CACNA2D3在順鉑誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究*

田雨鑫 李壯壯 王菁菁 馮艷梅 陳正儂

順鉑(cisplatin)廣泛應(yīng)用于癌癥的治療,但其耳毒性副作用的平均發(fā)生率超過60%，限制了其臨床應(yīng)用[1]。順鉑導(dǎo)致的耳毒性呈永久性、進(jìn)行性，主要損害耳蝸Corti器的毛細(xì)胞造成聽力損失[2]，極大降低了患者的生活質(zhì)量[3]。順鉑致聽力損失的主要機(jī)制是活性氧的積累[4, 5]，此外，細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、自噬、炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均參與了此過程[2]，但順鉑致耳毒性的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，至今尚未完全了解。α2δ屬于電壓門控鈣通道調(diào)節(jié)亞基家族，由CACNA2D1-4基因編碼，CACNA2D3作為調(diào)節(jié)亞基可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[6]，Ca2+在細(xì)胞損傷或應(yīng)激時(shí)可激活細(xì)胞凋亡和自噬[7]。然而，CACNA2D3在順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡和自噬過程中的作用尚不明確，本研究擬借助短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)技術(shù)敲減毛細(xì)胞系(House Ear Institute-Organ of Corti 1 cells, HEI-OC1)細(xì)胞中CACNA2D3的表達(dá)，從而探討CACNA2D3在順鉑耳毒性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1耳蝸毛細(xì)胞系(House Ear Institute-Organ of Corti 1 cells, HEI-OC1)細(xì)胞培養(yǎng) HEI-OC1來自美國(guó)加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校，在含10%胎牛血清(Gibco,美國(guó))且不含任何抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基(生工，中國(guó))中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：10%二氧化碳、33 ℃)。

1.2shRNA轉(zhuǎn)染 上海佐潤(rùn)生物技術(shù)公司合成了小鼠shRNA-CACNA2D3質(zhì)粒，序列正義鏈：CCGGGCACCCATTGAAATCAGGTATCTCGAGATACCTGATTTCAATGGGTGCTTTTTG，反義鏈：AATTCAAAAAGCACCCATTGAAATCAGGTATCTCGAGATACCTGATTTCAATGGGTGC。100 μl Opti-MEM加2 μl LipofectamineTM2 000，混勻5分鐘加入100 μl Opti-MEM與 2 ug質(zhì)粒(1 ug PLKO.1質(zhì)粒+ 0.75 psPAX2 +0.25 ug pMD2.G)的混合液中，混勻25分鐘后加入密度約60%的293T細(xì)胞培養(yǎng)皿，進(jìn)行24 h培養(yǎng)獲取病毒上清；HEI-OC1細(xì)胞密度長(zhǎng)至約30%時(shí)，將收集好的病毒上清和新鮮培養(yǎng)基按1∶1的比例加至細(xì)胞培養(yǎng)體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，而后利用嘌呤霉素(1∶2 000)進(jìn)行細(xì)胞篩選。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 分為四組：①sh-Vector(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照)+正常培養(yǎng)組；②sh-Cac3(轉(zhuǎn)染shRNA-CACNA2D3)+正常培養(yǎng)組；③sh-Vector +順鉑干預(yù)組；④sh-Cac3 +順鉑干預(yù)組。所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均進(jìn)行24 h預(yù)培養(yǎng)，而后正常培養(yǎng)組更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，順鉑干預(yù)組更換為含20 μM順鉑(Sigma,美國(guó))的培養(yǎng)基處理24 h。

1.4細(xì)胞活力檢測(cè) 利用CCK8試劑盒(MCE,中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞活力。將HEI-OC1細(xì)胞以2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行24小時(shí)預(yù)培養(yǎng)。用含0、5、10、20、30 μM順鉑的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行順鉑干預(yù)處理，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h；造模結(jié)束后，吸干原有培養(yǎng)基，快速加入110 μl/孔CCK8稀釋溶液(新鮮培養(yǎng)基：CCK8試劑=10∶1)，培養(yǎng)箱避光孵育1小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HEI-OCT細(xì)胞凋亡 利用JC-1試劑盒(碧云天，中國(guó))檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)，AnnexinV-FITC/PI試劑盒(BD，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)luo-3AM(碧云天，中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。四組細(xì)胞造模結(jié)束后，棄去細(xì)胞原有培養(yǎng)液，用預(yù)冷4℃ PBS溶液輕柔洗滌一遍，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化液(Gibco，美國(guó))消化收集細(xì)胞。參照說明書進(jìn)行熒光探針裝載，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.6Tunel染色 使用Tunel試劑盒(Roche，美國(guó))進(jìn)行染色。培養(yǎng)皿中滴入細(xì)胞培養(yǎng)基，放置細(xì)胞爬片使其吸附于板底，加入細(xì)胞懸液進(jìn)行孵育，獲取細(xì)胞爬片后,固定液15～25 ℃孵育1小時(shí)，PBS洗滌一次后封閉液孵育10分鐘，再次PBS洗滌；而后置于冰上破膜液孵育2分鐘，PBS洗滌2次，擦干樣品周圍水分，每個(gè)樣品加入50 μl Tunel反應(yīng)混合液(45 μl TUNEL Label solution + 5 μl TUNEL Enzyme solution)，避光濕盒中37 ℃孵育1 h；最后PBS洗滌三次，DAPI進(jìn)行染色封片，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察各組細(xì)胞Tunel染色陽性率。所有工作液配制嚴(yán)格遵照說明書。

1.7Western blot檢測(cè) RIPA裂解液(碧云天，中國(guó))以100∶1混合蛋白酶抑制劑，進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取，用BCA試劑盒(雅酶，中國(guó))進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后，每孔加入等量等體積樣品(>30 μg)進(jìn)行蛋白電泳，NC膜轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；對(duì)應(yīng)一抗4℃孵育過夜(anti-CACNA2D3 10 mg/ml, Novus Biological, 美國(guó); anti-Bcl2 1∶1 000, Abclonal,中國(guó); anti-Cleaved PARP1 1∶1 000, Abclonal, 中國(guó); anti-ACTB 1∶50 000, Abclonal, 中國(guó); anti-LC3Ⅱ 1∶2 000, abcam, 美國(guó))，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h(HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG (H+L) antibody 1∶5 000, Abclonal, 中國(guó))。 凝膠自動(dòng)成像儀曝光處理，Imgae軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。采用GraphPad Prism 8.2和SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEMs)表示。

2 結(jié)果

2.1順鉑干預(yù)后HEI-OC1細(xì)胞CACNA2D3蛋白表達(dá)水平降低 由圖1可見細(xì)胞活力下降與順鉑作用濃度和時(shí)間呈依賴性，20 μM順鉑處理24 h引起的HEI-OC1細(xì)胞損傷程度適中，細(xì)胞存活率為48%±0.88%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此干預(yù)條件。20 μM順鉑干預(yù)24 h，HEI-OC1細(xì)胞CACNA2D3的蛋白水平表達(dá)顯著降低(圖1，P<0.001)，表明CACNA2D3可能參與調(diào)控HEI-OC1細(xì)胞順鉑損傷過程。

2.2CACNA2D3敲減增強(qiáng)了順鉑導(dǎo)致的HEI-OC1細(xì)胞凋亡 利用shRNA技術(shù)敲減CACNA2D3，Western blot檢測(cè)CACNA2D3的表達(dá)(圖2a)。應(yīng)用JC-1試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞MMP，以此評(píng)估細(xì)胞早期凋亡情況。如圖2b示，正常培養(yǎng)條件下，CACNA2D3敲減對(duì)細(xì)胞MMP無影響，但順鉑干預(yù)后，sh-Cac3細(xì)胞MMP降低程度高于sh-Vector細(xì)胞(P<0.01)。

圖1 順鉑處理后CACNA2D3蛋白水平表達(dá)降低 a.不同濃度順鉑處理不同時(shí)間后細(xì)胞存活率; b. Western blot示順鉑處理后CAC-NA2D3表達(dá)降低(???P<0.001)

圖2 CACNA2D3調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡 a. shRNA技術(shù)敲減HEI-OC1細(xì)胞中CACNA2D3,Western blot證實(shí)敲減效率(P<0.01); b. JC-1檢測(cè)線粒體膜電位變化以此評(píng)估細(xì)胞早期凋亡情況(??P<0.01)

通過流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、Tunel染色多方驗(yàn)證各組細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CACNA2D3敲減對(duì)HEI-OC1細(xì)胞凋亡無影響，但促進(jìn)了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(9.41±0.66% vs 11.53±0.45%, 圖3a，P<0.01)。Western blot檢測(cè)經(jīng)典凋亡相關(guān)分子的蛋白水平(圖3b)，發(fā)現(xiàn)順鉑干預(yù)后sh-Cac3細(xì)胞Bcl2的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而Cleaved-PARP1的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。同時(shí)，Tunel染色法發(fā)現(xiàn)sh-Cac3細(xì)胞Tunel陽性率明顯高于sh-Vector細(xì)胞(3.08±0.14% vs 6.40±0.43%，圖4,P<0.001)。綜上所述，CACNA2D3敲減增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡。

2.3CACNA2D3敲減調(diào)節(jié)鈣相關(guān)自噬增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)示，與sh-Vector細(xì)胞相比，sh-Cac3細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平顯著降低(圖5a,P<0.05)。順鉑干預(yù)后，sh-Vector細(xì)胞和sh-Cac3細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均升高，但前者的增長(zhǎng)更為明顯(圖5a,P<0.01);此外，如圖5b所示，順鉑干預(yù)組LC3-II的表達(dá)明顯高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)，而順鉑干預(yù)后sh-Cac3細(xì)胞的自噬流明顯高于sh-Vector細(xì)胞(P<0.01);表明自噬參與了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而CACNA2D3可能通過調(diào)節(jié)鈣相關(guān)自噬參與其中。

圖3 CACNA2D3敲減增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 a.四組細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)凋亡分析(??P<0.01); b.四組細(xì)胞Cleaved-PARP1和Bcl2蛋白水平的Western blot檢測(cè)(??P<0.01)

圖4 Tunel染色凋亡細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果(×20)(???P<0.001)

圖5 CACNA2D3敲減調(diào)節(jié)Ca2+相關(guān)自噬影響順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 a.Fluo-3AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(??P<0.01); b. Western blot四組細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白水平(??P<0.01)

3 討論

長(zhǎng)期以來，細(xì)胞內(nèi)Ca2+被認(rèn)為是促進(jìn)各種細(xì)胞死亡過程的重要因素[8],近年來，越來越多的證據(jù)證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+在自噬中的作用[9]。CACNA2D3作為電壓門控鈣通道調(diào)節(jié)亞基可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,然而，CACNA2D3調(diào)控的Ca2+水平與順鉑耳毒性中細(xì)胞凋亡、自噬的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

先前的研究證實(shí)了CACNA2D3在耳蝸中的表達(dá)，表明CACNA2D3對(duì)于維持聽神經(jīng)突觸的正常結(jié)構(gòu)和功能是必不可少的[10]。此外，CACNA2D3通過誘導(dǎo)Ca2+介導(dǎo)的凋亡，在多種腫瘤中具有潛在的腫瘤抑制功能[6, 11]。與之前的報(bào)道一致，本研究發(fā)現(xiàn)CACNA2D3敲減可降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度。Nie等[6]在對(duì)食管鱗癌研究時(shí)發(fā)現(xiàn)CACNA2D3過表達(dá)顯著增加了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但本研究結(jié)果顯示CACNA2D3低表達(dá)增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡。既往研究表明，線粒體內(nèi)Ca2+超載可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12],同時(shí)，通過對(duì)各種Ca2+激活刺激的研究，發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度增加的最終作用是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬激活[13]；Liu等[14]研究表明CACNA2D3可以促進(jìn)小鼠細(xì)胞自噬，以保護(hù)小鼠免受結(jié)核感染。雖然目前還不清楚這些過程是如何轉(zhuǎn)換和協(xié)調(diào)的，但由此可見細(xì)胞凋亡和自噬具有相同的刺激因子和調(diào)節(jié)蛋白，只是誘導(dǎo)閾值不同[15]，因此，本研究的發(fā)現(xiàn)與既往研究并不矛盾。此外，不同的研究結(jié)果可能是由于腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞的代謝差異，而激活不同的Ca2+信號(hào)途徑所導(dǎo)致。

自噬與多種調(diào)控通路信號(hào)機(jī)制相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞死亡；既往研究發(fā)現(xiàn)自噬可在順鉑誘導(dǎo)的耳毒性中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]，而另一些研究表明自噬可以降低順鉑對(duì)大鼠和斑馬魚的耳毒性[17, 18]。此外，已明確自噬是預(yù)防氨基糖苷誘導(dǎo)毛細(xì)胞死亡的潛在新治療靶點(diǎn)[19]。雖然，自噬在順鉑耳毒性中的作用尚未統(tǒng)一，CACNA2D3也可能參與自噬之外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[6, 20],但本研究結(jié)果至少表明，抑制鈣相關(guān)自噬是CACNA2D3敲減增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)耳毒性的機(jī)制之一；同時(shí)為耳蝸毛細(xì)胞順鉑損傷后CACNA2D3調(diào)控Ca2+水平與細(xì)胞凋亡及自噬的關(guān)系提供了新的視角。未來的研究應(yīng)繼續(xù)確定下游靶點(diǎn)，進(jìn)一步探索CACNA2D3調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化與凋亡、自噬之間的關(guān)系，并在動(dòng)物身上進(jìn)行驗(yàn)證，為了解順鉑致耳毒性的病理生理機(jī)制和治療方案提供潛在的靶點(diǎn)。