陽離子型表面活性劑對赭曲霉毒素A熒光性質的影響

王婷，黃磊，呂新月，李濱汐，韓建剛，李胎花*

(1. 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037； 2. 江蘇洪澤湖濕地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，洪澤 223100； 3. 南京國環(huán)科技股份有限公司，南京 210018)

真菌毒素是由曲霉屬(Asperillussp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)等真菌產(chǎn)生的次級有毒代謝產(chǎn)物，常見的主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素等[1-3]。其中，赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素系列中分布最廣、毒性最強、產(chǎn)毒量和危害最大的真菌毒素。研究表明，OTA不僅對人類和動物具有致畸、致癌、致突變及免疫抑制作用，還具有腎毒性、肝毒性和神經(jīng)毒性[4-5]。由于OTA是一種化學穩(wěn)定和熱穩(wěn)定的化合物，能夠承受現(xiàn)代食品加工的物理化學條件，可以在宿主真菌根除后存活，且能夠通過食物鏈在人體內富集，在人體中有較長的半衰期，約為35 d[6]。有數(shù)據(jù)顯示，全球每年約25%的食物受到真菌毒素不同程度的污染，造成了巨大的經(jīng)濟損失[7]。鑒于OTA對人類健康的巨大危害及造成的經(jīng)濟損失，有必要開發(fā)可靠的方法來檢測真菌毒素。目前，OTA的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、熒光免疫分析法(FIA)等[8-10]；因此，充分認識OTA的光學性質可為開發(fā)OTA的檢測方法提供新的依據(jù)。

由于OTA結構式中苯丙氨酸部分的羧基和異香豆素部分的酚羥基，OTA的解離常數(shù)(pKa)范圍分別為4.2～4.4和7.0～7.3。在弱酸性溶液中和弱堿性溶液中，OTA分別以單陰離子(OTA-)和雙陰離子(OTA2-)形式存在，對應的最大吸收峰分別為波長330和380 nm，而熒光發(fā)射波長均為450 nm；因此，OTA的吸光度和熒光性質取決于其結構式中苯的丙氨酸羧基和酚羥基的去質子化狀態(tài)[11]。此外，有很多因素影響OTA的去質子化，如陽離子鹽、pH、蛋白質和陽離子表面活性劑等[10-13]。近年來，研究人員不斷地深入了解關于表面活性劑及反應體系酸堿度在熒光分析中的作用機理及規(guī)律性[14-15]。盡管表面活性劑和酸堿度對OTA本身熒光的影響方面已有研究[13]，但目前為止，人們對不同陽離子型表面活性劑對OTA光學性質的影響尚未進行系統(tǒng)研究。

聚乙烯亞胺(PEI)是具有單陽離子、雙陽離子和三陽離子3種形態(tài)的陽離子型表面活性劑，帶有很高的正電荷，PEI及其改性物具有固定陰離子性物質的作用[16]。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為季銨鹽型陽離子表面活性劑，具有水溶性好、耐酸堿和抗菌功效的特性，在其非極性區(qū)域含有正電荷[17]。聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)是一種高分子聚季銨鹽，具有正電荷密度高、結構性質穩(wěn)定且無毒等特點[18]。因此，筆者探討了在不同酸堿度條件下的3種陽離子型表面活性劑PEI、CTAB和PDDA對OTA熒光性質的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

OTA(分析純)和CTAB(相對分子質量62 000，純度≥99%)，購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；PEI(相對分子質量10 000，純度99%)和PDDA(相對分子質量100 000～200 000，質量分數(shù)20%)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實驗用水均為超純水，自制。實驗中的OTA溶于甲醇。

分別選用pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.4，8.0，9.0和10.0的緩沖溶液(20 mmol/L)。其中，pH 3.0，4.0 和5.0為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；pH 6.0為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖溶液；pH 7.0為磷酸鹽緩沖溶液；pH 7.4為3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS)緩沖溶液；pH 8.0為硼酸-硼砂緩沖溶液；pH 9.0和10.0為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。

LS55型熒光分光光度計和365型紫外/可見光分光光度計，美國PerkinElmer公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 pH對OTA熒光性質影響實驗

將溶于甲醇的OTA在不同pH的緩沖溶液中定容，使反應體系中OTA的濃度為100 nmol/L(甲醇體積分數(shù)為10%)。將溶液混勻后，常溫靜置反應10 min，然后使用熒光分光光度計測定體系溶液的熒光光譜，每組實驗重復3次。熒光發(fā)射波長為450 nm，狹縫寬度設定為6 nm×6 nm。

1.2.2 陽離子表面活性劑對OTA熒光性質影響實驗

將OTA分別加入到含PEI、CTAB、PDDA的pH 6.0，7.4和9.0緩沖溶液(10 mmol/L)中定容，使反應體系中OTA的濃度為100 nmol/L，PEI、CTAB和PDDA的質量分數(shù)為0.01%。將溶液混勻反應10 min，采用熒光分光光度計測定體系溶液的熒光光譜；在pH 6.0緩沖溶液中，100 nmol/L濃度的OTA分別與相同質量分數(shù)梯度(0，0.001%，0.005%，0.010%和0.020%)的PEI、CTAB和PDDA混合后，采用熒光分光光度計測定體系溶液的熒光光譜。每組實驗重復3次。熒光發(fā)射波長均為450 nm，狹縫寬度設定為6 nm×6 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)利用Origin 2018軟件處理作圖。

圖2 OTA在不同pH緩沖溶液中的激發(fā)光譜圖和各pH對應的340和390 nm處的熒光強度圖Fig. 2 Fluorescence excitation spectra of OTA in buffers at different pH values and fluorescence intensities at 340 and 390 nm

2 結果與分析

2.1 pH對OTA吸光度和熒光性質的影響

為了探究pH對OTA光學性質的影響，利用紫外可見光分光光度計和熒光分光光度計分別對OTA的吸光度和熒光性質進行了分析。紫外可見光分光光度計掃描4種體系溶液中OTA的吸光光譜見圖1。OTA在酸性(pH 4.0)、中性(pH 7.0)和堿性(pH 10.0)的緩沖溶液中，吸收帶分別集中在波長330，380，380 nm，且在甲醇溶液中330 nm處的吸收帶遠大于380 nm處。這主要歸因于OTA包含芳香族發(fā)色團/其他有機化合物，通常在紫外可見光光譜中顯示出強吸收，尤其在紫外區(qū)。波長330和380 nm處分別對應OTA的質子化和去質子化狀態(tài)，即單陰離子(OTA-)和雙陰離子(OTA2-)[11,13,19]。結果表明，在酸性溶液中，完全質子化的OTA占主導地位。這歸因于在酸性溶液中OTA的羧基pKa值(4.2～4.4)低于酚羥基pKa值(7.0～7.3)，所以羧基比酚羥基優(yōu)先電離，此時OTA以OTA-形態(tài)存在。在甲醇溶液中，完全質子化的OTA占主導地位，這是由于OTA和甲醇之間特定的溶質-溶劑相互作用(主要是氫鍵)。在堿性溶液中，羧基和酚羥基完全電離，此時完全去質子化的OTA2-占主導地位。由于OTA中酸性官能團的羧基的影響，OTA在中性溶液以OTA-和OTA2-形態(tài)共存[11,13,20]。

圖1 在甲醇、緩沖溶液中OTA的紫外可見光光譜圖Fig. 1 UV-Vis spectra of OTA in methanol and buffer solutions at different pH values

OTA在溶液中的熒光性質主要取決于其質子化和去質子化狀態(tài)。為了考察OTA在不同pH條件下的熒光性質，利用pH 3.0～10.0的緩沖溶液，設置發(fā)射波長為450 nm，對其緩沖溶液中的OTA進行了熒光檢測，結果如圖2所示。由圖2可知，在pH 3.0～6.0的緩沖體系溶液中，在340 nm處有明顯的熒光波峰，表明在酸性條件下OTA主要以OTA-形態(tài)存在，隨pH的增大，340 nm處的熒光強度略有下降，但變化不明顯；在pH 7.4的緩沖體系溶液中，340和390 nm處均出現(xiàn)熒光波峰，說明OTA-和OTA2-共存，且OTA2-略占優(yōu)勢；在pH 8.0～10.0的緩沖體系溶液中，390 nm處有明顯的熒光波峰，表明OTA2-占主導優(yōu)勢。隨pH的增大，390 nm處的波峰也逐漸升高，pH 9.0時OTA的熒光強度最大。這主要歸因于OTA在不同酸堿度溶液中的解離常數(shù)，在酸性溶液中羧基先去質子化，隨pH的增大，酚羥基也進行去質子化，促使OTA-向OTA2-轉變[11,13]。由圖2可見，OTA在pH 6.0，7.4和9.0的緩沖溶液中表現(xiàn)出不同的熒光特性，所以選用這3種pH的緩沖溶液探究了表面活性劑對OTA的熒光性質的影響。

2.2 陽離子型表面活性劑對OTA熒光性質的影響

為了研究陽離子型表面活性劑對OTA熒光性質的影響，選取了質量分數(shù)0.01%的3種不同結構特征的PEI、CTAB和PDDA，在pH 6.0，7.4和9.0的緩沖溶液中與無表面活性劑的緩沖溶液對比進行了探究，結果如圖3和4所示。固定發(fā)射波長450 nm進行掃描，在無表面活性劑的pH 6.0弱酸性環(huán)境中，OTA主要以OTA-形態(tài)存在；在pH 7.4中性環(huán)境中，OTA以OTA-和OTA2-形態(tài)存在；在弱堿性環(huán)境中，OTA主要以OTA2-形態(tài)存在。結果表明：在酸性條件下，OTA僅羧基會電離；在中性條件下，部分酚羥基也開始電離；在堿性條件下，羧基和酚羥基完全電離，促使OTA完全去質子化。與無表面活性劑相比，陽離子型表面活性劑對OTA的熒光特性具有顯著的影響，尤其在弱酸性pH 6.0和中性pH 7.4環(huán)境中。由于不同陽離子表面活性劑的結構不同，所帶正電荷量的差異，PEI、CTAB和PDDA與OTA分別呈現(xiàn)出了不同的熒光特性，并且呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性(圖3)。在pH 6.0和7.4時，加入PEI、CTAB或者PDDA后，390 nm處吸收峰都明顯增強，說明陽離子表面活性劑促進了OTA由單陰離子OTA-狀態(tài)向雙陰離子OTA2-轉變，而且在pH 7.4時，3種表面活性劑均完全促使OTA去質子化為OTA2-(圖4)。在pH 6.0時，PEI/OTA與CTAB/OTA、PDDA/OTA相比，促使OTA-完全去質子化而轉化為OTA2-，其對應波峰390 nm處發(fā)生了明顯升高，這是由于PEI的結構上富含胺基，促使OTA-中的酚羥基發(fā)生去質子化作用。在pH 9.0時，相比同濃度的PEI和PDDA，CTAB/OTA2-的波峰明顯低于前兩者。這可能是低濃度的CTAB會對OTA的溶解性產(chǎn)生一定的影響，使OTA在溶液中的溶解度降低。而且在3種pH緩沖溶液中，OTA與CTAB共存時，均出現(xiàn)OTA2-的波峰右移的現(xiàn)象。

圖3 不同陽離子型表面活性劑存在于不同pH緩沖溶液中時OTA的激發(fā)光譜圖Fig. 3 Fluorescence excitation spectra of OTA in buffers at different pH values in the absence and presence of cationic surfactants

圖4 不同表面活性劑存在于不同pH緩沖溶液中時340和390 nm處OTA的熒光強度柱狀分析圖Fig. 4 Fluorescence intensities of OTA at 340 and 390 nm in buffers at different pH values in the absence and presence of cationic surfactants

為了進一步考察在pH 6.0弱酸性環(huán)境中不同濃度的PEI、CTAB、PDDA對OTA的去質子化影響，對3種陽離子型表面活性劑各設置了相同濃度梯度進行了熒光檢測，結果如圖5和圖6所示。當加入PEI后，其質量分數(shù)范圍為0.001%～0.020%，在340 nm處的波峰均消失，且390 nm處的波峰隨PEI質量分數(shù)增大而升高，說明極少量的PEI也會使OTA-完全去質子化為OTA2-(圖5a)。相比PEI，CTAB的質量分數(shù)在0～0.02%范圍內，隨CTAB質量分數(shù)的增大，340 nm處的波峰逐漸降低；相反，390 nm處的波峰逐漸升高，且CTAB的質量分數(shù)大于0.01%時，會使OTA-完全向OTA2-轉化(圖5b和圖6)。而在體系溶液中加入質量分數(shù)0～0.02%的PDDA時，340和390 nm處均有波峰，隨著PDDA質量分數(shù)的增大，340 nm處的波峰略有下降的趨勢，但下降程度不明顯，而390 nm處的波峰逐漸增大(圖5c和圖6)。由此可知，在酸性條件下，PDDA能夠促進OTA-向OTA2-轉變，但不能完全轉變?yōu)镺TA2-，而PEI和CTAB在一定質量分數(shù)下，均可促使OTA-完全向OTA2-轉變。這可能是由于PDDA的正電荷性比PEI和CTAB弱，導致OTA的酚羥基在酸性條件下不能完全去質子化，此時OTA以OTA-和OTA2-形態(tài)共存。

圖5 不同濃度的PEI、CTAB、PDDA存在于pH 6.0緩沖溶液中時OTA的激發(fā)光譜圖Fig. 5 Fluorescence spectra of OTA in pH 6.0 buffered solutions with different cationic surfactants

圖6 不同濃度表面活性劑存在于pH 6.0緩沖溶液中時OTA在340和390 nm的熒光強度分析Fig. 6 Fluorescence intensities of OTA at 340 and 390 nm in pH 6.0 buffers with cationic surfactants at different concentrations

3 結 論

選用3種陽離子型表面活性劑探討了它們在不同pH環(huán)境中對OTA的去質子化和熒光性質的影響，具體結論如下：

1)pH、陽離子型表面活性劑及它們結合的微環(huán)境均可改變OTA的熒光強度和最大波峰位置，對OTA的熒光性質均具有顯著的影響。OTA在酸性、中性和堿性環(huán)境中存在的形態(tài)分別是：OTA-、OTA2-、OTA2-。

2)與無表面活性劑相比，在不同酸堿度緩沖溶液中3種陽離子型表面活性劑PEI、CTAB、PDDA對OTA熒光性質的影響有明顯差異。在酸性溶液中，一定質量分數(shù)的PEI和CTAB均可使OTA-完全轉化為OTA2-，而PDDA使OTA以OTA-和OTA2-共存；在中性條件下，3種表面活性劑均會促使OTA形態(tài)由OTA-完全向OTA2-轉化。此外，在含有CTAB的3種酸堿度緩沖溶液中，OTA的波峰均出現(xiàn)右移的現(xiàn)象。

研究結果有利于了解OTA在不同微環(huán)境中的熒光性質，也為建立OTA的熒光分析方法提供了良好的思路與依據(jù)。