不同固體培養(yǎng)基配方對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響及臺灣含笑雜交親和性分析

劉向東， 殷云龍

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

中國的木蘭科(Magnoliaceae)含笑屬(MicheliaLinn.)植物種質(zhì)資源豐富，共40余種，主要分布在亞熱帶植被區(qū)[1]151-152。該屬植物花色豐富、花香濃郁、四季常綠，不僅是優(yōu)良的園林綠化植物，而且是富含單萜烯類、倍半萜烯及含氧衍生物等化學(xué)成分的經(jīng)濟(jì)植物[2-4]。中國科學(xué)院華南植物園在20世紀(jì)90年代建立了國內(nèi)首個木蘭科植物種質(zhì)基因庫[2]，從此以后，木蘭科含笑屬植物一直是國內(nèi)開展樹木資源引種保育和推廣應(yīng)用的目標(biāo)植物類群之一。

臺灣含笑〔M.compressa(Maxim.) Sarg.〕為木蘭科含笑屬常綠喬木，原產(chǎn)于中國臺灣地區(qū)，生于海拔200～2 600 m的闊葉林中，是臺灣地區(qū)主要用材樹種之一[1]187-189。1982年，江蘇省中國科學(xué)院植物研究所科研人員從福建引進(jìn)了1株臺灣含笑實(shí)生苗，該實(shí)生苗在南京表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性，目前已通過嫁接和種子繁育等方式進(jìn)行繁殖，并已成功引種到蘇北地區(qū)[5]。然而，與常見的木蘭科植物相比，臺灣含笑的花朵較小，花色不夠鮮艷，觀賞價值偏低[6]。將臺灣含笑與其近緣種和遠(yuǎn)源種進(jìn)行雜交育種，有望改善臺灣含笑的觀賞性狀，提高臺灣含笑的利用價值。

近年來，國內(nèi)學(xué)者在含笑屬植物雜交育種方面取得了一定進(jìn)展。例如：龔洵等[7]以云南含笑(M.yunnanensisFranch. ex Finet et Gagnep.)為母本、灰?guī)r含笑(M.calcicolaC. Y. Wu)為父本進(jìn)行雜交育種，成功育成‘雛菊含笑’(‘Chuju hanxiao’)和‘春月含笑’(‘Chunyue hanxiao’)2個新品種。研究表明：木蘭科植物存在屬間遠(yuǎn)緣雜交親和性，尤其是玉蘭屬(YulaniaSpach)與含笑屬的雜交。例如：二喬玉蘭〔Y.×soulangeana(Soul.-Bod.) D. L. Fu〕與南亞含笑(M.doltsopaBuch.-Ham. ex DC.)以及紫玉蘭〔Y.liliiflora(Desr.) D. L. Fu〕與云南含笑具有雜交親和性，不存在生殖隔離[8]；‘紅元寶’玉蘭(Magnoliasoulangeana‘Hongyuanbao’)與金葉含笑(M.foveolataMerr. ex Dandy)也具有雜交親和性[9]。然而，目前關(guān)于木蘭科植物的屬間遠(yuǎn)緣雜交和屬內(nèi)種間雜交育種研究較少[10]，應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)研究。

為此，本文比較了不同質(zhì)量濃度蔗糖和硼酸組合以及不同質(zhì)量濃度CaCl2固體培養(yǎng)基對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響；對臺灣含笑及同屬植物深山含笑(M.maudiaeDunn)和闊瓣含笑〔M.cavalerieivar.platypetala(Hand.-Mazz.) N. H. Xia〕以及玉蘭屬植物白玉蘭〔Y.denudata(Desr.) D. L. Fu〕的花粉活力進(jìn)行比較，并對臺灣含笑同株異花授粉組、臺灣含笑異株授粉組及以臺灣含笑為母本的3個雜交組的雜交親和性和結(jié)實(shí)情況進(jìn)行觀察和比較，以期為臺灣含笑的育種和遺傳改良奠定研究基礎(chǔ)，并為木蘭科含笑屬的種間雜交和遠(yuǎn)緣雜交提供新證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2021年在江蘇省中國科學(xué)院植物研究所苗圃地(東經(jīng)118°49′52.67″、北緯32°03′32.96″，海拔40 m)進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。該研究地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，年降水量1 200 mm，年均氣溫15.4 ℃，年無霜期250 d左右，年均日照時數(shù)1 933.0 h。

各雜交組的母本為種植于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所苗圃地中長勢一致的5株樹齡20 a的臺灣含笑植株。臺灣含笑同株異花授粉組的花粉采自江蘇省中國科學(xué)院植物研究所苗圃地內(nèi)1株樹齡20 a的臺灣含笑實(shí)生苗，臺灣含笑異株授粉組的花粉采自南京中山植物園薔薇園內(nèi)1株樹齡40 a的臺灣含笑實(shí)生苗，臺灣含笑×白玉蘭組的花粉采自南京中山植物園薔薇園內(nèi)1株樹齡60 a的白玉蘭植株，臺灣含笑×深山含笑組的花粉采自南京祿口機(jī)場內(nèi)1株樹齡35 a的深山含笑植株，臺灣含笑×闊瓣含笑組的花粉采自南京中山植物園球宿根花卉園內(nèi)1株樹齡12 a的闊瓣含笑植株。所有供試植株均長勢良好，無病蟲害且能夠正常開花結(jié)實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集 于2021年2月至3月，分別在各種類供試植株的盛花期(植株45%以上的花開放)采摘未完全綻放的新鮮花朵，每株樣株各采摘約50朵花；除去花被片，將帶有雄蕊群的花柱置于硫酸紙上，置于陰涼通風(fēng)處，等待藥室張開，花粉自然散落；收集花粉，于4 ℃干燥條件下保存、備用。每個種類重復(fù)取樣3次。

1.2.2 不同固體培養(yǎng)基配方對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響 分別對不同質(zhì)量濃度蔗糖和硼酸組合固體培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖，pH 7.0)中臺灣含笑的花粉萌發(fā)情況進(jìn)行比較，設(shè)置蔗糖質(zhì)量濃度50、100、150和200 g·L-1，硼酸質(zhì)量濃度100、200、300和400 mg·L-1，共16個組合，以不含蔗糖和硼酸的固體培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖，pH 7.0)為對照。此外，以含150 g·L-1蔗糖、100 mg·L-1硼酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基(pH 7.0)為基本培養(yǎng)基，對添加質(zhì)量濃度0(對照)、100、200、300和400 mg·L-1CaCl2的培養(yǎng)基中臺灣含笑的花粉萌發(fā)情況進(jìn)行了比較。每個處理培養(yǎng)花粉約0.1 g，于25 ℃避光條件下培養(yǎng)8 h后，在OLYMPUS BX53F顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察花粉萌發(fā)情況。以花粉管長度大于花粉直徑作為花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計萌發(fā)花粉數(shù)，據(jù)此計算花粉萌發(fā)率，計算公式為花粉萌發(fā)率=(視野內(nèi)的萌發(fā)花粉數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù))×100%。使用Mage Analysis System V1.1.4軟件測量花粉管長度。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)至少統(tǒng)計5個視野中的花粉。

1.2.3 不同雜交組父本花粉活力比較 參考前人的研究結(jié)果[11-13]設(shè)置不同父本的固體培養(yǎng)基配方。闊瓣含笑花粉使用含質(zhì)量濃度100 g·L-1蔗糖和100 mg·L-1硼酸的固體培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖，pH 6.0)進(jìn)行培養(yǎng)，深山含笑花粉使用含質(zhì)量濃度150 g·L-1蔗糖、300 mg·L-1硼酸和300 mg·L-1CaCl2的固體培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖，pH 5.0)進(jìn)行培養(yǎng)，白玉蘭花粉使用含質(zhì)量濃度10 g·L-1蔗糖和200 mg·L-1硼酸的固體培養(yǎng)基(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖，pH 6.4)進(jìn)行培養(yǎng)，臺灣含笑花粉使用前面實(shí)驗(yàn)篩選的最適固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每個處理培養(yǎng)花粉約0.1 g，于25 ℃避光條件下培養(yǎng)8 h后，在OLYMPUS BX53F顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。統(tǒng)計萌發(fā)花粉數(shù)，據(jù)此計算花粉萌發(fā)率，根據(jù)花粉萌發(fā)率判斷花粉活力。使用Mage Analysis System V1.1.4軟件測量花粉管長度。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)至少統(tǒng)計5個視野中的花粉。

1.2.4 人工授粉 人工授粉實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5個雜交組，即臺灣含笑同株異花授粉組、臺灣含笑異株授粉組、臺灣含笑×白玉蘭組、臺灣含笑×深山含笑組和臺灣含笑×闊瓣含笑組。參照李穎婕[14]的方法，在臺灣含笑盛花期選擇母本樣株朝陽方位的單花，在單花的花蕾期人工去雄后授粉，及時套袋并掛牌記錄。每個雜交組合授粉70朵花。

1.2.5 不同雜交組雜交親和性觀察 采用苯胺藍(lán)熒光染色法[15，16]觀察不同雜交組的花粉在臺灣含笑柱頭上的萌發(fā)情況和花粉管的伸長情況。分別在授粉后1、2、3、4、6、8、10、12 h以及1、2、3、4、6、8 d取柱頭，浸入裝有FAA固定液〔V(甲醛)∶V(冰乙酸)∶V(體積分?jǐn)?shù)50%乙醇)=1∶1∶8〕的離心管中至少24 h。每個雜交組每次取3個柱頭。

將固定好的雌蕊輕輕分離出來，使用ddH2O清洗2～3次后，浸入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)5%NaOH溶液中，并置于60 ℃恒溫水浴中軟化脫色4 h；再使用ddH2O清洗2～3次后，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%苯胺藍(lán)溶液遮光染色10 min；用吸水紙吸去雌蕊表面多余的染液，在干凈的載玻片上滴1～2滴甘油，壓片后在OLYMPUS BX53F顯微鏡的紫外光源下觀察花粉在柱頭上的萌發(fā)情況和花粉管的伸長情況并拍照。

1.2.6 不同雜交組結(jié)實(shí)情況分析 于2021年5月下旬至6月上旬(即臺灣含笑生理落果結(jié)束后)統(tǒng)計各雜交組的坐果數(shù)，參照王澤翻等[17]的方法計算坐果率，計算公式為坐果率=(坐果總數(shù)/授粉花朵總數(shù))×100%。

同年10月中旬采集各雜交組的成熟果實(shí)(心皮開始開裂、假種皮變紅)，分別記錄各雜交組的成熟果實(shí)總數(shù)及心皮總數(shù)和結(jié)實(shí)心皮總數(shù)，參照王澤翻等[17]的方法計算結(jié)實(shí)率和心皮結(jié)籽率，計算公式分別為結(jié)實(shí)率=(成熟果實(shí)總數(shù)/授粉花朵總數(shù))×100%和心皮結(jié)籽率=(結(jié)實(shí)心皮總數(shù)/心皮總數(shù))×100%。

將收集的果實(shí)置于陰涼通風(fēng)處，待心皮自然開裂后剝出種子，用自來水浸泡2 d左右，待假種皮變軟后將其洗去，統(tǒng)計各雜交組的種子總數(shù)。將種子晾干，隨機(jī)選取50粒種子，使用萬分之一分析天平稱量總質(zhì)量，重復(fù)稱量5次，結(jié)果取平均值。根據(jù)稱量結(jié)果計算種子的千粒質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

分別使用EXCEL 2010和Data Processing System 18.10軟件對花粉萌發(fā)率和種子千粒質(zhì)量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同固體培養(yǎng)基配方對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響

2.1.1 不同質(zhì)量濃度蔗糖和硼酸組合對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響 統(tǒng)計結(jié)果表明：臺灣含笑花粉在不含蔗糖和硼酸的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h未萌發(fā)，而在含不同質(zhì)量濃度蔗糖和硼酸的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h均能夠萌發(fā)，各培養(yǎng)基中花粉的萌發(fā)率和花粉管長度見表1。由表1可見：在含150 g·L-1蔗糖和100 mg·L-1硼酸的固體培養(yǎng)基中，臺灣含笑的花粉萌發(fā)率最高(46.4%)，花粉管長度為236.0 μm；在含200 g·L-1蔗糖和200 mg·L-1硼酸的固體培養(yǎng)基中，臺灣含笑的花粉萌發(fā)率最低(22.2%)，花粉管長度最短(95.5 μm)。

由表1還可見：當(dāng)固體培養(yǎng)基中硼酸質(zhì)量濃度一定時，臺灣含笑的花粉萌發(fā)率和花粉管長度總體上隨著蔗糖質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)明顯的“單峰型”變化趨勢；而當(dāng)固體培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度一定時，臺灣含笑的花粉萌發(fā)率和花粉管長度卻未隨著硼酸質(zhì)量濃度升高表現(xiàn)出明顯的變化趨勢。說明蔗糖質(zhì)量濃度對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響較大。

表1 含不同質(zhì)量濃度蔗糖和硼酸的固體培養(yǎng)基對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響

2.1.2 不同質(zhì)量濃度CaCl2對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響 統(tǒng)計結(jié)果(表2)表明：當(dāng)固體培養(yǎng)基中不含CaCl2時，臺灣含笑的花粉萌發(fā)率最高(44.6%)，花粉管長度最長(260.1 μm)?？傮w來看，隨著CaCl2質(zhì)量濃度升高，臺灣含笑的花粉萌發(fā)率和花粉管長度逐漸降低。說明CaCl2對臺灣含笑的花粉萌發(fā)和花粉管伸長具有一定的抑制作用。

表2 含不同質(zhì)量濃度CaCl2的固體培養(yǎng)基對臺灣含笑花粉萌發(fā)的影響

2.2 不同雜交組父本花粉活力比較

根據(jù)5個雜交組父本花粉萌發(fā)率統(tǒng)計結(jié)果，同株異花授粉的臺灣含笑花粉活力最高(76.2%)；闊瓣含笑花粉活力較高(71.5%)；深山含笑和異株授粉的臺灣含笑花粉活力較低，分別為50.9%和46.4%；白玉蘭花粉活力最低(43.9%)。

2.3 不同雜交組的雜交親和性觀察

對5個雜交組的雜交親和性進(jìn)行熒光顯微觀察，發(fā)現(xiàn)不同雜交組花粉的初始萌發(fā)時間、大量萌發(fā)時間及花粉管到達(dá)子房的時間均存在一定差異。

臺灣含笑同株異花授粉組花粉的初始萌發(fā)時間最早，在授粉6 h開始萌發(fā)，在授粉2 d大量萌發(fā)；花粉管在授粉3 d匯成一束，到達(dá)花柱1/3處；花粉的整個萌發(fā)過程在5個雜交組中最長，花粉管在授粉8 d才能到達(dá)子房位置(圖版Ⅰ-1～4)。

臺灣含笑異株授粉組花粉的初始萌發(fā)時間較早，在授粉1 d開始萌發(fā)，在授粉2 d大量萌發(fā)；花粉管在授粉3 d匯成一束，到達(dá)花柱1/3處；花粉的整個萌發(fā)過程較長，花粉管在授粉6 d到達(dá)子房位置(圖版Ⅰ-5～8)。

臺灣含笑×白玉蘭組花粉的初始萌發(fā)時間最晚且整個萌發(fā)過程較短，在授粉4 d才開始萌發(fā)并迅速大量萌發(fā)，花粉管內(nèi)堆積大量胼胝質(zhì)，阻礙花粉管的繼續(xù)伸長；僅有少數(shù)花粉管在授粉6 d能夠到達(dá)子房位置(圖版Ⅰ-9，10)。

臺灣含笑×深山含笑組花粉的萌發(fā)時間較早且整個萌發(fā)過程較短，在授粉1 d開始萌發(fā)，在授粉2 d大量萌發(fā)，且花粉管快速伸長并匯成一束，到達(dá)花柱1/3處；花粉管在授粉4 d即到達(dá)子房位置(圖版Ⅰ-11～13)。

臺灣含笑×闊瓣含笑組花粉的整個萌發(fā)進(jìn)程較短，在授粉2 d開始萌發(fā)并迅速大量萌發(fā)，花粉管在授粉3 d匯成一束；花粉管在授粉4 d到達(dá)子房位置(圖版Ⅰ-14～16)。

2.4 不同雜交組的結(jié)實(shí)情況分析

對5個雜交組的結(jié)實(shí)情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表3；各雜交組的成熟果實(shí)見圖版Ⅰ-17。

統(tǒng)計結(jié)果表明：各雜交組生理性落果結(jié)束后，臺灣含笑同株異花授粉組和臺灣含笑×闊瓣含笑組的坐果率最高，均為100.0%；臺灣含笑×深山含笑組和臺灣含笑異株授粉組的坐果率較高，分別為75.0%和72.2%；臺灣含笑×白玉蘭組的果實(shí)完全脫落，坐果率為0.0%。各雜交組的結(jié)實(shí)率與坐果率接近，同樣表現(xiàn)為臺灣含笑同株異花授粉組和臺灣含笑×闊瓣含笑組的結(jié)實(shí)率明顯高于其他雜交組，臺灣含笑×深山含笑組和臺灣含笑異株授粉組的結(jié)實(shí)率相近。

各雜交組的心皮結(jié)籽率和種子千粒質(zhì)量也表現(xiàn)出明顯差異。臺灣含笑同株異花授粉組的心皮結(jié)籽率最高，達(dá)84.4%，但該雜交組的種子千粒質(zhì)量最低，僅87.0 g；臺灣含笑×闊瓣含笑組和臺灣含笑×深山含笑組的心皮結(jié)籽率相近，分別為50.3%和50.2%，這2個雜交組的種子千粒質(zhì)量顯著高于其他雜交組，分別為127.5和123.2 g；臺灣含笑異株授粉組的心皮結(jié)籽率最低(43.6%)，種子千粒質(zhì)量居中(101.2 g)。

表3 臺灣含笑不同雜交組的結(jié)實(shí)情況

3 討 論

3.1 不同雜交父本的花粉活力差異

花粉活力高低是影響植物授粉成功與否的關(guān)鍵因子。高活性的花粉可以提高結(jié)實(shí)率，然而，由于受物種自身以及保存環(huán)境的濕度、溫度、大氣成分和大氣壓力等因子的影響，植物的花粉活力往往不能長久保持[18]，不利于花期不同的物種間的雜交。因此，明確雜交父本的花粉活力是分析植物雜交親和性的重要依據(jù)，也是避免因花粉活力低而導(dǎo)致結(jié)實(shí)率低的重要技術(shù)措施。本研究結(jié)果表明：在相同保存條件下，闊瓣含笑的花粉活力最高，深山含笑的花粉活力較高，2個種類的花粉活力均在50%以上，而臺灣含笑和白玉蘭的花粉活力均低于50%，花粉更容易失去活性。與臺灣含笑異株授粉組相比，臺灣含笑同株異花授粉組的坐果率和心皮結(jié)實(shí)率均明顯提高，臺灣含笑×深山含笑組和臺灣含笑×闊瓣含笑組的坐果率和心皮結(jié)實(shí)率也明顯提高，說明高花粉活力是臺灣含笑雜交實(shí)驗(yàn)順利開展的重要前提。

3.2 不同雜交組的雜交親和性

雜交親和性熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)，雖然各雜交組的花粉萌發(fā)時間和花粉管伸長速度存在明顯差異，但這些雜交組的花粉均能夠在臺灣含笑柱頭上萌發(fā)；白玉蘭花粉萌發(fā)后積累了大量的胼胝質(zhì)，阻礙花粉管繼續(xù)伸長。說明白玉蘭、闊瓣含笑和深山含笑均可在臺灣含笑柱頭上萌發(fā)，且闊瓣含笑和深山含笑與臺灣含笑的雜交親和性高。對5個雜交組結(jié)實(shí)情況的統(tǒng)計結(jié)果顯示：臺灣含笑×白玉蘭雜交組未坐果，說明該雜交組不能夠正常結(jié)實(shí)，不具備雜交親和性；而臺灣含笑×闊瓣含笑和臺灣含笑×深山含笑2個雜交組均能夠正常結(jié)出飽滿種子且種子千粒質(zhì)量顯著高于其他雜交組，說明臺灣含笑與闊瓣含笑和深山含笑的雜交親和性較高。相關(guān)研究表明：染色體倍性差異直接影響不同物種間的雜交親和性[19]，倍性相同的物種往往比倍性差異較大的物種雜交親和性高[20]。研究發(fā)現(xiàn)，含笑屬植物染色體倍性較穩(wěn)定，均為二倍體，染色體數(shù)為38[21]，而木蘭屬植物染色體倍性差異較大，存在二倍體到六倍體多種染色體倍性，白玉蘭為四倍體，染色體數(shù)為76[22]。因此，推測染色體倍性差異可能是臺灣含笑與闊瓣含笑和深山含笑雜交親和性高、與白玉蘭不存在雜交親和性的重要原因，具體原因有待深入研究。

此外，物種間雜交不親和主要包括受精前雜交障礙和受精后雜交障礙2個方面。其中，受精前雜交障礙主要表現(xiàn)在花粉和柱頭不親和、花粉不能到達(dá)子房及無法成功受精等；受精后雜交障礙主要表現(xiàn)在胚胎敗育、提前落果、雜交種子萌發(fā)率低或不萌發(fā)以及雜交后代植株不能正常生長等[23，24]。白玉蘭花粉雖然能夠在臺灣含笑柱頭上大量萌發(fā)，但在授粉后由于胼胝質(zhì)異常沉積，導(dǎo)致多數(shù)花粉管變短、變粗，伸長異常，無法進(jìn)入子房完成受精過程，僅少數(shù)花粉能順利到達(dá)子房，完成受精過程，但果實(shí)卻在生理落果期全部脫落，沒有獲得成熟果實(shí)，因此，臺灣含笑與白玉蘭雜交不親和的主要原因是二者存在受精前雜交障礙，并存在一定程度的受精后雜交障礙。

綜上所述，臺灣含笑與同屬種類深山含笑和闊瓣含笑的雜交親和性較高，后期可以臺灣含笑為核心種質(zhì)開展含笑屬植物的種質(zhì)創(chuàng)新和雜交育種研究。另外，雖然臺灣含笑與玉蘭屬種類白玉蘭存在雜交不親和問題，但其與玉蘭屬其他種類的雜交親和性尚不清楚，有待深入研究。