SOX2、SOX7蛋白在喉癌及癌旁組織中的表達(dá)及其臨床意義

孟欣雨 崔穎 穆蘭 劉瑤

SOX基因家族是具有高遷移率族( HMG)特征性結(jié)構(gòu)域的一類基因，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。近年來備受關(guān)注的SOX2基因，現(xiàn)已確定為鱗狀細(xì)胞癌癌基因譜[1]。SOX7作為抑癌基因，參與Wnt通路的異常表達(dá)，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如在胃癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中有相關(guān)的報(bào)道[2,3]，但其在喉癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系尚未報(bào)道。因此，本研究通過免疫組化染色檢測喉癌及其對應(yīng)癌旁正常上皮組織中SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1蛋白的表達(dá)，初步探討SOX2、SOX7、β-catenin及CyclinD1蛋白與喉癌臨床病理特征的關(guān)系，并通過組間關(guān)聯(lián)性分析上述四種蛋白在喉癌中表達(dá)關(guān)聯(lián)性，以期為喉癌的發(fā)生發(fā)展提供一個(gè)初步的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科2019年1月～2020年7月的65例手術(shù)切除且病理學(xué)診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌患者的石蠟切片，其中40例患者對應(yīng)癌旁正常上皮組織(距癌腫切緣0.5 cm以上，經(jīng)病理確認(rèn))。所有患者均為初次治療且術(shù)前均未行放化療治療。其中，男60例，女5例，年齡47～81歲，平均年齡61.11歲，其中≥60歲39例，<60歲26例；分期：T1期10例，T2期23例，T3期23例，T4期9例；聲門上型18例，聲門型47例；分化程度：高分化30例，中分化30例，低分化5例；術(shù)后病理回報(bào)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例。所有患者吸煙史、飲酒史均以全或無為標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均已簽署知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人SOX7多克隆抗體；兔抗人SOX2多克隆抗體；兔抗人β-catenin單克隆抗體；兔抗人CyclinD1單克隆抗體(上海安研商貿(mào)有限公司，AY-015621R，1∶200)，山羊抗兔多克隆抗體(上海安研商貿(mào)有限公司，AY-015621R，1∶100)；DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3染色方法 本研究采用免疫組化法檢測各個(gè)組織中SOX2和SOX7蛋白的表達(dá)情況。具體檢測步驟：(1)將恒溫箱預(yù)熱到60 ℃，石蠟切片放入后再烘烤2 h；脫蠟：二甲苯I (5 min)、二甲苯II (5 min)、二甲苯III (5 min)；水化：無水乙醇 (10 min×2)、95%乙醇 (10 min×2)、蒸餾水 (5 min×2)；加3%H2O2溶液于室溫孵育(10 min)；蒸餾水泡洗(2 min×3)；熱抗原修復(fù)：選擇微波爐加熱法。先將0.01 M抗原修復(fù)液，微波700 W加熱(5 min)至沸騰狀態(tài)，把片子放修復(fù)液中，再次200 W加熱(2 min)，加熱完成后置于室溫自然冷卻。PBS洗滌(5 min×2)；室溫條件下，加山羊血清封閉(60 min)；甩凈擦干片子上液體，拿組化筆圈出標(biāo)記位置；滴加一抗(1∶200)后放免疫組化濕盒中，4 ℃孵育過夜；隔天將片子復(fù)溫到室溫，PBS溶液浸泡(5 min×3)；加二抗(1∶100)，20～37 ℃孵育(45 min)；PBS溶液洗滌(5 min×3)；在20～37 ℃環(huán)境中加SABC-POD工作液后靜置(30 min)；PBS溶液洗滌(5 min×4)；DAB室溫下反應(yīng)(20 min)，鏡下觀察標(biāo)記位置著色而背景未著色時(shí)，適時(shí)自來水沖洗終止反應(yīng)；復(fù)染：加蘇木精(1 min)后自來水沖洗; 梯度酒精脫水；透明：分別浸泡在二甲苯I、二甲苯II;封片：片子上滴中性樹脂，覆上蓋玻片，晾干后于四周涂抹透明指甲油。免疫組化陰性對照：0.01 MPBS-0.01% Triton液替代一抗，其他條件不變。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)；組間關(guān)聯(lián)性采用關(guān)聯(lián)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1在喉癌組織和癌旁正常上皮組織中的表達(dá) SOX2、β-catenin及CyclinD1蛋白的在喉癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常上皮組織，而SOX7蛋白的陽性表達(dá)率在喉癌組織中明顯低于癌旁正常上皮組織(表1、圖1)。

表1 喉癌和癌旁正常上皮組織中SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1的陽性表達(dá)例數(shù)(例，%)

2.2SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1在喉癌中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 在65例喉鱗癌樣本中，SOX7、SOX2、β-catenin、CyclinD1蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及T分期具有相關(guān)性(P<0.05)，而與年齡、性別、吸煙、飲酒、分化程度及臨床分型無相關(guān)性(表2)。

圖1 SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1在喉癌和癌旁正常組織中的表達(dá)(DAB法×200)

表2 喉癌中SOX2、SOX7、β-catenin和CyclinD1的表達(dá)與臨床及病理學(xué)特征的關(guān)系(例)

2.3SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1蛋白在喉癌組織中表達(dá)的組間關(guān)聯(lián)性分析 在65例喉癌樣本中，SOX2和β-catenin蛋白同時(shí)陽性表達(dá)44例，同時(shí)陰性表達(dá)14例；SOX2和CyclinD1蛋白同時(shí)陽性表達(dá)46例，同時(shí)陰性表達(dá)15例；β-catenin和CyclinD1蛋白同時(shí)陽性表達(dá)42例，同時(shí)陰性表達(dá)14例；SOX7和β-catenin蛋白同時(shí)陽性表達(dá)16例，同時(shí)陰性表達(dá)8例；SOX7和CyclinD1蛋白同時(shí)陽性表達(dá)13例，同時(shí)陰性表達(dá)4例(表3～6)。

表3 在喉癌組織中SOX2與β-catenin、CyclinD1的組間等級相關(guān)分析(例)

表4 喉癌組織中β-catenin與CyclinD1的組間等級相關(guān)分析

表5 在喉癌組織中SOX7與β-catenin、CyclinD1的組間等級相關(guān)分析(例)

表6 在喉癌組織中SOX2與SOX7蛋白的組間關(guān)聯(lián)性分析(例)

3 討論

研究證明，SOX2蛋白在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)，如乳腺癌[4]、肺癌[5]等。Attramadal等[6]發(fā)現(xiàn)88%的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者出現(xiàn)SOX2蛋白高表達(dá)。Bass等[7]采用定量RT-PCR檢測和RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明SOX2是肺和食管鱗狀細(xì)胞癌中的一種譜系存活癌基因，也證明了SOX2基因擴(kuò)增會增加食管和肺鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Aksoy等[8]提出SOX7基因的腫瘤抑制作用，在許多人類癌癥中發(fā)現(xiàn)SOX7基因的表達(dá)下調(diào)，而SOX7蛋白高表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖[9]。目前，SOX2、SOX7蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后報(bào)道尚少，且二者參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜。Wnt信號通路對細(xì)胞增殖和分化有重要調(diào)節(jié)作用[10]，β-catenin作為Wnt通路中關(guān)鍵性因子，可激活或抑制下游與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因如MMP-9及 CyclinD1等[11]，從而對腫瘤細(xì)胞的增殖起到了促進(jìn)或抑制作用。CyclinD1作為Wnt通路下游靶向基因，被認(rèn)為能促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，啟動DNA的合成，參與細(xì)胞的增生、分化和凋亡，其異常表達(dá)參與了人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究收集了手術(shù)切除且病理學(xué)診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌的65例石蠟切片，其中對應(yīng)癌旁正常上皮組織有40例，通過免疫組化染色檢測SOX2蛋白在喉癌組織中表達(dá)陽性率為75.38%，明顯高于癌旁正常上皮組織(10.0%)，結(jié)合患者臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，SOX2蛋白表達(dá)水平與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與年齡、性別、吸煙、飲酒、分化程度以及臨床分型無相關(guān)性。Matsuoka等[12]、Sholl等[13]的研究中利用免疫組化染色方法發(fā)現(xiàn)SOX2蛋白在胃癌、肺癌等多種實(shí)體細(xì)胞腫瘤中均為高表達(dá)，且通過Wnt通路介導(dǎo)β-catenin、CyclinD1蛋白表達(dá)，本文結(jié)果與此一致，進(jìn)一步證實(shí)了SOX2蛋白在喉癌組織中通過Wnt經(jīng)典信號通路影響了β-catenin、CyclinD1蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)喉癌的發(fā)生、發(fā)展。而喉癌組織中SOX7蛋白的表達(dá)陽性率僅為41.54%，低于其在癌旁正常上皮表達(dá)的陽性率(72.50%)，結(jié)合患者臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，SOX7蛋白表達(dá)水平與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Costa等[14]報(bào)道稱SOX7作為抑癌基因，可通過與Wnt通路中的β-catenin 蛋白結(jié)合，抑制β-catenin表達(dá)，降低下游靶基因CyclinD1蛋白的表達(dá)，而抑制細(xì)胞異常增殖，在結(jié)直腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中也有類似報(bào)道。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)SOX7蛋白可抑制人SW480細(xì)胞中的Wnt信號通路，在mRNA和蛋白水平上抑制下游靶基因CyclinD1和 Survivin的表達(dá)，進(jìn)而證實(shí)了SOX7基因通過拮抗結(jié)直腸癌細(xì)胞中的Wnt信號而影響細(xì)胞正常的凋亡和增殖；Zhong等[16]通過實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化在前列腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了SOX7基因在mRNA和蛋白水平上的差異，證實(shí)了SOX7與β-catenin蛋白呈負(fù)相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中的β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)的陽性率明顯高于癌旁正常組織，且β-catenin、CyclinD1蛋白表達(dá)水平與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、性別、吸煙、飲酒、分化程度以及臨床分型無相關(guān)性；組間關(guān)聯(lián)性分析也提示β-catenin和cyclinD1與SOX2蛋白間呈正相關(guān)，而與SOX7蛋白呈負(fù)相關(guān)，且β-catenin與CyclinD1的表達(dá)呈正相關(guān)，SOX2與SOX7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)SOX2、β-catenin、CyclinD1蛋白在喉癌組織中呈高表達(dá)而其癌旁正常上皮組織中呈低表達(dá)，SOX7蛋白在喉癌組織中呈低表達(dá)而其癌旁正常上皮組織中呈高表達(dá)，分析SOX2、SOX7、β-catenin、CyclinD1蛋白與臨床病理特征之間的關(guān)系可知, 上述四種蛋白與喉癌的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在喉鱗狀細(xì)胞癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。深入研究SOX2、SOX7基因在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的參與機(jī)制，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來調(diào)控SOX2、SOX7基因的表達(dá)，從而抑制喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，可為今后喉鱗狀細(xì)胞癌患者的生物靶向治療提供了一個(gè)初步的理論依據(jù)。