結(jié)核病亞單位疫苗的臨床研究進(jìn)展

杜京津 逄宇 李凌

1廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（廣東 東莞 523000）；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌免疫室（北京 101149）；3南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（廣州 510515）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起的全球性傳染病，據(jù)統(tǒng)計(jì)2020年全球約有990 萬(wàn)結(jié)核病新增病例以及150 萬(wàn)死亡病例［1］。疫苗接種是預(yù)防和控制結(jié)核病最直接、最有效的手段，雖然結(jié)核疫苗研發(fā)已有140年的歷史［2］，目前唯一許可的卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）對(duì)青少年和成年人預(yù)防活動(dòng)性肺結(jié)核和潛伏性結(jié)核病感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的保護(hù)作用卻十分有限［3］。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核病疫苗，尤其是針對(duì)成人的、預(yù)防LTBI 轉(zhuǎn)化TB 的疫苗。

截止到目前，全球正在開(kāi)展臨床試驗(yàn)的結(jié)核病疫苗共有14 個(gè)［4］，根據(jù)其設(shè)計(jì)路線可分為減毒活疫苗、滅活分枝桿菌或提取物疫苗、病毒載體疫苗以及亞單位疫苗。然而這些類(lèi)型的疫苗各有缺點(diǎn)：減毒活疫苗和滅活疫苗存在毒力恢復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)，通常還需要依賴?yán)滏溸\(yùn)輸［5］；病毒載體疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力較弱，且可供選擇的病毒載體有限。而亞單位疫苗由蛋白抗原和佐劑組成，安全性好且容易修飾［6-7］，但因免疫原性弱，所以需要與佐劑聯(lián)合使用［8］。目前，進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的亞單位疫苗包括M72/AS01E、H56：IC31、ID93+GLA-SE、GamTBVac。本文將針對(duì)這四種亞單位疫苗的組成、臨床進(jìn)展及作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的闡述。

1 抗原

研究人員將M.tb不同類(lèi)別抗原作為疫苗開(kāi)發(fā)的靶抗原，包括早期分泌性抗原、毒力相關(guān)抗原、生長(zhǎng)期和休眠期相關(guān)抗原（表1）。培養(yǎng)濾液蛋白（culture filtrate proteins，CFP）分子量低，能被T 細(xì)胞高效識(shí)別、誘導(dǎo)持久的免疫反應(yīng)，如ESAT-6、CFP10［9-11］廣泛應(yīng)用于結(jié)核疫苗；PE/PPE 家族蛋白與M.tb的毒力相關(guān)，影響抗原呈遞和宿主細(xì)胞凋亡［12］，如PPE18、PPE42；Ag85A 和Ag85B 為乙酰/分枝酰轉(zhuǎn)移酶，能刺激T 細(xì)胞增殖產(chǎn)生IFN-γ，也是一類(lèi)免疫原性較強(qiáng)的抗原［13］；M.tb感染人體在缺乏必需的營(yíng)養(yǎng)素時(shí)，轉(zhuǎn)變到無(wú)復(fù)制的“休眠”狀態(tài)，在休眠操縱子（dormancy survival regulator，DosR）的調(diào)節(jié)下表達(dá)DosR 家族蛋白以維持潛伏感染，DosR 家族蛋白中免疫原性較好的如Rv2660、Rv1813［14-15］也是潛在的疫苗開(kāi)發(fā)靶點(diǎn)?？乖侵亟M亞單位疫苗中的重要組分，所以有效保護(hù)性抗原的選擇是疫苗開(kāi)發(fā)成功的重要因素。

表1 結(jié)核疫苗常用抗原Tab.1 Antigens used in tuberculosis vaccines

2 佐劑

佐劑是一種非特異性的免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原聯(lián)合使用時(shí)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類(lèi)型。四種臨床階段的亞單位疫苗分別采用了AS01E、IC31、GLA-SE、CpG ODN 作為佐劑（表2）。疫苗佐劑種類(lèi)豐富，大體可分為免疫調(diào)節(jié)劑與遞送系統(tǒng)，前者包括Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）、NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs）等天然免疫受體［16］，后者包括脂質(zhì)體和乳劑［17］等。病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）屬于免疫調(diào)節(jié)劑類(lèi)佐劑，其受體是包括TLRs、NLRs 在內(nèi)的模式識(shí)別受體，如AS01E 中的活性成分單磷酰脂A（3-O-desacyl-4'-monophosphoryl lipid A，MPLA）、GLA-SE 中的活性成分GLA 均為T(mén)LR4 激動(dòng)劑，IC31 中的活性成分ODN1a、胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸-寡脫氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG ODN）中的活性成分CpG均為T(mén)LR9 激動(dòng)劑。佐劑作為亞單位疫苗的重要組分，開(kāi)發(fā)安全有效的新型疫苗佐劑、拓寬佐劑在疫苗中的應(yīng)用范圍至關(guān)重要。

表2 臨床研究中結(jié)核亞單位疫苗采用的佐劑Tab.2 Adjuvants used in tuberculosis subunit vaccines in clinical studies

3 目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)的亞單位疫苗

亞單位疫苗由抗原聯(lián)合佐劑制成，克服了減毒活疫苗或滅活疫苗相關(guān)的安全問(wèn)題，刪除了全菌體疫苗許多冗余的無(wú)關(guān)抗原，且成分更可控、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的效率更高。下文將對(duì)這四種亞單位疫苗進(jìn)行系統(tǒng)介紹（表3）。

表3 臨床研究中的結(jié)核亞單位疫苗Tab.3 Tuberculosis subunit vaccine in clinical studies

3.1 M72/AS01EM72/AS01E由英國(guó)GSK 公司開(kāi)發(fā)，由高免疫原性的M.tb 蛋白MTB39A、MTB32A 和AS01E佐劑組成，已成功完成Ⅱb 期臨床試驗(yàn)［18-19］。

M72/AS01EⅡb 期數(shù)據(jù)于2018年公布，該試驗(yàn)招募了3 283 名HIV 陰性的成人LTBI 患者，隨訪2.3年后結(jié)果顯示，M72/AS01E組活動(dòng)性肺結(jié)核病發(fā)病率減少了54.0%［19］，首次證明了給LTBI 人群接種疫苗能有效預(yù)防其發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核，但3年隨訪最終結(jié)果顯示［18］，M72/AS01E3年最終保護(hù)率下降到49.7%。M72/AS01E疫苗是安全有效的，疫苗注射相關(guān)不良反應(yīng)輕微。

M72/AS01E的療效是兩種M.tb抗原（MTB39A、MTB32A）和AS01E協(xié)同作用的結(jié)果。其中MTB39A屬PPE 蛋白家族成員，它是維持M.tb胞內(nèi)生存的毒力因子之一；MTB32A為一種絲氨酸蛋白酶，同時(shí)也是CFP 組分之一。AS01E佐劑系統(tǒng)由配體MPLA、QS-21 和脂質(zhì)體組成，MPLA 通過(guò)MyD88 和TRAM/TRIF 途徑刺激TLR4 介導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生；而QS-21 誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ 和IgG2a 抗體的產(chǎn)生［20-21］，M72/AS01E能誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）產(chǎn)生顯著水平的M72特異性T 細(xì)胞因子，包括高水平的Th1 型細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-a 和IL-2）和低水平的IL-17［22］，并且能激活NK 細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性IFN-γ，同時(shí)檢測(cè)到CD8+T 細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3.2 H56：IC31H56：IC31 由SSI 及Valneva 等公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)，其成分包含Ag85B、ESAT-6、Rv2660和IC31 佐劑，目前已完成了Ⅱa 期臨床試驗(yàn)，正在進(jìn)行預(yù)防結(jié)核病復(fù)發(fā)的Ⅱb 期測(cè)試。

H56：IC31 Ⅱa 期臨床數(shù)據(jù)于2019年公布，該試驗(yàn)在南非招募了98 名HIV 陰性、有卡介苗接種史的健康成年人，并對(duì)參與者進(jìn)行了292 天的安全性和免疫原性追蹤，結(jié)果顯示，在M.tb感染和未感染的成年人中，以最低劑量接種兩或三次H56：IC31 疫苗可誘導(dǎo)持久的抗原特異性CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)，并具有良好的安全性和耐受性［23］。

H56：IC31 疫苗的保護(hù)效果與其誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的持久性和功能有關(guān)。H56是由ESAT-6、Ag85B、Rv2660 三個(gè)蛋白組成的融合抗原，它結(jié)合由KLKL5KLK與ODN1a非共價(jià)結(jié)合的佐劑IC31［14］。IC31 中的ODN1a 是TLR9 配體，能誘導(dǎo)抗原特異性的Th1 或Th17 型免疫應(yīng)答；KLKL5KLK 為陽(yáng)離子多肽。ESAT-6 在人類(lèi)和結(jié)核病動(dòng)物模型中具有高度的免疫原性，其在M.TB 感染過(guò)程中顯示出持續(xù)的高表達(dá)［24］；Ag85B 是參與分枝桿菌細(xì)胞壁合成的乙酰/分枝酰轉(zhuǎn)移酶，主要在M.tb感染早期表達(dá)，在慢性感染過(guò)程中低表達(dá)；Rv2660 為M.TB 潛伏相關(guān)蛋白［25］。將休眠期抗原納入疫苗成分，使其成為一種更完備的多階段疫苗，這種策略為疫苗設(shè)計(jì)提供了新思路。

3.3 ID93+GLA-SEID93+GLA-SE 由IDRI 研發(fā)，這種治療性疫苗由Rv1813、Rv2608、Rv3619、Rv3620四種抗原與GLA-SE 佐劑制備而成。

ID93+GLA-SE 已于2021年成功完成了Ⅱa 期臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)在南非招募了HIV 陰性、有BCG接種史并被診斷為藥物敏感型肺結(jié)核的成人患者。結(jié)果顯示，ID93+GLA-SE 誘導(dǎo)了強(qiáng)大的多功能CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG1 和IgG3 亞類(lèi)抗體，因此該疫苗可誘導(dǎo)針對(duì)疫苗抗原的特異性多功能CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)和持久的抗體反應(yīng)［26］。在安全性方面，受試者出現(xiàn)了輕微的硬結(jié)和紅斑等常規(guī)不良反應(yīng)。

ID93+GLA-SE 的療效是四種與毒力（Rv2608、Rv3619 和Rv3620）或潛伏期（Rv1813）相關(guān)的M.tb蛋白與GLA-SE 協(xié)同作用的結(jié)果［27］。ID93 結(jié)合了Rv1813 屬于M.tb潛伏相關(guān)抗原，Rv1813 刺激潛伏感染者外周血后CD4+T 淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ 水平升高，由此推測(cè)其在潛伏感染者機(jī)體免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮一定保護(hù)作用；Rv2608 是一種外膜相關(guān)PPE 蛋白［28-29］；Rv3619 和Rv3620 是M.tb所特有的，在牛分枝桿菌或卡介苗中不存在。這些抗原與GLA-SE 佐劑配制，GLA 為人工合成的六?；|(zhì)A 衍生物；SE 是一種水包油乳劑，用作GLA 的遞送載體。ID93+GLA-SE 的治療效果與增強(qiáng)Th1 型免疫應(yīng)答、促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌清除和減少肺部炎癥有關(guān)［30］。

3.4 GamTBVacGamTBVac 疫苗由俄羅斯衛(wèi)生部研發(fā)，由Ag85A、ESAT6-CFP10 和CpG ODN 佐劑組成。GamTBVac 疫苗已成功于2020年完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)招募了180 名有卡介苗接種史且未感染M.tb的健康成人，結(jié)果顯示其耐受性良好，并誘導(dǎo)了特異性和持久性的Th1 型免疫應(yīng)答和體液免疫反應(yīng)［31］，為其Ⅲ期臨床試驗(yàn)評(píng)估對(duì)結(jié)核病的保護(hù)效果奠定基礎(chǔ)。

GamTBVac 疫苗的療效是兩種分枝桿菌融合抗原和CpG ODN 佐劑協(xié)同作用的結(jié)果?？乖璄SAT6、CFP10 和Ag85A 具有很強(qiáng)的免疫原性和免疫優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于幾代重組亞單位疫苗（H1/IC31，H4/IC31，H56/IC31，H56/CAF01）。這些抗原與CpG ODN 佐劑結(jié)合；CpG ODN 佐劑是人工合成的細(xì)菌DNA 分子，含有硫代磷酸骨架以及未甲基化的CpG 基序，能高效誘導(dǎo)Th1 反應(yīng)、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞作用和IFN-γ 分泌［32］。

4 展望

結(jié)核病是21世紀(jì)最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，開(kāi)發(fā)結(jié)核病疫苗仍然是一個(gè)關(guān)鍵的全球衛(wèi)生優(yōu)先事項(xiàng)。疫苗接種利用獲得性免疫原理，建立有效和持久的免疫記憶，以縮短適應(yīng)性免疫反應(yīng)開(kāi)始的時(shí)間間隔，從而能夠迅速控制M.tb感染［33］。結(jié)核病亞單位疫苗具有良好的安全性、有效性，且應(yīng)用廣泛；然而，目前亞單位疫苗研究依舊面臨許多挑戰(zhàn)：在疫苗設(shè)計(jì)方面，篩選有效的抗原和研發(fā)效率高的佐劑較為困難，且研發(fā)周期長(zhǎng)、需要高費(fèi)用的投入；在疫苗評(píng)價(jià)方面，缺乏合適的動(dòng)物評(píng)估模型和有效的鑒定標(biāo)志物，臨床試驗(yàn)的保護(hù)率與不同人群抗M.tb感染能力存在異質(zhì)性有關(guān)。針對(duì)上述問(wèn)題，后續(xù)研究將主要聚焦于篩選有效的抗原（或組合）與高效的佐劑、建立穩(wěn)定且重復(fù)性高的動(dòng)物評(píng)估模型以及統(tǒng)一的評(píng)價(jià)指標(biāo)等。

本文對(duì)臨床研究中的亞單位疫苗應(yīng)用狀況進(jìn)行了較為系統(tǒng)的總結(jié)，為合理選擇結(jié)核亞單位疫苗抗原和佐劑提供參考。此外，亞單位疫苗聯(lián)合藥物輔助治療結(jié)核病或者作為BCG 療效的補(bǔ)充也是未來(lái)結(jié)核亞單位疫苗應(yīng)用重要的方向［34］。隨著M.tb與宿主免疫之間的深入研究、新的抗原靶標(biāo)不斷被發(fā)掘、新佐劑不斷被發(fā)現(xiàn)，未來(lái)會(huì)出現(xiàn)更多安全有效的亞單位疫苗來(lái)滿足人類(lèi)的需求。