堪薩斯分枝桿菌鑒定及耐藥機制研究進展

任汝顏 于霞 黃海榮

首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院（北京 101149）

非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）是指除結(jié)核分枝桿菌復合群（mycobacterium tuberculosis complex，MTC）和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌的統(tǒng)稱。近年來，NTM 病的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢，其中，堪薩斯分枝桿菌（mycobacterium kansasii，M.kansasii）是臨床常被分離到的NTM 菌種之一?？八_斯分枝桿菌感染后的臨床表現(xiàn)與結(jié)核病不易區(qū)分，且對常用藥物的耐藥日趨嚴重，給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。本文就堪薩斯分枝桿菌的鑒定技術(shù)、主要治療方案及多種藥物的耐藥機制予以綜述。

1 堪薩斯分枝桿菌的亞型組成

堪薩斯分枝桿菌屬于慢生長分枝桿菌，適宜生長溫度范圍為32℃～42℃。由于細胞壁疏水性的差異，分離菌株的菌落可呈現(xiàn)平坦或凸起、光滑或粗糙等不同的形態(tài)，有時可呈顆粒狀［1］?？八_斯分枝桿菌屬光產(chǎn)色菌，抗酸染色陽性，對硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生長試驗、過氧化氫酶、硝酸鹽還原試驗、吐溫-80 水解試驗和尿素水解試驗均為陽性。基于以上生長特征和生化特性的生化實驗為主的鑒定技術(shù)由于操作復雜、耗時且結(jié)果不準確，現(xiàn)已基本被棄用，僅對硝基苯甲酸選擇性培養(yǎng)基法仍用于NTM 的初步鑒定。

目前，同源序列比對法是分枝桿菌菌種鑒定的主要方法。臨床常用的分枝桿菌菌種鑒定標識主要包括16S rRNA 編碼序列，16S-23S rDNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS），RNA 聚合酶的β 亞基（β-subunit of RNA polymerase，rpoB）和熱休克蛋白65（65-kDa heat shock protein，hsp65）編碼基因。其中，16S rRNA 編碼序列無法區(qū)分堪薩斯分枝桿菌和與其同屬于堪薩斯分枝桿菌復合群的胃分枝桿菌，不能單獨應(yīng)用于堪薩斯分枝桿菌的鑒定［2］。ITS 序列依菌種不同其堿基排列順序及長度變異較大，含數(shù)個高度可變的菌種特異序列，其多態(tài)性高于16S rRNA 編碼序列，能將堪薩斯分枝桿菌與胃分枝桿菌相鑒別［3］。隨著分子流行病學技術(shù)的發(fā)展，hsp65PCR-REA（restriction enzyme analysis）技術(shù)進一步將堪薩斯分枝桿菌分成7 個亞型（Ⅰ-Ⅶ型），其中亞型Ⅰ是引起人類疾病的最常見亞型，Ⅱ型較多出現(xiàn)在人類免疫缺陷病毒感染的患者中，其余5 個亞型則通常從環(huán)境中分離獲得［4］。最近，基于全基因組平均核苷酸同一性（genome-wide average nucleotide identity，gANI）可以更精確地將堪薩斯分枝桿菌分成六個亞型，分別是M.kansasii（前亞型Ⅰ），M.persicum（Ⅱ），M.pseudokansasii（Ⅲ），M.ostraviense（Ⅳ），M.innocens（Ⅴ），M.attenuatum（Ⅵ）。大多數(shù)與疾病相關(guān)的菌株屬于Ⅰ型，而其他分型的菌株常與環(huán)境來源有關(guān)［5-6］。此外，BAKU?A 等［7］人基于編碼熱不穩(wěn)定延伸因子（thermo-unstable elongation factor，EF-Tu）的tuf基因序列分析，開發(fā)了一種快速的堪薩斯分枝桿菌亞型分型新方法。該研究納入15 株標準菌株和80 株臨床分離株，以hsp65、rpoB和ITS 測序結(jié)果作為對照，單用tuf鑒定堪薩斯分枝桿菌與對照方法的一致性為100%。由于tuf在堪薩斯分枝桿菌臨床分離株中的序列相似性范圍為93%～98%，tuf可進一步將堪薩斯分枝桿菌分成六個亞型，不同型之間核苷酸差異從14 個（亞型Ⅱ和亞型Ⅳ）到46 個（亞型Ⅲ和亞型Ⅵ）不等。在不同的堪薩斯分枝桿菌亞型中，大多數(shù)感染是由亞型Ⅰ所致，人類免疫缺陷病毒感染的患者常見亞型Ⅱ，其他亞型通常不致病，均從環(huán)境中獲得［8］。不同亞型對不同治療藥物的敏感性存在差異。在BAKU?A 等［9］的研究中，亞型Ⅰ菌株和亞型Ⅱ菌株對不同藥物的最低抑菌濃度（minimal inhibition concentration，MIC）、MIC50和MIC90存在明顯差異。上述結(jié)果表明，對堪薩斯分枝桿菌的鑒定并精確分型到亞型有十分重要的臨床用藥指導意義，不僅有助于流行病學研究，同時也為疾病治療選藥方案的制定提供重要參考。

2 治療堪薩斯分枝桿病的標準化療方案

美國胸科學會/美國感染性疾病學會指南推薦的抗堪薩斯分枝桿菌的一線治療方案包括異煙肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampin，RIF）和乙胺丁醇（thambutol，EMB）等三種一線抗結(jié)核藥物，療程為18 個月或培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰后12 個月［4］?？八_斯分枝桿菌是唯一一個相關(guān)疾病以一線抗結(jié)核藥物治療為主的NTM。從獲得的數(shù)據(jù)來看，含有RIF 的方案療效好，治療失敗率極低（1.1%），長期復發(fā)率低（＜1%）［1］。臨床實驗室標準化研究所（CLSI）指南建議：對未經(jīng)治療的堪薩斯分枝桿菌，僅需進行RIF 藥敏試驗，對于RIF 耐藥株，需進行以下藥物敏感性檢測：INH、阿米卡星（amikacin，AMK）、鏈霉素（streptomycin，STR）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、莫西沙星（moxifloxacin，MXF）、克拉霉素（clarithromycin，CLR）、利福布?。╮ifabutin，RFB）和磺胺甲惡唑（cotrimoxazole，SXT）。對于存在RIF耐藥的堪薩斯分枝桿菌病，目前推薦使用大環(huán)內(nèi)酯類［CLR 或阿奇霉素（azithromycin，AZI）］、氟喹諾酮類（fluoroquinoones，F(xiàn)Q）、SXT 或STR 三藥聯(lián)合治療方案［4］。該方案排除INH 和EMB 是因為有研究表明INH 或EMB 的耐藥株通常也出現(xiàn)RIF耐藥［10］。

3 常用抗堪薩斯分枝桿菌藥物的耐藥機制研究

堪薩斯分枝桿菌病在常見的NTM 病中屬于治愈率最高的一種，然而越來越多耐藥的堪薩斯分枝桿菌的分離鑒定提示需要關(guān)注其耐藥的問題。雖然堪薩斯分枝桿菌對不同藥物的耐藥機制與結(jié)核分枝桿菌的耐藥機制類似，但由于不同菌種同源序列的差異，也展現(xiàn)出一些菌種特異性的特點。

3.1 異煙肼INH 作為一種前藥進入MTB 后首先被過氧化氫-過氧化物酶（catalase—peroxidase，katG）還原成能夠結(jié)合NAD/NADH 的異煙肼酰基自由基，結(jié)合生成的INH-NAD 加合物抑制烯?；d體蛋白InhA 形成，從而阻斷細胞壁分枝菌酸的合成而發(fā)揮殺菌作用［11］。自20世紀50年代以來，INH 已作為一線藥物用于結(jié)核病治療和預防，而堪薩斯分枝桿菌對INH 的MIC 比結(jié)核分枝桿菌的MIC（MIC ≤0.02 μg/mL）高出100 多倍，但依然低于INH 最高血藥濃度，這也是INH 可作為堪薩斯分枝桿菌一線治療藥物的主要原因［12］。為闡明不同分枝桿菌對INH 敏感性差異的原因，REINGEWERTZ 等［13］將對INH 敏感的牛分枝桿菌的katG（記做KatGbov）分別轉(zhuǎn)入海分枝桿菌（M.marinum；記做M.marinumKatG-bov）和鳥副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis，MAP；記做MAPKaG-bov），分別對照其野生株（M.marinumcherry 和WT.MAP），顯示其對INH 的敏感性均提高了20～30 倍。為了排除katG高表達的作用，隨后又克隆了海分枝桿菌的katG蛋白（KatGmar）轉(zhuǎn)入其野生株，使katG高表達，此時菌株對INH 的敏感性升高不顯著。上述研究表明使分枝桿菌對INH 敏感的原因并非katG蛋白高表達，而是牛分枝桿菌中katG蛋白的作用。通過對不同分枝桿菌的katG進行序列比對，發(fā)現(xiàn)katG在非結(jié)核分枝桿菌間高度保守，而與結(jié)核分枝桿菌差別較大。同時，等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）顯示KatGbov與INH 的結(jié)合能力要高于KatGavp，而KatGmar不能與INH 結(jié)合。酶活性分析表明只有KatGbov能夠?qū)嵸|(zhì)性地催化INH-NAD 加合物的形成。由于該研究所涉及分枝桿菌種類較少，有必要納入更多的對INH 不同敏感性的分枝桿菌進行研究，如將INH 作為一線用藥的堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌，以及對INH 敏感的結(jié)核分枝桿菌，對比并進行更全面深入的研究。

關(guān)于在堪薩斯分枝桿菌中INH 耐藥與基因突變也有零星報道。KHOSRAVI 等［14］發(fā)現(xiàn)INH 耐藥的堪薩斯分枝桿菌中，katG的突變率為67.7%～95%。然而ZOFIA BAKU?A等［9］選擇了對INH 敏感性存在差異的堪薩斯分枝桿菌菌株，包括5 株MIC=1 μg/mL 和5 株MIC=4 μg/mL 的菌株，通過序列比較發(fā)現(xiàn)所有的10 個分離株具有相同的inhA和katG序列，并未發(fā)現(xiàn)INH 耐藥與inhA和katG突變相關(guān)。因此，在堪薩斯分枝桿菌中INH 耐藥是否與inhA和katG突變村上相關(guān)性尚未有定論，是否存在其他耐藥機制也還屬未知，有待更多研究加以證實。

3.2 利福平利福霉素（如RFB，RIF 等）通過抑制細菌的RNA 合成啟動發(fā)揮作用，主要作用機制是通過與原核生物的DNA 依賴性RNA 聚合酶結(jié)合，抑制該酶的活性發(fā)揮抗菌作用。RNA 聚合酶的催化中心β亞基是利福霉素的結(jié)合位點。其編碼基因rpoB突變與利福霉素耐藥相關(guān)。KLEIN 等［15］在6 株RIF 耐藥的堪薩斯分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)rpoB基因序列均發(fā)生突變。其中，4株檢測到S531L 突變，這也是對RIF 耐藥的MTB 和麻風分枝桿菌最常見的突變形式；1 株出現(xiàn)Q513L 突變，1 株為H526Y突變。YOSHIDA 等［16］對314 株堪薩斯分枝桿菌的rpoB基因序列分析，發(fā)現(xiàn)3 株RIF 耐藥菌株的rpoB基因513 和516 位密碼子上突變。由此可見，堪薩斯分枝桿菌對RIF 耐藥主要是由rpoB突變造成，對堪薩斯分枝桿菌進行基于rpoB的分子診斷可以快速檢測其對RIF 敏感性，有利于臨床制定合理的化療方案。

3.3 乙胺丁醇EMB 是一個抑菌藥，對于生長繁殖期的結(jié)核分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌均有較好的抑菌效果，對靜止期的細菌幾乎無作用，且在中性pH值中的作用最強。EMB對分枝桿菌的直接作用是破壞細胞壁合成，特別是抑制阿拉伯半乳聚糖合成，并且在一定程度上抑制阿拉伯甘露聚糖合成。embB基因編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶是細胞壁合成的關(guān)鍵，該基因突變會導致大部分堪薩斯分枝桿菌對EMB 產(chǎn)生獲得性耐藥［17］。QUAN［18］檢測了85 株堪薩斯分枝桿菌對EMB 的敏感性，耐藥率高達97.6%，即使非耐藥菌株的MIC 也處于耐藥臨界值附近，所有檢測菌株embB都存在Met306Ile、Gly406Pro 和Pro423Ie，提示該基因突變可能與其對EMB 敏感度下降有關(guān)。

3.4 大環(huán)內(nèi)酯類大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物通過與細菌核糖體的23S rRNA 結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽、移位和肽鏈延長，并最終抑制細菌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮抗菌作用［19］。BAKU?A 等［9］的研究中，85 株堪薩斯分枝桿菌臨床分離株對CLR 耐藥率為1.2%（1/85），唯一的耐藥菌株中檢測到rrl基因A2266C 突變。李燕明等［20］對78 株堪薩斯分枝桿菌經(jīng)PRA 分析，共得到4 個不同的亞型，即亞型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。其中亞型Ⅰ最為常見（56/78，71.8%）。亞型Ⅰ對CLR的耐藥率明顯高于其他亞型（26.8%；vs 4.5%；P=0.031）。在16 株對CLR 耐藥的堪薩斯分枝桿菌中，有9（56.2%）株CLR 耐藥分離株與23S rRNA 基因突變有關(guān)。以上數(shù)據(jù)提示堪薩斯分枝桿菌對CLR 耐藥可能還存在其它機制，有待于進一步研究。

3.5 氨基糖苷類氨基糖苷類抗生素通過與核糖體A 位點附近區(qū)域結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮抗菌作用。氨基糖苷類抗生素對堪薩斯分枝桿菌有較好的體外抑菌活性。BAKU?A［9］分析了5 株堪薩斯分枝桿菌分離株（亞型Ⅰ）對STR 的體外敏感性差異與編碼30S 核糖體蛋白的rpsL基因和rrs基因序列差異的相關(guān)性：與低MIC 分離株（2 μg/mL）相比，MIC 值最高的堪薩斯分枝桿菌（＞64 μg/mL）存在均rpsLA128G（K42R）突變。這提示堪薩斯分枝桿菌與MTB 一樣，STR 獲得性耐藥的產(chǎn)生由于rpsL基因突變所導致。

以上研究數(shù)據(jù)顯示堪薩斯分枝桿菌對常用抗結(jié)核藥物耐藥可能與相關(guān)耐藥基因的突變有關(guān)。然而，在剛剛發(fā)表的一項來自GUO 等［21］的研究中，對60 株分子分型均為Ⅰ型的臨床分離株的常見治療藥物的藥敏試驗及相關(guān)耐藥基因的序列分析結(jié)果顯示：堪薩斯分枝桿菌均對RFB 敏感，對RIF、AMK、MXF 和LZD 的敏感率分別為80.0%、90.0%、88.3%和91.7%，但對CIP 和EMB 的耐藥率很高，分別達到73.3%和76.7%；與結(jié)核分枝桿菌H37Rv 相比較，在所有堪薩斯分枝桿菌分離株中觀察到12 個embCA突變，且所有分離株（不論耐藥或敏感）均具有相同的rpoB、inhA、katG、rrl、rrs、rpsL、gyrA和gyrB基因序列。這項最新的研究結(jié)果表明：堪薩斯分枝桿菌的耐藥機制不一定與上述已知的耐藥基因突變有關(guān)。總體而言，關(guān)于堪薩斯分枝桿菌的耐藥機制的研究數(shù)量有限，因此還缺乏得出可信結(jié)論的論據(jù)。亟待在這一領(lǐng)域開展更多工作，才能實現(xiàn)對堪薩斯分枝桿菌耐藥機制有更深入的了解。

4 結(jié)語

近年來，堪薩斯分枝桿菌感染呈現(xiàn)上升趨勢，準確快速鑒定堪薩斯分枝桿菌并對分型做出判斷，有助于做出準確的疾病診斷，并對可用的藥物有一定提示作用。而充分了解堪薩斯分枝桿菌對其常規(guī)化療藥物的耐藥機制，可為建立快速的堪薩斯分枝桿菌分子藥敏診斷方法提供數(shù)據(jù)支持，從而更好的指導堪薩斯分枝桿菌病的治療。