腫瘤出芽預(yù)測ⅠA2-ⅠB1期宮頸鱗狀細胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的意義

盧善明 羅文娟 劉堃 薛祥興 謝玉珍

梅州市人民醫(yī)院病理科（廣東梅州 514031）

盆腔淋巴結(jié)清掃是早期宮頸癌（ⅠA1 期除外）的標準治療?？墒?，ⅠA2、ⅠB1 期宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率只有0% ～4.8%和13.7% ～13.9%［1-2］。因此，相當多早期宮頸癌患者承受了不必要的盆腔淋巴結(jié)清掃。早期宮頸癌具有較高的前哨淋巴結(jié)檢出率、敏感度和陰性預(yù)測值［3-4］。對擬行保留生育手術(shù)的患者，手術(shù)中可以聯(lián)合應(yīng)用前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)（SLNB）。雖然NCCN 和FIGO 都推薦早期宮頸癌使用前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)，但前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)存在一定的操作難度，臨床并未廣泛開展。

腫瘤出芽（tumor budding，TB）是指腫瘤浸潤前分散在間質(zhì)的單個瘤細胞或小于等于4 個細胞的瘤細胞簇［5］。腫瘤出芽是pT1 期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因素，已作為結(jié)直腸惡性息肉是否需要追加手術(shù)的指標。ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，而且大部分患者適合保留生育功能，探討腫瘤出芽能否作為ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測因素具有臨床應(yīng)用意義。目前有少量文獻報道了腫瘤出芽與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)性，而關(guān)于其在早期宮頸鱗癌方面的研究有限。本研究收集行盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的FIGO（2009）IA2-IB1 期宮頸鱗狀細胞癌患者的資料，分析腫瘤出芽預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值，以期為早期宮頸鱗癌的個體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集108 例FIGO（2009）ⅠA2-ⅠB1 期行宮頸癌根治術(shù)的宮頸鱗狀細胞癌臨床病理資料，所有患者術(shù)前未行新輔助放療或化療，無其他惡性腫瘤病史。排除標準為炎癥細胞浸潤明顯致無法準確計數(shù)瘤芽的病例。

1.2 腫瘤出芽評估方法 調(diào)取病理存檔蠟塊及切片，復閱病理切片，篩選出腫瘤出芽最豐富的切片用于分析。腫瘤出芽評估方法參照國際腫瘤出芽共識大會（ITBCC）2016 的建議［5］，并稍作計數(shù)面積調(diào)整。在10 倍目鏡下觀察腫瘤浸潤前沿區(qū)篩選出瘤芽熱點，在20 倍目鏡下（視野為0.95 mm2）計數(shù)單個視野最高瘤芽數(shù)量。分別由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師進行計數(shù)，分級不一致的病例共同鏡下討論決定。腫瘤出芽分級：0 ～4 個為低級別腫瘤出芽，≥5 個為高級別腫瘤出芽。

1.3 免疫組化 腫瘤出芽最豐富的蠟塊行4 μm切片2 張，1 張用于HE 染色，1 張用于免疫組化Pan-CK 染色。免疫組化采用EnVision 二步法?？贵wPan-CK 購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.4 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件為SPSS 22.0，腫瘤出芽與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用χ2檢驗，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險因素的分析采用logsitic 多因素回歸。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征 108例ⅠA2-ⅠB1期宮頸鱗癌中，患者中位年齡48 歲（28 ～74），高中分化92 例（85%），低分化16例（15%）。腫瘤浸潤宮頸淺肌層33例（31%），中肌層12例（11%），深肌層63例（58%）。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例（49%），脈管癌栓65例（60%）。

2.2 腫瘤出芽與臨床病理特點的相關(guān)性 采用HE 染色方法評估腫瘤出芽，腫瘤出芽中位數(shù)為4（0 ～20）個，低級別腫瘤出芽56 例（52%），高級別腫瘤出芽52 例（48%），見圖1。腫瘤出芽與患者年齡（P= 0.568）、腫瘤浸潤深度（P= 0.515）、脈管癌栓（P= 0.287）均差異無統(tǒng)計學意義（表1）。腫瘤出芽與腫瘤分化顯著性相關(guān)（P= 0.004），低分化組比高中分化組更易出現(xiàn)高級別瘤芽（13∕16vs.39∕92）。高級別瘤芽組趨向比低級別組更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（30∕52vs.23∕56），但兩組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.084，表1）。

圖1 HE 染色觀察早期宮頸鱗狀細胞癌腫瘤出芽（×200）Fig.1 HE staining to observe TB in the early-stage cervical CSCC（×200）

表1 腫瘤出芽與宮頸鱗癌臨床病理特點的相關(guān)性Tab.1 Correlation between TB and clinicopathological features of CSCC

2.3 臨床病理特點與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 高、低齡組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為38%（20∕53）和60%（33∕55），低齡組患者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P= 0.021）。高中分化組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為43%（40∕92），低分化組為81%（13∕16），兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P= 0.005）。腫瘤浸潤深度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著性相關(guān)（P ＜0.001），浸潤深肌層組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為65%（41∕63），浸潤淺中肌層為27%（12∕45）。脈管癌栓組和無癌栓組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為62%（40∕65）和30%（13∕43），脈管癌栓組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯升高（P= 0.001）（表2）。多因素分析顯示患者年齡（HR 3.470，95%CI：1.402 ～8.586）、腫瘤 分化（HR：5.090，95%CI：1.181 ～21.936）、腫瘤浸潤深度（HR：5.489，95%CI：2.190 ～13.759）是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因素（表2）。

表2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸鱗癌臨床病理特點的相關(guān)性Tab.2 Correlation between lymph node metastasis and clinicopathological features of CSCC

2.4 HE 與免疫組化染色對腫瘤出芽評估的一致性比較 為評估免疫組化Pan-CK 染色和HE 染色評估腫瘤出芽分級的一致性，33例標本平行進行了免疫組化Pan-CK 染色（圖2）。HE 染色和免疫組化Pan-CK染色腫瘤出芽分級顯著相關(guān)（P ＜0.001），有6 例分級不一致，一致率為81.8%（Kappa=0.629），見表3。

圖2 免疫組化Pan-CK 染色觀察早期宮頸鱗狀細胞癌腫瘤出芽（×100）Fig.2 Pan-CK immunostaining to observe TB in the earlystage CSCC（×100）

表3 免疫組化Pan-CK 染色和HE 染色評估腫瘤出芽的一致性Tab.3 Agreement of bud counts assessed using HE and Pan-CK immunostaining

3 討論

近年來，宮頸癌發(fā)病年齡趨向年輕化。隨著宮頸癌篩查的普及，越來越多的宮頸癌能早期診斷。許多早期宮頸癌患者是育齡期患者，有保留生育功能的需求。大部分ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌符合保留生育功能指征，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低，評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險對避免不必要的系統(tǒng)性盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)非常必要，尤其對有保留生育需求患者手術(shù)方式的選擇具有重要臨床意義。尋找預(yù)測早期宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法或標志物一直是臨床關(guān)注的問題［6-8］。

腫瘤出芽與瘤細胞間粘附性喪失和瘤細胞的遷移有關(guān)，是腫瘤細胞呈上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的組織形態(tài)學表現(xiàn)。越來越多研究顯示腫瘤出芽與腸癌、口腔鱗癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌等多種腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)［9-12］。腫瘤出芽的細胞常保留上皮的形態(tài)特點，細胞呈圓形、卵圓形或多角形，胞質(zhì)較豐富、紅染。研究顯示在多種腫瘤不同觀察者間計數(shù)腫瘤出芽具有較高的可重復性。與大腸腺癌相比，宮頸鱗狀細胞癌腫瘤出芽的準確評估具有一定的難度，影響因素主要有：（1）發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的瘤芽細胞則較難與間質(zhì)內(nèi)的纖維母細胞鑒別；（2）宮頸癌組織因伴有HPV 感染等原因，間質(zhì)內(nèi)常伴較多炎癥細胞浸潤，干擾了瘤芽的識別；（3）腫瘤細胞巢壞死導致腫瘤細胞的脫落可誤判為瘤芽。本研究探討了HE 染色和免疫組化Pan-CK 染色評估腫瘤出芽分級的一致性。HE 染色和免疫組化Pan-CK染色評估瘤芽分級的一致性為81.8%，這與本課題組在另一組宮頸鱗癌樣品中的研究結(jié)果較相似［13］。宮頸鱗癌常伴明顯炎癥細胞浸潤，免疫組化Pan-CK 染色有助于腫瘤細胞的識別，尤其是單個瘤芽細胞。雖然免疫組化Pan-CK 染色后瘤芽計數(shù)更為容易，提高了觀察間的可重復性，但是脫離癌巢的凋亡、壞死的腫瘤細胞及碎片也呈Pan-CK染色陽性，可誤判為瘤芽。

關(guān)于腫瘤出芽在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后方面的研究，可見少量文獻報道［14-19］。由于數(shù)據(jù)有限，未能就宮頸癌的高瘤芽閾值達成共識。本研究參照國際腫瘤出芽共識大會（ITBCC）2016 的建議［5］，把1 個20 倍物鏡視野內(nèi)（0.95 mm2）瘤芽≥5個作為高瘤芽標準。顯示高瘤芽組趨向比低級別組更易發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但兩組差異未達統(tǒng)計學意義（P= 0.084）。HUANG 等［15］采用與本研究一致的高瘤芽閾值，行免疫組化Pan-CK 染色后再行腫瘤出芽計數(shù)。對634 例IA2-IIA 期宮頸癌研究顯示，高瘤芽宮頸癌復發(fā)風險增加并與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高瘤組無疾病生存率下降。CHONG 等［16］把瘤芽≥3∕HPF（20 ×）作為高瘤芽閾值，宮頸癌腫瘤浸潤前沿的瘤芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān)，但是宮頸癌復發(fā)的獨立預(yù)測因素。研究結(jié)果的不一致，可能與瘤芽評估方法和病例的臨床分期不一致有關(guān)。

宮頸癌不同區(qū)域的腫瘤出芽活性具有異質(zhì)性，增加觀察范圍可能更能客觀評估腫瘤出芽活性。JESINGHAUS 等［17］把瘤芽≥15∕10HPF（40 ×）作為高腫瘤出芽閾值，分析了247 例宮頸癌腫瘤出芽的臨床病理意義，發(fā)現(xiàn)在測試隊列高瘤芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān)，而在驗證隊列兩者顯著性相關(guān)。ZARE 等［18］和SHI 等［19］分別在94 例宮頸鱗癌和398 例宮頸管腺癌中再次驗證了JESINGHAUS等［17］的研究結(jié)果，顯示高瘤芽腫瘤更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。SATABONGKOCH 等［20］也采用一樣的高瘤芽閾值研究了129 例IB-IIA 期早期宮頸腺癌的腫瘤出芽情況，發(fā)現(xiàn)高瘤芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。雖然計數(shù)10HPF 瘤芽數(shù)量可能會增加病理醫(yī)生的工作量，但這些研究顯示把瘤芽≥15∕10HPF（40×）作為高腫瘤出芽閾值得出的研究結(jié)果較為一致。該瘤芽評估方法在預(yù)測ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值需要進一步探討。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響早期宮頸癌不良預(yù)后的最重要因素之一。本研究單因素分析顯示傳統(tǒng)不良病理因素如患者年齡、腫瘤分化、脈管癌栓、浸潤深度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著性相關(guān)。多因素分析顯示只有患者年齡、腫瘤分化和腫瘤浸潤深度是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因素。CHONG 等［16］報道脈管癌栓、腫瘤浸潤深度與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。FERRANDINA 等［21］探討了463 例ⅠA2-ⅠB1∕ⅡA1宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險因素，單因數(shù)和多因數(shù)分析均顯示腫瘤大小、分化和脈管癌栓均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著性相關(guān)。因此，在宮頸錐切標本評估傳統(tǒng)不良病理因素如腫瘤分化、浸潤深度和脈管癌栓等有助于評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險。

本研究不足之處是不少病例炎癥細胞浸潤明顯，瘤芽準確計數(shù)有一定困難，其次本研究是回顧性研究。需要擴大研究隊列和優(yōu)化瘤芽評估方法來進一步驗證腫瘤出芽在預(yù)測ⅠA2-ⅠB1 期宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用，結(jié)合傳統(tǒng)病理參數(shù)如組織學分級、脈管癌栓、浸潤深度等探討淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測模型。關(guān)于腫瘤出芽的評估方法、高瘤芽閾值的確定、能否作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的獨立預(yù)測因素、是否應(yīng)體現(xiàn)在病理報告等問題仍有待更多的研究。