奧沙利鉑通過自噬誘導胃癌細胞耐藥的機制

聶微 嚴芝強 成興真 劉麗榮 楊芳，3

1貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院臨床檢驗基礎與血液學教研室（貴陽550004）；貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2胃腸外科，3臨床檢驗中心（貴陽 550004）

鉑類藥物研發(fā)于20 世紀60年代，是美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦的胃癌一線基礎化療藥，其中OXA 屬于第三代鉑類抗腫瘤藥物，OXA 進入細胞后可以和細胞質中線粒體和細胞核上的DNA 結合、形成多種交鏈結構，抑制腫瘤細胞DNA 的復制和轉錄［1］。鉑類引起的線粒體和細胞核上DNA損傷可以激活多種信號轉導途徑、進而激活細胞凋亡信號，當信號轉導途徑被異常激活或抑制時，細胞會表現出對鉑類藥物的抵抗及凋亡抑制［2］。OXA 的胃腸道反應、腎毒性及血液毒性低于第一、二代鉑類藥，臨床患者通過OXA 聯合治療后可獲得近50%的緩解率，還可提高患者5年生存率及生存質量［3］；但隨著用藥時間的延長，OXA 耐藥嚴重影響了患者治療效果。為此，如何提高胃癌細胞對OXA 的敏感性、避免化療耐藥性的產生，是目前亟待解決的臨床問題，研究耐藥機制并探索可能的逆轉耐藥策略是解決問題的關鍵，而建立良好的耐藥細胞株模型是進行體外研究腫瘤細胞發(fā)生耐藥機制的前提。

自噬是機體的穩(wěn)態(tài)機制，生理情況下細胞的基礎自噬水平較低，通過細胞內溶酶體降解細胞產生的無用成分，包括錯誤折疊的蛋白質、毒性聚合物和受損的細胞器等，從而維持細胞的存活，發(fā)揮細胞的質檢及自凈作用［4］，當自噬過程發(fā)生紊亂，這種自穩(wěn)調控機制就會失靈，細胞的穩(wěn)態(tài)受到破壞，發(fā)生細胞死亡和組織損傷，導致多種疾病的發(fā)生［5-6］。有研究表明，化療藥物可在腫瘤細胞中誘導自噬的發(fā)生，為細胞適應環(huán)境存活而提供條件［7-8］，有證據表明自噬和耐藥密切相關［9］，自噬誘導腫瘤細胞耐藥的機制可能有兩種：一方面腫瘤細胞可以利用溶酶體消化降解細胞內功能障礙的細胞器、蛋白及各種生物大分子，并通過回收利用，使細胞免于凋亡或死亡，為細胞的生存提供重要保障；另外，自噬是通過某種方式緩解細胞內部的壓力，同時降解有害物質，使細胞能適應新環(huán)境，保證細胞內環(huán)境穩(wěn)定及生存［10］。

OXA 是胃癌患者一線基礎化療藥，長期用藥會導致耐藥的產生，其機制與化療藥物誘導腫瘤細胞的自噬功能異常有關。本研究選取人胃癌細胞MGC-803 構建OXA 耐藥細胞株MGC-803∕OXA，用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學變化，檢測細胞耐藥指數；用流式細胞儀檢測細胞周期分布及凋亡，RT-qPCR 檢測耐藥相關基因多藥耐藥基因1（mμltidrug resistance gene1，MDR-1）、多藥耐藥相關蛋白（mμltidrug resisetance-related proteins，MRP）、切除修復交叉互補基因（excision repair cross complementing 1，ERCC1）的mRNA 表達，Western blot檢測耐藥相關基因蛋白MDR-1、MRP、ERCC1 及自噬相關蛋白P62、Beclin-1 和LC3 表達；同時用透射電鏡觀察MGC-803∕OXA 細胞中自噬體數量及結構變化；探討OXA 治療胃癌時的耐藥機制，為逆轉耐藥策略提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及細胞株 人胃癌細胞株MGC-803（Cat.No.TC-hxbz-026，深圳拓普生物技術有限公司），奧沙利鉑（Oxaliplatin，OXA，恒瑞制藥公司），3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，上海Selleck公司）。

1.1.2 實驗試劑與儀器 細胞活力檢測試劑盒（CCK8，日本同仁化學研究所），GAPDH 抗體（武漢三鷹proteintech），MRP、MDR-1、ERCC1、P62、Beclin-1 和LC3 抗體（美國CST），Trizol 試劑、RT Mix、SYBR EX Taq（Takara 公司），RIPA 細胞裂解液（上海碧云天生物技術公司），蛋白濃度檢測試劑盒（杭州弗德生物科技有限公司），ECL 試劑盒（Millipore），倒置相差顯微鏡（Olympus 公司），羅氏480 PCR 儀（Roche 公司），透射電鏡（日本JEOL）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 所有細胞在37 ℃飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為10%胎牛血清（FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和1%鏈霉素的1640 培養(yǎng)基。

1.2.2 人胃癌耐藥細胞株的誘導 采用OXA 濃度梯度遞增誘導法誘導MGC-803 細胞獲得耐藥，起始的OXA 濃度為0.1 μg∕mL，加藥孵箱24 ～48 h 后根據細胞生長狀態(tài)更換無OXA 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中密切觀察細胞的生長狀態(tài)，合適時進行傳代，重新復蘇待細胞生長至對數生長期并生長狀態(tài)良好時再次換成含有OXA 的培養(yǎng)基，并逐漸提高OXA 濃度，視細胞生長狀態(tài)逐步增加OXA 的遞增量，濃度梯度如下：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μg∕mL，前期細胞生長較緩慢，當細胞生長接近正常時，逐漸加大OXA 濃度，加至4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg∕mL；增加藥物濃度后，細胞生長開始變慢，當濃度加到32.0 μg∕mL 時，開始出現很多死細胞，再連續(xù)培養(yǎng)3 個月，發(fā)現細胞能在4 μg∕mL 的OXA 濃度中穩(wěn)定生長的耐藥細胞株，并用MGC-803∕OXA 表示。用倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，分別取生長狀態(tài)良好的MGC-803∕OXA 及MGC-803 進行下一步實驗。耐藥細胞模型于實驗前1 周撤去含OXA 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并且傳代穩(wěn)定生長后使用。

1.2.3 CCK-8 法檢測MGC-803/OXA、MGC-803細胞的耐藥性 取計數好的、混勻的細胞懸液，按照104∕孔接種于96 孔板中，每孔200 μL，5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，室溫無菌PBS 洗3 次后，加入OXA 處理，去除原含藥物培養(yǎng)基，再次用室溫無菌PBS 洗3 次后，向96 孔板中加入100 μL 去血清1640 培養(yǎng)基；避光條件下向各孔中加入CCK8試劑10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。酶標儀上測定各孔在450 nm 處的吸收光值（即OD值），一般的OD值在0.5 ～2.5，若在0.8 ～1.5 時則表示結果較為準確。同時設置1640 對照組、陰性對照組及實驗組。細胞抑制率=（對照孔-實驗孔）∕（對照組-空白組）×100%，根據計算的細胞抑制率繪制細胞生長曲線。抑制率=［1-實驗組A 值∕對照組A 值均值］×100%，50%抑制濃度（IC50）計算耐藥系數（RI）=IC50耐藥細胞∕IC50親代細胞。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 取出生長至80%的MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞，預冷PBS 1.5 mL洗細胞2 ～3 次收集細胞沉淀，棄上清，用預冷PBS 1.5 mL 洗滌，去除PBS 和細胞碎片，再加入500 μL 預冷PBS，邊震蕩邊加入70%酒精，酒精至少3.5 mL，4 ℃固定4 h 以上。固定好的細胞于-20 ℃保存。1 000 r∕min 離心5 min 后去掉乙醇，加入PBS 再次洗滌后去上清，將殘存的乙醇除去，加入PBS 200 μL、RNA 酶2 μL，室溫下30 min消化RNA。加入50 μg∕mL PI 染料0.5 mL，室溫避光30 min，將細胞過濾至含PBS 的離心管中，1 h 內用流式細胞儀檢測，一般計數2 ～3 萬個細胞。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 取出長至80%的MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞，預冷PBS 洗細胞2 ～3 次收集細胞沉淀，加入1 mL 預冷PBS 轉移至1.5 mL 離心管。每管加入1×Binding Buffer 100 μL混均勻，每管各加FITC 5 μL、PI 5 μL，室溫避光反應15 min，1 500 r∕min 離心5 min（4 ℃），在1 h 內流式細胞儀檢測，一般計數2 ～3 萬個細胞。

1.2.6 TRIzol法提取總RNA MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞在培養(yǎng)瓶中長滿80%，取1 ～5 × 105個細胞用PBS 洗滌細胞2 次。加入1 mL TRIzol 劇烈震蕩，使用氯仿、異丙醇、75%乙醇提取總RNA，加DEPC 水40～80 μL 溶解，于-80 ℃冰箱保存。在酶標儀上測定RNAOD260∕OD280比值，比值在1.8～2.0純度符合要求。驗證合格的RNA 用RT Mix 逆轉錄為cDNA。

1.2.7 Real time PCR檢測mRNA的表達變化 引物序列設計：GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 基因引物序列均由上海生工生物工程技術服務公司合成，序列如表1。測定mRNA 的相對表達量時使用GAPDH 作為內參。反應體系為20 μL，擴增條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個循環(huán)。結果采用2-ΔΔCt法分析各基因mRNA 的相對表達量。

表1 GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 基因引物序列Tab.1 GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 gene primer sequence

1.2.8 Western blot 蛋白印跡分析檢測蛋白水平的變化 6 孔板每孔細胞加80 μL 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min 提取總蛋白并使用蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，每孔上樣蛋白總質量為30 μg，進行SDS-PAGE 電泳，轉膜封閉后使用特異性一抗孵育16 h 以上，TBST 緩沖液清洗3 次后使用二抗孵育1 h，使用ECL 發(fā)光試劑盒通過印跡曝光儀進行圖像獲取，再使用image J 分析軟件測定蛋白條帶的積分光密度值，每個樣品同時檢測GAPDH 蛋白條帶作為內參。

1.2.9 透射電子顯微鏡（TEM） MGC-803∕OXA、MGC-803 細胞在培養(yǎng)瓶中長滿80%時倒掉培養(yǎng)液，加入電鏡固定液，4 ℃固定2 ～4 h，細胞低速離心至管底可以看到綠豆大小的細胞團塊，1%瓊脂糖包裹，0.1 mol∕L 磷酸緩沖液（pH7.4）漂洗3 次，每次15 min。1%的鋨酸0.1 mol∕L 磷酸緩沖液PB（pH7.4）室溫（20 ℃）固定2 h。0.1 mmol∕L 磷酸緩沖液PB（pH7.4）漂洗3 次。依次加入50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精，100%丙酮，上行脫水。丙酮∶812 包埋劑=1∶1 浸泡2 ～4 h，丙酮∶812 包埋劑=2∶1 滲透過夜，純812 包埋劑5 ～8 h，將純812 包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。60 ℃烤箱聚合48 h。超薄切片機切片厚60 ～80 nm。鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min），切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.2.10 用自噬抑制劑3-MA 藥物誘導細胞 細胞密度生長至70%，使用終濃度為5 mol∕L 的3-MA處理24 h，對照組加入同等體積的DMSO 處理相同的時間。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計分析，采用Graphpad Prism 8.0 作圖，計量資料符合正態(tài)分布，用均數±標準差表示，方差齊性檢驗方差齊時，單因素分析采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 耐藥細胞的誘導和細胞生物學特性

2.1.1 細胞形態(tài) 倒置相差顯微鏡下可見MGC-803和MGC-803∕OXA 細胞形態(tài)學特點：MGC-803 細胞貼壁生長、呈上皮樣單層排列、大小較均一、細胞形態(tài)規(guī)則、邊界清晰、核大、圓形或橢圓形；MGC-803∕OXA 耐藥細胞同樣呈上皮樣單層排列，但細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則、邊界欠清晰、核大、色深、折光性變強、并常呈聚團生長狀態(tài)，細胞增殖緩慢，死亡細胞較多。見圖1。

圖1 MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞的形態(tài)Fig.1 Morphology of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.2 MGC-803 和MGC-803/OXA 的耐藥指數 MGC-803 和MGC-803∕OXA 耐藥指數測定：OXA 濃度梯度為0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg∕mL，CCK8 法檢測細胞OD值計算細胞抑制率，以藥物濃度為橫軸，細胞抑制率為縱軸，繪制濃度效應曲線，求得半數抑制濃度（IC50），計算MGC-803∕OXA 耐藥指數為7.04（RI= IC50（耐藥株）∕IC50（親本株）），RI ＞5認為耐藥細胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。見圖2。

圖2 MGC-803、MGC-803∕OXA 對OXA 藥物的IC50Fig.2 IC50 diagram of MGC-803 and MGC-803∕OXA to Oxaliplatin

2.1.3 MGC-803 和MGC-803/OXA 的細 胞 周期分布 流式細胞儀檢測細胞周期分布，結果發(fā)現OXA 誘導后MGC-803∕OXA 耐藥細胞株對數生長期的增殖速度減慢，G0∕G1 期分布增加、S 期分布明顯減少、G2∕M 期分布明顯延長，與MGC-803 比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示OXA 可改變耐藥細胞的細胞周期。見圖3。

圖3 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞周期分布Fig.3 Cell cycle distribution of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.4 MGC-803 和MGC-803/OXA 的細胞凋 亡 結果 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，OXA 誘導后MGC-803∕OXA 的凋亡明顯減少，與MGC-803比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示OXA 抑制耐藥細胞凋亡。見圖4。

圖4 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞凋亡Fig.4 Apoptosis map of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.5 耐藥相關基因MDR-1、MRP、ERCC1 mRNA在MGC-803 和MGC-803/OXA 中的表達 RTqPCR 檢測耐藥相關基因mRNA 表達水平，結果顯示MGC-803∕OXA 的細胞中MDR-1、MRP、ERCC1 mRNA 表達高于MGC-803（P＜0.01）。見圖5。

圖5 MGC-803、MGC-803∕OXA 細胞耐藥相關基因mRNA表達Fig.5 mRNA expression of drug resistance related genes in MGC-803 and MGC-803∕OXA cells

2.1.6 耐藥相關基因MDR-1、MRP、ERCC1蛋白在MGC-803和MGC-803/OXA細胞中表達 Western blot 檢測耐藥相關基因蛋白表達，結果顯示MGC-803∕OXA 的細胞中MDR-1、MRP、ERCC1 蛋白表達高于MGC-803（P＜0.05）。見圖6。

圖6 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞中耐藥相關基因蛋白表達Fig.6 Protein expression of drug resistance-related genes in MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.2 MGC-803 和MGC-803/OXA 細胞中P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達 Western blot 檢測MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞中P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ∕Ⅰ等自噬相關蛋白的表達，結果顯示與親本細胞株MGC-803 相比，MGC-803∕OXA 中P62 蛋白表達下調，Beclin-1 蛋白的表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ蛋白比值均顯著增加（P＜0.05），提示耐藥細胞中的細胞自噬被激活。見圖7。

圖7 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的細胞中P62、Beclin-1 和LC3 的蛋白表達Fig.7 Protein expression of p62、Beclin-1 and LC3 in MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.3 MGC-803 和MGC-803/OXA 細胞中自噬小體數量及結構 透射電鏡觀察MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞中的超微結構，結果顯示與MGC-803相比，耐藥細胞株MGC-803∕OXA 細胞內具有典型的、內含胞漿成分的空泡狀雙層膜樣結構的自噬體，且數量顯著增加，提示耐藥細胞株的自噬被激活。見圖8。

圖8 MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞自噬小體（A 和B×1.5 k，C 和D×6.0k）Fig.8 Levels of autophagy vesicles in MGC-803 and MGC-803∕OXA（A&B×1.5 k，C&D×6.0k）

2.4 自噬抑制劑3-MA 對MGC-803 和MGC-803/OXA 自噬水平的影響 5 mmol∕L 的3-MA 分別作用MGC-803 和MGC-803∕OXA 24 h 后，Western blot方法檢測P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ∕Ⅰ蛋白的表達。結果提示，MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞在3-MA作用24 h 之后，細胞中P62蛋白表達升高，Beclin-1蛋白表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ比值下降（P＜0.05），提示3-MA 可以抑制MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞的自噬水平。見圖9。

圖9 自噬抑制劑3-MA 對MGC-803 和MGC-803∕OXA 細胞自噬的影響Fig.9 Effect of autophagy inhibitor 3MA on autophagy of MGC-803 and MGC-803∕OXA

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，主要治療手段是手術治療結合放化療及靶向治療［11］，雖然目前新型化療藥和靶向藥物的開發(fā)提高了胃癌患者治療效果，延長了生存期［12-13］，但中晚期胃癌5年生存率仍然徘徊在27%左右［14］。藥物抵抗已成為限制晚期胃癌患者絕對生存時間的主要瓶頸。

耐藥機制一直尚未完全清楚，體外建立腫瘤耐藥細胞株是研究腫瘤細胞產生耐藥機制的重要手段，也是耐藥機制研究的實驗基礎，所以運用藥物刺激建立耐藥株使得探索其機制成為了可能。本研究采用OXA 濃度梯度遞增誘導法，間歇藥物誘導MGC-803 使其獲得耐藥，起始的OXA 濃度為0.1 μg∕mL，通過逐步快速遞增培養(yǎng)液中OXA 濃度，對MGC-803 進行體外誘導和篩選，大約6 個月獲得了最終可在4 μg∕mL 的OXA 濃度中穩(wěn)定生長的耐藥細胞株MGC-803∕OXA，其耐藥性是親本株的7.04 倍，且在脫離OXA 培養(yǎng)1 個月以及將細胞凍存3月后再復蘇發(fā)現其仍能較好生長并增殖，耐藥性基本保持穩(wěn)定（RI = 7.0），按此標準劃分建立的細胞株為中度耐藥［15］。在倒置顯微鏡觀察發(fā)現，相較于親本細胞MGC-803，耐藥細胞MGC-803∕OXA 形態(tài)發(fā)生明顯改變，大小不均一，形態(tài)不規(guī)則，邊界欠清晰，細胞體積增大，核大、色深，不規(guī)則，折光性變強，細胞增殖緩慢，死亡細胞較多。從細胞周期分布可以看出，經過OXA 誘導后MGC-803∕OXA 耐藥細胞株對數生長期的增殖速度明顯減慢，MGC-803∕OXA 的G0∕G1 期分布略有增加，S期分布明顯減少，G2∕M 期分布明顯延長，提示MGC-803 細胞經OXA 誘導作用后，其細胞周期分布發(fā)生改變，主要表現為G2∕M 期延長。這與徐宗斌等［16］建立的耐藥細胞株結果相似。從細胞凋亡結果可以看出，MGC-803∕OXA 細胞凋亡細胞數分布明顯少于MGC-803，這與任靜等［17］所建立的耐藥細胞株結果相似，說明MGC-803 耐藥細胞株的凋亡明顯受到抑制，細胞凋亡通路受到抑制也是腫瘤細胞耐藥的一個重要因素。MDR-1、MRP、ERCC1 基因異常表達與腫瘤的耐藥性產生關系較為密切。本研究檢測出MGC-803∕OXA 細胞中MDR-1、MRP、ERCC1mRNA 和蛋白表達較MGC-803 顯著升高，說明MGC-803∕OXA 細胞耐藥的產生，從而證明MGC-803∕OXA 細胞株為耐藥細胞株。

近年來越來越多的研究表明，化療可在腫瘤細胞中誘導自噬的發(fā)生［8，18］，自噬是機體的穩(wěn)態(tài)機制，細胞的基礎自噬水平較低，通過溶酶體降解細胞內成分，包括錯誤折疊的蛋白質、毒性聚合物和受損的細胞器等，從而維持細胞的存活［4-5］。當營養(yǎng)匱乏、氧化應激及化療等都可誘導細胞內自噬的發(fā)生，從而為細胞適應環(huán)境存活而提供條件。相關報道提示自噬和腫瘤細胞的化療耐藥相關，誘導自噬可導致肝癌和肺癌對順鉑產生耐藥［18］。而胃癌細胞在多種因素的作用下通過誘導自噬的發(fā)生促進癌細胞的生存［19］。因此，本研究首先需要明確胃癌的OXA 耐藥細胞株（MGC-803∕OXA）細胞的自噬水平。

自噬是一個動態(tài)過程，一般包括自噬泡（phagophore）產生、自噬體（autophagosome）形成、自噬體融合（fusion）及自噬體降解（degeneration）四個階段，自噬過程中自噬相關基因（autophagy-related gene，atg）及微管相關蛋白-3（LC-3）起到重要作用，Beclin1 是酵母菌Atg6 蛋白的哺乳細胞同源蛋白，是自噬發(fā)生過程中的核心蛋白，可作為評價自噬水平的指標。LC3 是酵母菌Atg8 蛋白的哺乳動物同系物，在自噬小體雙層膜結構的形成及自噬泡修飾中起到重要作用，其羧基端被Atg4 迅速剪切，產生定位于胞漿的LC3-Ⅰ。在自噬體形成過程中，LC3-Ⅰ通過泛素樣反應，結合到PE 上，產生脂質化的LC3-Ⅱ，并定位到自噬體的膜上，是自噬體的重要標志物，隨自噬體膜的增多而增加。本研究釆用了多種方法檢測胃癌耐藥細胞株MGC-803∕OXA 和親本細胞MGC-803 的自噬水平。首先，通過免疫印跡的方法發(fā)現，MGC-803∕OXA 中自噬相關蛋白P62 蛋白表達低于MGC-803 親本細胞，Beclin 1 表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ的比值高于MGC-803 親本細胞。說明耐藥細胞株自噬被激活，自噬小體增多，而P62 蛋白表達減少，自噬體與溶酶體正常融合，自噬流正常。接著，通過透射電鏡觀察細胞的超微結構，更為直觀觀察到耐藥株MGC-803∕OXA 細胞比MGC-803 親本細胞具有更多典型的自噬體及溶酶體結構。以上結果表明OXA 耐藥的胃癌耐藥細胞株MGC-803∕OXA 和MGC-803 親本細胞均發(fā)生了自噬。為了進一步驗證自噬可以調控胃癌細胞對OXA 的耐藥性，本研究利用自噬抑制劑3MA 分別作用兩組細胞后，MGC-803∕OXA 和MGC-803 細胞自噬相關蛋白P62 蛋白表達量上調，而Beclin-1 的蛋白表達和LC3Ⅱ∕Ⅰ的比值均下調，自噬水平明顯受到抑制。本研究還發(fā)現自噬抑制劑處理后，耐藥細胞株中MGC-803∕OXA 自噬水平下調比親本細胞更為顯著。這提示3MA 抑制了OXA 對自噬的激活作用，表明OXA 誘導的自噬，有利于維持耐藥細胞的存活，是胃癌細胞耐受OXA 的機制之一。

本研究成功構建耐OXA 胃癌細胞株并探討了OXA 治療胃癌時的耐藥機制，為臨床尋找提高耐藥細胞對OXA 敏感性的方法以及尋找OXA 耐藥細胞高效低毒的耐藥逆轉劑提供實驗基礎。下一步可以此為實驗基礎，通過細胞實驗和動物實驗進一步探討調控胃癌細胞耐藥的分子標志物和治療靶點。