間隔180 min；照射5次，每次15 min（22.5 mW/cm2），間隔90 min。然后使用CCK-8法檢測THP-1的細(xì)胞活性。圖1結(jié)果顯示，上述劑量下LED光療對于單核細(xì)胞的活性沒有影響。因此，本文選擇對PBMC照射5次LED進(jìn)行后續(xù)研究，其照射方式與上述THP-1細(xì)胞照射5次的方式相同。

圖1 LED光療后對單核細(xì)胞活性的影響Fig. 1 Effect of LED phototherapy on monocyte activity與對照組（NC）比較，固定劑量22.5 J/cm2照射3次和5次對THP-1細(xì)胞活性沒有明顯影響。ns：P＞0.05。Fixed dose 22.5 J/cm2 irradiation for 3 and 5 times had no significant effect on the activity of THP-1, compared with the control group (NC). ns: P＞0.05.

2.2 紅光/近紅外LED光療對PBMC主要疼痛相關(guān)趨化因子表達(dá)的影響

將PBMC接種在24孔板后常規(guī)培養(yǎng)，6 h開始照射第一次，一共照射5次，每次間隔時間為90 min，照射時間為15 min，照射劑量為22.5 J/cm2。末次照射30 min后，收取細(xì)胞并提取總RNA。熒光定量PCR檢測趨化因子mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PBMC中CXCL12、CXCL13和CX3CL1的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，CXCR1和CXCR2基因轉(zhuǎn)錄未見顯著變化（圖2）。

圖2 LED光療后PBMC主要疼痛相關(guān)趨化因子及受體表達(dá)情況Fig. 2 Expression of main pain related chemokines and receptors in PBMC after LED phototherapy（a）紅光/近紅外LED光療流程；（b）在PBMC中CXCL12 mRNA的表達(dá)情況；（c）在PBMC中CXCL13 mRNA的表達(dá)情況；（d）在PBMC中CXCL10 mRNA的表達(dá)情況；（e）在PBMC中CX3CL1 mRNA的表達(dá)情況；（f）在PBMC中CXCR1 mRNA的表達(dá)情況；（g）在PBMC中CXCR2 mRNA的表達(dá)情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05，*P＜0.05。(a) Red/near infrared LED phototherapy process; (b) CXCL12 mRNA expression in PBMC; (c) CXCL13 mRNA expression in PBMC; (d) CXCL10 mRNA expression in PBMC; (e) CX3CL1 mRNA expression in PBMC; (f) CXCR1 mRNA expression in PBMC; (g) CXCR2 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, *P＜0.05.

在上述相同處理?xiàng)l件下，PBMC中CCL4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，CCL1基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，但CCR2基因轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)（圖3）。

圖3 LED光療后PBMC主要疼痛相關(guān)趨化因子及受體表達(dá)情況Fig. 3 Expression of main pain related chemokines and receptors in PBMC after LED phototherapy（a）在PBMC中CCL4 mRNA的表達(dá)情況；（b）在PBMC中CCL1 mRNA的表達(dá)情況；（c）在PBMC中CCL2 mRNA的表達(dá)情況；（d）在PBMC中CCL3 mRNA的表達(dá)情況；（e）在PBMC中CCR2 mRNA的表達(dá)情況；（f）在PBMC中CCR4 mRNA的表達(dá)情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01。(a) CCL4 mRNA expression in PBMC; (b) CCL1 mRNA expression in PBMC; (c) CCL2 mRNA expression in PBMC; (d) CCL3 mRNA expression in PBMC; (e) CCR2 mRNA expression in PBMC; (f) CCR4 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, *P＜0.05, **P＜0.01.

2.3 紅光/近紅外LED光療對PBMC主要疼痛相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響

在上述相同處理?xiàng)l件下，經(jīng)LED光療之后參與疼痛誘導(dǎo)的IL-4和IL-6基因表達(dá)顯著下調(diào)，IL-1β和IL-8基因的表達(dá)沒有明顯變化（圖4）。

圖4 LED光療后PBMC主要疼痛相關(guān)炎癥因子表達(dá)情況Fig. 4 Expression of main pain related inflammatory factors in PBMC after LED phototherapy（a）在PBMC中IL-4 mRNA的表達(dá)情況；（b）在PBMC中IL-6 mRNA的表達(dá)情況；（c）在PBMC中IL-1β mRNA的表達(dá)情況；（d）在PBMC中IL-8 mRNA的表達(dá)情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001。(a) IL-4 mRNA expression in PBMC; (b) IL-6 mRNA expression in PBMC; (c) IL-1β mRNA expression in PBMC; (d) IL-8 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, *P＜0.05, ***P＜0.001.

2.4 紅光/近紅外LED光療對PBMC主要疼痛相關(guān)金屬蛋白酶表達(dá)的影響

在上述相同處理?xiàng)l件下，參與疼痛誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）的基因經(jīng)LED光療之后其表達(dá)顯著下調(diào)，但MMP9和PTGR3基因表達(dá)沒有明顯變化（圖5）。

圖5 LED光療后PBMC主要疼痛相關(guān)金屬蛋白酶的表達(dá)情況Fig. 5 Expression of major pain related metalloproteinases in PBMC after LED phototherapy （a）在PBMC中MMP2 mRNA的表達(dá)情況；（b）在PBMC中MMP9 mRNA的表達(dá)情況；（c）在PBMC中PTGR3 mRNA的表達(dá)情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05， **P＜0.01。(a) MMP2 mRNA expression in PBMC; (b) MMP9 mRNA expression in PBMC; (c) PTGR3 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, **P＜0.01.

2.5 紅光/近紅外LED光療調(diào)控疼痛作用機(jī)制

本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅光/近紅外LED光療可以有效降低PBMC中炎癥因子和趨化因子的表達(dá)水平，可通過炎癥因子和趨化因子對于神經(jīng)疼痛敏感性的調(diào)節(jié)作用發(fā)揮鎮(zhèn)痛功能（圖6）。

圖6 紅光/近紅外LED光療調(diào)控疼痛作用機(jī)制Fig. 6 Mechanism of pain modulation by red/near infrared LED phototherapyGPCR：G蛋白偶聯(lián)受體；EGFR：表皮生長因子受體。GPCR: G protein-coupled receptors; EGFR: Epidermal growth factor receptor.

3 討論

光生物調(diào)節(jié)（photobiomodulation，PBM）是細(xì)胞吸收可見光和近紅外光譜范圍內(nèi)的非電離光輻射，從而引發(fā)光物理和光化學(xué)過程的機(jī)制。光生物調(diào)節(jié)療法（photobiomodulation therapy，PBMT）是基于PBM原理的光子照射療法，可使用在可見和近紅外光譜中來自光源的非電離形式的光（包括激光、發(fā)光二極管和寬帶光）來引起生理變化和治療效果［10］。紅光和近紅外光由于具有良好的組織穿透性，已廣泛地應(yīng)用于臨床物理治療。

目前認(rèn)為，通過超短波、超聲等理療可以加速炎癥部位的血液循環(huán)，加快滲出液的吸收，從而達(dá)到消炎、鎮(zhèn)痛的目的。近年來LED光電設(shè)備作為低功率激光的替代品，越來越多地被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)踐。大量研究表明，紅光和近紅外波段內(nèi)的LED光源具有抗炎、組織修復(fù)等生物學(xué)功能［11-13］。臨床應(yīng)用也發(fā)現(xiàn)，其對局部組織的消炎鎮(zhèn)痛具有良好的效果，但其鎮(zhèn)痛的分子機(jī)制目前還不是十分清楚。

疼痛本身可作為機(jī)體受到傷害時的一種警告，引發(fā)機(jī)體做出一系列防御性保護(hù)反應(yīng)。由炎癥引起的慢性疼痛往往給患者帶來了難以忍受的折磨，并嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。本研究通過紅光（630 nm）/近紅外（850 nm）LED光源對正常人PBMC進(jìn)行照射，通過熒光定量PCR方法檢測疼痛相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，分析紅光/近紅外光對慢性疼痛的抑制作用機(jī)制。

本研究采用PBMC作為研究對象。它是血流中趨化因子和炎癥因子的主要來源，可用來模擬正常使用條件下光療照射部位血液和組織液中相關(guān)因子的表達(dá)水平；慢性炎癥局部單核細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可有效調(diào)控炎癥在組織局部引發(fā)疼痛。組織和神經(jīng)來源的各種細(xì)胞因子對光照的反應(yīng)還需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

趨化因子在機(jī)體發(fā)生炎癥、損傷及病原體入侵時，其表達(dá)含量增高，并向受損部位募集免疫細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。大量研究表明，趨化因子可通過外周和中樞敏化的雙重機(jī)制參與慢性疼痛［14］。CXCL12是一種肝素結(jié)合趨化因子，CXCL12/CXCR4在神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機(jī)制中是充分和必要的。阻斷CXCL12/CXCR4信號通路可能有助于緩解過敏性接觸性皮炎的瘙癢和疼痛感［15］。急性鞘內(nèi)給藥CXCL12可直接誘導(dǎo)觸發(fā)大鼠機(jī)械過敏［16］。鞘內(nèi)注射CXCL12中和抗體或CXCR4拮抗劑AMD3100可延遲機(jī)械異常疼痛的發(fā)生，并逆轉(zhuǎn)PSNL或SNI誘導(dǎo)的機(jī)械異常疼痛［17］。在疼痛大鼠模型中，CXCL13表達(dá)顯著上調(diào)，激活p38/ERK/AKT通路，從而對抗嗎啡的鎮(zhèn)痛作用［18］。CX3CL1與MMP9上調(diào)共同參與了坐骨神經(jīng)慢性收縮損傷（chronic constriction injury，CCI）、大鼠機(jī)械異常痛和熱痛覺過敏的過程［19］。CX3CL1和CCL2的表達(dá)分別與下肢疼痛和腰痛的視覺模擬評分法（visual analogue scale，VAS）的評分呈正相關(guān)［20］。

CCL4與CCR1和CCR5結(jié)合，在部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎后，受損坐骨神經(jīng)的巨噬細(xì)胞和雪旺細(xì)胞中的CCL3、CCL4、CCR1和CCR5顯著上調(diào)［21］。鞘內(nèi)注射CCR2/CCR5拮抗劑可以減輕大鼠慢性結(jié)扎損傷模型的神經(jīng)性疼痛，鎮(zhèn)痛藥物的使用也可以顯著下調(diào)CCL4的表達(dá)［22］。

本研究發(fā)現(xiàn)，給與紅光/近紅外光照處理后，PBMC中IL-4和IL-6的表達(dá)水平顯著下降，這一作用可以緩解局部無菌性炎癥引發(fā)的疼痛。項(xiàng)目組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，630 nm 紅光LED照射可以抑制滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［11-12］。本研究采用正常人PBMC作為細(xì)胞模型，通過光照處理后，趨化因子和炎癥因子表達(dá)都有顯著下降。雖然是體外試驗(yàn)，但可以部分地說明，紅光/近紅外光照處理可以有效抑制疼痛相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而影響疼痛過程。

活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放MMP2和MMP9誘導(dǎo)中樞敏感化并維持神經(jīng)性疼痛。通過藥物下調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)可以上調(diào)結(jié)扎損傷模型鼠的疼痛閾值［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，光照后PBMC中MMP2的表達(dá)水平顯著下降，提示其可能參與了抑制疼痛的過程。

綜上所述，炎癥因子和趨化因子對于神經(jīng)疼痛的敏感性有調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)控其表達(dá)可發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究證明了紅光（630 nm）/近紅外（850 nm）LED光療可抑制PBMC中炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而緩解疼痛。這一發(fā)現(xiàn)有望成為新的疼痛輔助治療手段。