扁塑藤素增強(qiáng)順鉑對條件性重編程原代肺癌細(xì)胞敏感性的機(jī)制

石藝 鐘燕 劉小虎 柯尊富 陳孝 唐欲博

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1藥學(xué)部，2病理科（廣州 510000）

肺癌是危害人類健康的重大疾病之一。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的83%，肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最主要的病理類型［1］。由于肺癌發(fā)現(xiàn)時常為晚期，對于這部分患者來說，含鉑——尤其是順鉑的聯(lián)合化療，是一線推薦的標(biāo)準(zhǔn)治療方案［2］。然而在治療中，順鉑耐藥性會導(dǎo)致聯(lián)合化療方案失敗，引起NSCLC 復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移并最終致死［3-5］。

NF-E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor2，NRF2）是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)來抵御外界不良應(yīng)激刺激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，沉默NRF2 表達(dá)能下調(diào)血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)并增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性［6］。

目前，天然化合物提高化療敏感性，克服化療耐藥性的策略已被廣泛研究［7］。扁塑藤素是一種從衛(wèi)矛科和翅子藤科植物中提取的醌甲基三萜類化合物，在結(jié)腸癌，乳腺癌，肺癌等許多癌種中展現(xiàn)了強(qiáng)大的抗癌活性［8-10］，但其潛在機(jī)制還不明確。有研究報道，扁塑藤素能夠通過抑制Chk1∕53BP 介導(dǎo)的DNA 損傷修復(fù)增敏吉西他濱［11］。

條件性重編程（conditional reprogramming，CR）技術(shù)是一種體外培養(yǎng)永生化原代細(xì)胞的方法，它無需進(jìn)行基因操作，簡單快速，成功率高，避免了多次傳代后性狀和基因不可逆丟失。本研究擬以CR 技術(shù)培養(yǎng)的患者來源的原代肺癌細(xì)胞（conditionally reprogrammed lung cancer cells，CRLCs）為模型，研究扁塑藤素聯(lián)合順鉑對其增殖、遷移、凋亡的影響，并探討KEAP1-NRF2∕HO-1 信號通路在扁塑藤素增強(qiáng)順鉑對CRLCs 的抗腫瘤作用的潛在分子機(jī)制，以期為肺癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素∕鏈霉素雙抗購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；順鉑購自美國Sigma-Aldrich 公司；Y-27632 購自瑞士Enzo 公司，0.25%胰酶消化液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；KEAP1 兔單克隆抗體、NRF2 兔單克隆抗體、HO-1兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；扁塑藤素購于上海同田生物技術(shù)有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司；熒光倒置顯微鏡購自德國Leica 公司。

1.2 細(xì)胞和組織來源 Swiss-3T3-J2 細(xì)胞購自美國ATCC 公司；共獲取中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2020年9-11月14例在胸外科接受手術(shù)治療或在呼吸科接受穿刺活檢的非轉(zhuǎn)移肺癌患者的腫瘤組織，其中男10 例，女4 例，年齡范圍37 ～73 歲，平均年齡59.7 歲。所有組織病理診斷均為肺腺癌。研究已得到中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和患者及其家屬的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 組織處理及CRLCs 培養(yǎng) 剪碎組織塊，膠原酶Ⅳ消化液消化組織碎塊，37 ℃恒溫水浴中震蕩解離，過濾去除殘留碎塊，離心去上清。細(xì)胞沉淀按文獻(xiàn)［12］操作流程與Swiss-3T3-J2 細(xì)胞在含有ROCK 抑制劑Y-27632 的F+Y 培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2條件下共培養(yǎng)。傳代和后續(xù)操作可用0.05%胰酶消化液去除3T3，再用0.25%胰酶消化液消化CRLCs。

1.3.2 扁塑藤素和順鉑的配制 DMSO 溶解扁塑藤素粉末，制成20 mmol∕L 的PRIS 溶液。生理鹽水溶解順鉑粉末，制成5 mmol∕L 的順鉑溶液。藥液分裝并于-20 ℃避光儲存。

1.3.3 MTS 實驗檢測細(xì)胞增殖 以3 000 個∕孔的細(xì)胞密度接種CRLCs 于96 孔板上，37 ℃，5%CO2過夜。分別用不同濃度的扁塑藤素、順鉑、Znpp（20 μmol∕L）處理細(xì)胞48 h。每孔加入10 μL的MTS工作液，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀于490 nm 波長處測定OD值，計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力計算公式：細(xì)胞活力（%）=（A實驗-A空白）∕（A對照-A空白）×100%。

1.3.4 Calcein-AM/PI 細(xì)胞雙染實驗檢測細(xì)胞活力 以3 000 個∕孔的細(xì)胞密度接種CRLCs 于96 孔板上，37 ℃，5%CO2過夜。扁塑藤素和順鉑分別或聯(lián)合處理細(xì)胞48 h。用含有2 μmol∕L Calcein-AM和1 μg∕mL PI 的PBS 于37 ℃，5%CO2染色30 min。熒光顯微鏡拍照。

1.3.5 Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 扁塑藤素和順鉑分別或聯(lián)合處理細(xì)胞24 h，消化細(xì)胞，用無血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸，以5 × 104個∕孔的細(xì)胞密度接種于無或有Matrigel 膠覆蓋的Transwell 上室，下室加入含20%FBS 的F+Y 培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培育24 h（遷移）或48 h（侵襲）。棉簽擦去上室細(xì)胞，4%PFA 室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，拍照；33%乙酸洗脫，酶標(biāo)儀于590 nm 波長處測定OD值，計算細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量。

1.3.6 Annexin V-APC 流式細(xì)胞凋亡術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 以20 × 104個∕孔的細(xì)胞密度接種CRLCs 于6 孔板上，37 ℃，5%CO2過夜。扁塑藤素和順鉑分別或聯(lián)合處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μL 的Annexin V-APC 染液混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長633 nm，最大發(fā)射波長660 nm 條件下進(jìn)行檢測。

1.3.7 qRT-PCR 檢 測mRNA 水 平 用RNeasy Mini Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）提取總RNA。用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）對每個樣本的總RNA（300 ng）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）通過CFX96TM實時PCR 檢測系統(tǒng)完成qRT-PCR 擴(kuò)增。所有操作基于制造商的說明進(jìn)行。以GAPDH 為內(nèi)參將數(shù)據(jù)歸一化處理，用2-ΔΔCT方法計算相對表達(dá)量。

1.3.8 Western blot檢測細(xì)胞表達(dá)水平 用5 mmol∕L ROS 清除劑NAC 或30 μmol∕L NRF2 激活劑tBHQ預(yù)處理細(xì)胞60 min，再用藥物處理細(xì)胞24 h；用20 μmol∕L HO-1 抑制劑Znpp 單獨或聯(lián)合藥物處理細(xì)胞24 h。加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，于冰上搖動裂解30 min，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，低溫高速離心，收集上清，BCA 檢測試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性。蛋白質(zhì)樣品（30 μg）經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。室溫下用5%BSA封閉1 h 后，與一抗在4 ℃下孵育過夜。TBST 洗膜，室溫下用HRP 連接二抗孵育1 h，TBST 洗膜，顯影儀檢測蛋白表達(dá)。

1.3.9 ROS 的測定 以4 000 個∕孔的細(xì)胞密度接種CRLCs 于96 孔板，37 ℃，5%CO2過夜。5 mmol∕L NAC 預(yù)處理細(xì)胞60 min 后，扁塑藤素和順鉑分別或聯(lián)合處理24 h。30 μmol∕L DCFH-DA 避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡拍照。DCF 的熒光強(qiáng)度用多模式讀板儀測定，激發(fā)和發(fā)射波長為488 nm。

1.3.10 線粒體膜電位的測定 扁塑藤素和順鉑分別或聯(lián)合處理12 h，5 μmol∕L JC-1 孵育30 min，倒置熒光顯微鏡拍攝熒光圖像。5 mmol∕L NAC 預(yù)處理細(xì)胞60 min 后，扁塑藤素和順鉑分別或聯(lián)合處理24 h，收集細(xì)胞，用含20 nmol∕L 的DiOC6 的PBS 重懸，37 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長482 nm，發(fā)射波長504 nm條件下進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 每個實驗至少重復(fù)3 次。使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，比較用單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs的細(xì)胞毒性 MTS實驗結(jié)果顯示，扁塑藤素和順鉑分別對CRLCs的細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1A、B）。除了1 μmol∕L扁塑藤素和8 μmol∕L順鉑聯(lián)合組，與單藥組相比，扁塑藤素聯(lián)合順鉑顯著抑制了CRLCs 的細(xì)胞活力，2 μmol∕L 扁塑藤素和6、8 μmol∕L 順鉑聯(lián)合組的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.01，圖1C、D）。Calcein-AM∕PI 雙染結(jié)果顯示，單藥組CRLCs 呈Calcein-AM 陽性染色（綠）多而PI 陽性染色（紅）少，而扁塑藤素和順鉑聯(lián)合處理后，細(xì)胞呈PI 陽性染色多而Calcein-AM 陽性染色少（圖1E）。

圖1 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs 抗增殖活力和細(xì)胞毒性Fig.1 PRIS enhances the anti-proliferative effect and cytotoxicity of cisplatin on CRLCs

2.2 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs 的遷移和侵襲抑制作用 Transwell 遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，與單藥組相比，扁塑藤素聯(lián)合順鉑能夠顯著降低CRLCs 的遷移和侵襲的數(shù)量（P＜0.01，圖2）。

圖2 扁塑藤素增強(qiáng)順鉑對CRLCs 遷移和侵襲抑制的作用Fig.2 PRIS enhances inhibitory effect of cisplatin on migration and invasion of CRLCs

2.3 扁塑藤素提高順鉑對CRLCs 的凋亡誘導(dǎo)作用 Annexin V-APC 流式細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與單藥組相比，扁塑藤素聯(lián)合順鉑能夠明顯增加細(xì)胞凋亡數(shù)（P＜0.01，圖3A、B）。Western blot結(jié)果顯示，相比于單藥組，扁塑藤素聯(lián)合順鉑可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 釋放，增加線粒體凋亡標(biāo)志物caspase-9、caspase-7、caspase-3 和Bax∕Bcl-2 的表達(dá)（P＜0.01，圖3C、D）。

圖3 扁塑藤素增強(qiáng)順鉑對CRLCs 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)Fig.3 PRIS sensitizes cisplatin-induced apoptosis of CRLCs

2.4 扁塑藤素增加順鉑誘導(dǎo)的CRLCs 內(nèi)ROS 累積和線粒體功能障礙 ROS 檢測結(jié)果顯示，相比于單藥組，扁塑藤素聯(lián)合順鉑顯著增加了ROS 在CRLCs 中的累積（P＜0.01，圖4A、C）。線粒體膜電位（MMP）檢測結(jié)果顯示，相比于單藥組，扁塑藤素聯(lián)合順鉑能夠顯著降低CRLCs 中MMP 的水平（P＜0.01，圖4B、E）。 ROS 清除劑NAC 預(yù)處理結(jié)果表明，NAC 預(yù)處理能夠削弱扁塑藤素和順鉑誘導(dǎo)的ROS 累積（P＜0.01，圖4D），抑制扁塑藤素和順鉑誘導(dǎo)的MMP 降低（P＜0.01，圖4F）。

圖4 扁塑藤素增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的CRLCs 內(nèi)ROS 累積和線粒體功能障礙Fig.4 PRIS enhances cisplatin-induced accumulation of ROS and dysfunction of mitochondria in CRLCs

2.5 扁塑藤素通過抑制KEAP1-NRF2/HO-1 信號通路增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 Western blot 和qRT-PCR 結(jié)果顯示，相比于對照組和單藥組，扁塑藤素聯(lián)合順鉑顯著下調(diào)了CRLCs 內(nèi)KEAP1，NRF2，HO-1的表達(dá)以及NRF2，HO-1的mRNA水平（圖5AC，P＜0.01）。NRF2 激活劑tBHQ 預(yù)處理結(jié)果顯示，tBHQ 顯著提高了NRF2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平，扁塑藤素聯(lián)合順鉑能夠抑制tBHQ 對NRF2 和HO-1 的激活作用（圖5D）。HO-1 抑制劑Znpp 處理后，Western blot 結(jié)果顯示，Znpp 能夠增加扁塑藤素聯(lián) 合 順鉑上 調(diào) 的caspase-3 和Bax∕Bcl-2 表達(dá)水 平（圖5E、F，P＜0.01）；MTS 實驗結(jié)果顯示，Znpp 能夠增強(qiáng)扁塑藤素聯(lián)合順鉑的細(xì)胞活力抑制作用（圖5G，P＜0.01）。此外，NAC預(yù)處理削弱了扁塑藤素聯(lián)合順鉑提高的caspase-9，caspase-3，Bax∕Bcl-2表達(dá)水平（P＜0.01，圖5H、I）。

圖5 扁塑藤素聯(lián)合順鉑對KEAP1-NRF2∕HO-1 信號通路的影響Fig.5 Effects of PRIS and cisplatin on KEAP1-NRF2∕HO-1 signaling pathway

3 討論

耐藥性嚴(yán)重影響了順鉑在肺癌治療中的應(yīng)用。天然化合物不僅可以單獨產(chǎn)生抗腫瘤作用，還可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生的耐藥作用［7］。利用條件性重編程（CR）技術(shù)體外穩(wěn)定、長期培養(yǎng)原代肺癌細(xì)胞，能夠保留患者腫瘤的遺傳學(xué)特性，為肺癌治療提供藥物篩選平臺［13］。在前期研究中［14］，筆者應(yīng)用CR 技術(shù)建立了CRLCs，證明了扁塑藤素能通過EphB4∕CDC42∕N-WASP 信號通路誘導(dǎo)線粒體損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致CRLCs 死亡。免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，CRLCs 保留了包括CK7、CEA、TTF-1 在內(nèi)的多種肺腺癌惡性上皮細(xì)胞特征；STR 分析表明，細(xì)胞培養(yǎng)的早、中、晚期過程中，在9 個表達(dá)位點顯示一致性。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，扁塑藤素和順鉑分別能以劑量依賴的方式抑制CRLCs 的細(xì)胞活力，扁塑藤素能增強(qiáng)順鉑對CRLCs 的抗增殖能力和細(xì)胞毒性。此外，扁塑藤素能增強(qiáng)順鉑抑制CRLCs 遷移和侵襲的能力。這與扁塑藤素對肺癌細(xì)胞H1299 毒性作用一致［10］。

誘導(dǎo)凋亡是藥物發(fā)揮抗癌活性的重要途徑，涉及細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-8、caspase-3、Bcl-2 家族等蛋白的一系列生物學(xué)過程［15］。在本研究中，扁塑藤素能增加順鉑誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量和凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3和Bax∕Bcl-2 的表達(dá)。這些結(jié)果表明，扁塑藤素能增加順鉑誘導(dǎo)的凋亡作用。

扁塑藤素作用腫瘤細(xì)胞會產(chǎn)生過量ROS，誘導(dǎo)線粒體膜通透性上升，表面形成孔洞，進(jìn)而釋放細(xì)胞凋亡因子，發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)使細(xì)胞死亡［16］。扁塑藤素誘導(dǎo)的過量ROS 也會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使未折疊蛋白累積超過細(xì)胞調(diào)節(jié)限度，引起細(xì)胞死亡［8］。扁塑藤素還能通過ROS 激活A(yù)SK1∕JNK 信號通路發(fā)揮抗癌作用［17］。本研究結(jié)果顯示，扁塑藤素聯(lián)合順鉑能顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，降低線粒體膜電位，而這些作用可以被ROS 清除劑NAC 阻斷。這提示，扁塑藤素聯(lián)合順鉑能夠通過顯著抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，NRF2 與KEAP1解離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf 蛋白形成異二聚體，和抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，從而調(diào)控包括HO-1 在內(nèi)的多種蛋白的表達(dá)［18］。HO-1 是血紅素降解的限速酶，與細(xì)胞抗炎和抗凋亡作用有關(guān)［19］。NRF2 能增加下游HO-1 的表達(dá)，抑制血紅素和Fbxo22 介導(dǎo)的Bach1 降解，促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移［20］。抑制HO-1 或敲低NRF2 能夠增強(qiáng)順鉑對喉部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的抗癌作用，增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和細(xì)胞死亡［21］。本研究結(jié)果顯示，扁塑藤素增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的ROS 穩(wěn)態(tài)的破壞，一方面增加了ROS 在細(xì)胞中的累積，另一方面又抑制了細(xì)胞氧化應(yīng)激的機(jī)制，可能通過調(diào)控KEAP1-NRF2∕HO-1 信號通路引起ROS 超載，增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果為扁塑藤素用于順鉑的化療增敏及發(fā)現(xiàn)新的腫瘤耐藥∕逆轉(zhuǎn)耐藥相關(guān)基因提供了實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。因獲取的臨床肺癌樣本數(shù)量有限，故無法對樣本根據(jù)臨床信息進(jìn)行分組，獲取不同亞組間的藥物敏感性和分子調(diào)控的差異。后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，按肺癌分子亞型分組、癌細(xì)胞分級等因素進(jìn)行樣本匹配后研究，盡量減少因肺癌分子分型等不同而導(dǎo)致的研究結(jié)果差異。