miR-223調(diào)控NLRP3∕Caspase-1通路在氯胺酮誘導(dǎo)發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元焦亡中的作用

張洪江 李樹霞 翁洪亮

臨沂市中心醫(yī)院1麻醉科，2病理科（山東臨沂 276400）

氯胺酮作為N-甲基-D-天冬氨酸受體的非競爭性阻斷劑，可抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖，造成大腦神經(jīng)元變性與凋亡［1］。有研究表明氯胺酮能夠通過激活NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（nod-like receptor pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）∕含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）途徑誘導(dǎo)海馬細(xì)胞凋亡［2］。NLRP3∕Caspase-1 通路其激活可誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。微小RNA-233（miR-223）參與未成熟神經(jīng)元的分化，并可通過調(diào)控谷氨酸受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)miR-223 可通過抑制NLRP3 表達(dá)來抑制熱性驚厥大鼠海馬組織NLRP3∕Caspase-1信號通路的激活，從而抑制神經(jīng)元凋亡［4］。本研究意在探究miR-223 是否可通過調(diào)控NLRP3∕Caspase-1 通路改善氯胺酮誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元焦亡，以期為氯胺酮誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的治療機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 福建醫(yī)科大學(xué)所購買的7日齡雄性SPF 級SD 大鼠50 只，許可證：SCXK（閩）2016-0002，泉城省實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后（光照12 h∕d），于試驗前夕進(jìn)行禁食（12 h）。

1.2 主要試劑 HRP-IgG抗體、兔抗NLRP3、β-actin、GSDMD-N 抗體（貨號：ab6721、ab214185、ab8227、ab215203，Abcam）；兔抗cleaved Caspase-1 抗體（貨號：AF4022，Affinity Biosciences）；白介素18（Interleukin 18，IL-18）、白介素1β（Interleukin 1β，IL-1β）試劑盒（貨號：SEKH-0028、SEKR-0002，北京索萊寶科技有限公司）；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)ZF-288（上海金鵬分析儀器有限公司）；Bio-Rad 伯樂CFX Connect 熒光定量PCR（上海土森視覺科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組與處理 大鼠分為對照組、氯胺酮組、agomir-NC 組、agomir-223 組、agomir-223+BAY11-7082 組（10 μmol∕L NLRP3 抑制劑BAY11-7082）［5］，10只∕組。除對照組外大鼠腹腔注射氯胺酮（80 mg∕kg）后，左側(cè)側(cè)腦室海馬區(qū)注射生理鹽水（4 μL），agomir-223+BAY11-7082 組并注射抑制劑，對照組大鼠腹腔及左側(cè)側(cè)腦室海馬區(qū)均注射等量生理鹽水［6］。

1.3.2 空間探索實驗 平臺設(shè)于第三象限，大鼠面朝池壁于第一象限下水，記錄60 s 內(nèi)大鼠尋找到平臺的時間及軌跡，為期5 d 訓(xùn)練（1 次∕d）。于第6 d 撤掉平臺，記錄大鼠60 s 內(nèi)潛伏期、第三象限停留時間及穿越次數(shù)，n=10。

1.3.3 HE 染色 空間探索實驗結(jié)束后取大鼠（5 只）海馬組織浸泡于4%多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋后連續(xù)進(jìn)行切片（4 μm），再根據(jù)HE 染色試劑盒進(jìn)行染色，脫水、封片后光鏡下觀察。

1.3.4 qRT-PCR 檢測大鼠海馬組織中miR-223 表達(dá)水平 取剩余5 只大鼠分離出海馬組織，一部分提取總RNA，檢測其純度和濃度，2-ΔΔCt計算miR-223 表達(dá)，n= 5，另兩部分分別用于ELISA 實驗及Western blot 實驗。

1.3.5 TUNEL 染色 石蠟切片孵育后進(jìn)行DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封片，光鏡下選取5 個視野觀察并拍照（n= 5），細(xì)胞計數(shù)（凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色），凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）（%）=（凋亡細(xì)胞∕總細(xì)胞）×100%。

1.3.6 ELISA 檢測大鼠海馬組織中IL-1β 及IL-18水平 ELISA 法測定各組1.3.4 所得海馬組織中IL-1β 及IL-18 水平（n=5）。

1.3.7 Western blot 檢測大鼠海馬組織中NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 的表達(dá)情況 在1.3.3所得海馬組織中加入裂解液，根據(jù)BCA法對蛋白濃度進(jìn)行定量，蛋白樣品（30 μg∕孔）加入SDSPAGE凝膠中進(jìn)行垂直電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行牛血清白蛋白封閉（5%），孵育兔抗NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N、β-actin（1∶1 000）抗體過夜（4℃）后孵育二抗（1∶1 000）2 h，加入ECL 顯影液后在蛋白凝膠成像儀中顯影觀察，Image J 分析蛋白條帶灰度值并計算含量（n=5）。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 18.0 對所有計量資料分析處理，以（）表示，ONE-WAY ANOVA 分析進(jìn)行多組間計量資料比較，進(jìn)一步兩兩比較使用SNK-q檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬組織中miR-223 表達(dá)水平 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬中miR-223 水平降低（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組miR-223 水平增加（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠海馬組織中miR-223 表達(dá)水平Tab.1 Expression level of miR-223 in rat hippocampus±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

分組對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值miR-223 1.00±0.04 0.36±0.05a 0.35±0.04a 0.87±0.10abc 0.86±0.08abc 107.998＜0.001

2.2 miR-223 對大鼠認(rèn)知功能的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠潛伏期增加，穿越平臺次數(shù)及第三象限停留時間占比降低（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組潛伏期降低，穿越平臺次數(shù)及第三象限停留時間占比增加（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組潛伏期降低，穿越平臺次數(shù)及第三象限停留時間占比增加（P＜0.05），見表2。

表2 miR-223 對大鼠認(rèn)知功能的影響Tab.2 Effect of miR-223 on cognitive function in rats ±s

表2 miR-223 對大鼠認(rèn)知功能的影響Tab.2 Effect of miR-223 on cognitive function in rats ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

分組對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值潛伏期（s）9.41±2.01 45.76±12.38a 43.75±11.40a 20.08±5.32abc 12.06±3.11abcd 46.500＜0.001穿越平臺次數(shù)（次）3.52±0.34 1.01±0.32a 1.05±0.34a 2.29±0.40abc 2.99±0.26abcd 113.803＜0.001第三象限停留時間占比（%）33.52±4.85 11.24±3.90a 12.15±2.97a 21.25±4.38abc 29.22±3.02abcd 65.390＜0.001

2.3 大鼠海馬組織病理學(xué)觀察 對照組大鼠海馬組織神經(jīng)元排列整齊、結(jié)構(gòu)完整、核膜核仁清晰可見；氯胺酮組大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)變性壞死現(xiàn)象、細(xì)胞間隙增加、間質(zhì)與膠質(zhì)細(xì)胞腫脹明顯；與氯胺酮組相比，agomir-NC 組大鼠海馬組織病理學(xué)程度無顯著變化，agomir-223 組上述現(xiàn)象得到改善；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組大鼠海馬神經(jīng)元神經(jīng)元細(xì)胞得到進(jìn)一步改善，見圖1。

圖1 大鼠海馬組織病理學(xué)觀察（×200）Fig.1 Histopathological observation of rat hippocampus（×200）

2.4 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬神經(jīng)元AI增加（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組AI降低（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組AI 降低（P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響（×200）Fig.2 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats

表3 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響Tab.3 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats ±s

表3 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響Tab.3 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

分組對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值A(chǔ)I（%）3.24±0.26 38.46±12.42a 36.12±10.75a 20.48±2.79abc 10.70±1.51abcd 21.255＜0.001

2.5 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬中IL-18、IL-1β水平的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬中IL-18、IL-1β 水平增加（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組IL-18、IL-1β 水平降低（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組IL-18、IL-1β 水平降低（P＜0.05），見表4。

表4 miR-223過表達(dá)對大鼠海馬中IL-1β及IL-18水平的影響Tab.4 Effects of miR-223 overexpression on the levels of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus ±s

表4 miR-223過表達(dá)對大鼠海馬中IL-1β及IL-18水平的影響Tab.4 Effects of miR-223 overexpression on the levels of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

組別對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值IL-1β（pg∕mL）23.12±7.01 133.71±12.08a 128.95±10.86a 69.75±5.08abc 40.04±3.53abcd 181.734＜0.001 IL-18（pg∕mL）20.75±6.06 119.75±11.28a 114.84±8.30a 68.11±6.07abc 45.13±3.46abcd 165.627＜0.001

2.6 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬組織中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬中NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 水平增加（P＜0.05）；與氯胺酮組相比，agomir-223 組NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 水 平 降 低（P＜0.05）；與agomir-223 組相比，agomir-223+BAY11-7082 組NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMDN 水平降低（P＜0.05），見表5、圖3。

圖3 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬組織中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus

表5 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬組織中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Tab.5 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus ±s

表5 miR-223 過表達(dá)對大鼠海馬組織中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Tab.5 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與氯胺酮組相比，bP ＜0.05；與agomir-NC 組相比，cP ＜0.05；與agomir-223 組相比，dP ＜0.05

組別對照組氯胺酮組agomir-NC 組agomir-223 組agomir-223+BAY11-7082 組F 值P 值NLRP3∕β-actin 0.42±0.07 1.20±0.15a 1.16±0.19a 0.93±0.10abc 0.69±0.08abcd 33.714＜0.001 GSDMD-N∕β-actin 0.53±0.05 1.32±0.20a 1.30±0.18a 1.10±0.15acb 0.84±0.11abcd 25.530＜0.001 cleaved Caspase-1∕β-actin 0.61±0.09 1.45±0.23a 1.46±0.20a 1.23±0.22acb 0.93±0.10abcd 20.841＜0.001

3 討論

氯胺酮等麻醉劑的使用會造成新生兒腦損傷，從而導(dǎo)致其成長期行為的改變［3，7］。氯胺酮可促進(jìn)動物和人類大腦神經(jīng)元的死亡，氯胺酮誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的關(guān)鍵機(jī)制是引發(fā)神經(jīng)元凋亡、壞死［3，8-10］。miRNA 可通過調(diào)控基因表達(dá)來參與細(xì)胞的生理病理過程，以及多種疾病的發(fā)生［4，11］。研究發(fā)現(xiàn)miR-223 在過氧化氫處理的海馬神經(jīng)元表達(dá)下調(diào)，右美托咪定可通過促進(jìn)miR-223 表達(dá)來抑制過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用［3］。miR-223-3p 過表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可改善腦缺血大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力，抑制炎癥反應(yīng)及神經(jīng)功能損傷［12］。miR-223 過表達(dá)可通過抑制NLRP3 炎性體來保護(hù)氧化低密度脂蛋白刺激的人血管內(nèi)皮細(xì)胞免于細(xì)胞焦亡［13］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-223 過表達(dá)可降低氯胺酮誘導(dǎo)發(fā)育期大鼠潛伏期、海馬組織病理學(xué)程度、神經(jīng)元凋亡、IL-18、IL-1β，增加穿越平臺次數(shù)、第三象限停留時間占比，該結(jié)果表明，

miR-223 過表達(dá)可改善氯胺酮誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠的認(rèn)知能力及海馬組織神經(jīng)元損傷，抑制炎癥反應(yīng)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

氯胺酮已被發(fā)現(xiàn)可通過激活Caspase-1 依賴性細(xì)胞焦亡來誘導(dǎo)海馬細(xì)胞凋亡［14］。NLRP3 可被某些危險信號激活，通過募集Caspase-1 并與其形成炎性小體使其活化，誘導(dǎo)GSDMD裂解，形成細(xì)胞焦亡標(biāo)志GSDMD-N，破壞細(xì)胞膜，使IL-18 及IL-1β分泌到細(xì)胞外，造成細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，抑制NLRP3∕Caspase-1 激活可抑制細(xì)胞焦亡［15］。研究發(fā)現(xiàn)，電針治療可以通過促進(jìn)miR-223 表達(dá)來抑制NLRP3 水平，從而減輕神經(jīng)炎癥，在大鼠動脈閉塞中起到神經(jīng)保護(hù)作用［16］。miR-223 高表達(dá)可通過抑制NLRP3-Caspase-1 信號通路的激活來提高熱性驚厥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，同時抑制海馬神經(jīng)元的損傷［5，17］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-223 過表達(dá)可降低NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 表達(dá)水平，和前人研究結(jié)果相似［15］，除此之外抑制該通路激活可進(jìn)一步加強(qiáng)miR-223 過表達(dá)對氯胺酮誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元焦亡的改善。該結(jié)果表明，miR-223 過表達(dá)可有效抑制氯胺酮誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元焦亡，并且，其發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其抑制NLRP3∕Caspase-1通路有關(guān)。

綜上所述，miR-223 過表達(dá)可能通過抑制NLRP3∕Caspase-1 通路來減輕氯胺酮誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元焦亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。本研究不僅為氯胺酮誘導(dǎo)海馬神經(jīng)損傷的治療提供有效的治療靶點，還對其發(fā)生機(jī)制研究具有重要意義。但本研究未對miR-223在其他通路中的調(diào)控作用進(jìn)行探究，因此這為下一步的研究提供了方向。