SPP1基因在肺腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性研究

欒艷超 梁超 韓青松 劉佳坤 楊立偉 李志峰

肺腺癌作為肺癌最常見(jiàn)亞型，其發(fā)病率逐年上升，死亡率高[1]，因肺癌早期無(wú)特有的臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致大多患者確診時(shí)已出現(xiàn)局部及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無(wú)法手術(shù)治療[2]。目前，隨著生物治療及免疫治療的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，打破了肺癌以微創(chuàng)外科手術(shù)、放、化療為主的傳統(tǒng)治療方式，進(jìn)而使得肺癌患者的生存期逐漸延長(zhǎng)[3]；而早期肺腺癌患者如及時(shí)手術(shù)治療，可極大降低術(shù)后復(fù)發(fā)率及死亡率[4]。為此，我們亟需尋求可靠的用于早期診斷以及治療的靶標(biāo)分子。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞、乳房癌、胃癌中均檢測(cè)到SPP1異常高表達(dá)與臨床分期及預(yù)后有關(guān)[5-6]。本研究將生物信息學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合，探討SPP1在肺腺癌中的表達(dá)及其與臨床表現(xiàn)及預(yù)后的關(guān)系; 旨在臨床上為L(zhǎng)UAD診治及預(yù)后提供新的參考。

資料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

本研究選取138例肺腺癌患者癌組織和癌旁組織標(biāo)本，所有患者均于2014年12月至2015年12月期間我院行肺腺癌手術(shù)切除。入組標(biāo)準(zhǔn)：男性54.3%(75/138)例，女性45.7%(63/138)例，年齡35歲至88歲之間，根據(jù)國(guó)際第八版肺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為Ⅰ+Ⅱ期83例，Ⅲ+Ⅳ期55例(T1/2期101例、T3/4期37例，N0 期68例，N1/2 期70例，M0 期133例、M1期5例)，病理分級(jí)Ⅰ/Ⅱ 級(jí)82例、Ⅲ級(jí)56例，患者術(shù)前均未給予放、化療及其他生物治療，截止隨訪2019年12月，并已獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：2021071)。通過(guò)門(mén)診復(fù)查、電話回訪等方式隨訪，記錄病情、病史詢問(wèn)、腫瘤標(biāo)志物檢驗(yàn)、胸部CT等檢查，術(shù)后復(fù)發(fā)及死亡時(shí)間。

二、材料

基因擴(kuò)增儀Eppendorf，熒光定量PCR儀:Mx3000p，RT Fiest Strand cDNA Synthesis Kit(Servicebio，G3330-100)，2 X SYBR Green qPCR Master Mix(low Rox)，Servicebio，G3321-01;引物購(gòu)自上海生工生物。SP試劑盒(上海科欣生物); DAB試劑盒(河北博海生物);一抗:SPP1多克隆抗體(河北博海生物)，濃度1 ∶200;生物素化通用二抗工作液;蘇木素染料(上海恒遠(yuǎn)生物);辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(蘇州宇恒生物)等。

三、利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析SPP1表達(dá)與臨床關(guān)系

通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)行 TCGA Gene Analysis，檢索SPP1，選擇肺腺癌，檢出結(jié)果中運(yùn)用泛癌表達(dá)分析(pan-cancer view)[7]。通過(guò)基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)所搭建的數(shù)據(jù)可視化平臺(tái)UALCAN，在UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行TCGA 及CPTAC(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium)數(shù)據(jù)集中檢索SPP1，于數(shù)據(jù)庫(kù)選項(xiàng)中選擇肺腺癌。分別對(duì)年齡、性別、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征分組及預(yù)后情況進(jìn)行分析。

四、運(yùn)用GEPIA、KM Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)研究SPP1表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)進(jìn)行SPP1的表達(dá)與肺腺癌患者生存關(guān)系的分析。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)是用于分析來(lái)自TCGA (The Cancer Genome Atlas)和GTEx (Genotype-Tissue Expression)項(xiàng)目的RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)[8]。通過(guò)分析KM Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中SPP1肺腺癌樣本表達(dá)，使用Survival選項(xiàng)，繪制樣本表達(dá)與生存時(shí)間關(guān)系的Kaplan-Meier曲線，包括總生存率(overall survival，OS)[9]。

五、RT-qPCR檢測(cè)SPP1表達(dá)

通過(guò)TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA合成cDNA，采用PrimeScript RT Enzyme Mix I進(jìn)行RT反應(yīng)。反應(yīng)條件:1個(gè)循環(huán)的95℃、5 min;40個(gè)循環(huán)的95℃、10s 和60℃、30s，以GAPDH為內(nèi)參.通過(guò)2-ΔΔCt方法表達(dá)SPP1相對(duì)表達(dá)量。獲得SPP1基因擴(kuò)增和溶解曲線(圖1)。

圖1 SPP1基因擴(kuò)增曲線圖(左)和溶解曲線圖(右)

六、Western blotting檢測(cè)SPP1蛋白表達(dá)

加入蛋白裂解液分離總蛋白， BCA法定量蛋白;經(jīng)變性后行SDS-PAGE電泳，250mA恒定電流，轉(zhuǎn)膜90min;PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，一抗(稀釋度為1 ∶1000)，4℃孵育過(guò)夜;經(jīng)TBST漂洗10min，重復(fù)3次;浸入二抗工作液(稀釋度為1 ∶5000)，37 ℃孵育1 h，再次TBST漂洗;滴入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，行ECL檢測(cè)并拍照; 采用Image J 分析條帶灰度值。

七、免疫組織化學(xué)

石蠟切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、滲透、封閉等操作后，給予一抗(SPPI抗體1 ∶200)過(guò)夜，給予生物素化通用二抗工作液;，加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。鏡下拍攝， Image-J軟件分析，棕色、褐色、黃色顆粒為(+)，無(wú)染色為(-)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算平均吸光度。

八、統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Graphpad Prism9.0作圖，運(yùn)用Image J分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。采用Kaplan-Meier和Cox回歸進(jìn)行生存分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組定量資料的比較，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SPP1在肺腺癌組織中高表達(dá)

我們前期利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)全面分析SPP1在人類(lèi)常見(jiàn)惡性腫瘤中的表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)包括肺腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中SPP1 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且可能發(fā)揮致癌基因的作用(圖2)。通過(guò)挖掘GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)同樣驗(yàn)證SPP1在肺腺癌組織中表達(dá)顯著高于肺正常組織(圖3，P<0.001)。

圖2 不同腫瘤組織中SPP1的表達(dá)水平

圖3 SPP1在肺腺癌與正常組織表達(dá)差異 A: GEPIA; B: UALCAN

二、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析LUAD中SPP1 mRNA表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

為了深入分析SPP1表達(dá)與LUAD患者預(yù)后關(guān)系，我們首先通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析SPP1 mRNA表達(dá)與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn) SPP1 mRNA高表達(dá)與更差的OS(P=0.016，圖4A)顯著相關(guān)，初步提示SPP1 mRNA高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。鑒于GEPIA中LUAD患者病例數(shù)有限，我們利用Kaplan -Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SPP1 mRNA表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的進(jìn)行了驗(yàn)證，同樣發(fā)現(xiàn)SPP1 mRNA高表達(dá)的LUAD患者，其OS明顯縮短(P=5.2e-06，圖4B)，進(jìn)一步證實(shí)SPP1 mRNA高表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)。

圖4 GEPIA和K-M數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)SPP1的表達(dá)對(duì)患者生存率的影響 A: GEPIA; B: K-M

三、UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析LUAD中SPP1表達(dá)與臨床特征關(guān)系

接下來(lái)，利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析了LUAD (515例)中SPP1的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SPP1 mRNA的表達(dá)與LUAD患者的N分期(P<0.001，圖5D)顯著相關(guān)，且隨著N分期的增高SPP1的表達(dá)水平有著上升的趨勢(shì)，與TNM分期、年齡、性別無(wú)顯著相關(guān)性。利用CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析SPP1蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，SPP1蛋白表達(dá)在肺腺癌中顯著升高，且與LUAD患者的TNM分期(P<0.001，圖6B)、N分期(P<0.001，圖6D)顯著相關(guān)，且隨著TNM分期、N分期的增高 SPP1的表達(dá)水平有著上升的趨勢(shì)，但與年齡、性別無(wú)顯著相關(guān)性。

圖5 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中SPP1 mRNA 與臨床特征關(guān)系 (1)P<0.001

圖6 CPTAC 數(shù)據(jù)庫(kù)中SPP1 蛋白表達(dá)與臨床特征關(guān)系 (1)P<0.001

四、肺腺癌組織中SPP1高表達(dá)

我們?yōu)榱诉M(jìn)一步驗(yàn)證肺腺癌組織中SPP1的表達(dá)情況，采用(RT-qPCR)檢測(cè)肺腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織，結(jié)果顯示，癌組織中SPP1 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，(n=39，P<0.001，圖7A)。然后采用western blot檢測(cè)10例肺腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中SPP1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.0149，圖7B、C)。運(yùn)用免疫組化檢測(cè)138例肺腺癌石蠟切片中SPP1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，SPP1蛋白在LUAD組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001，圖8A)，SPP1定位于胞漿或核，(圖8C)。為了排除不同患者之間個(gè)體差異的影響，進(jìn)一步分析69例配對(duì)肺腺癌組織與正常肺組織的免疫組化結(jié)果，同樣顯示肺腺癌組織中SPP1蛋白顯著高表達(dá)(P<0.001，圖8B)。

圖7 肺腺癌和正常肺組織中SPP1表達(dá)

圖8 免疫組化檢測(cè)SPP1蛋白在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)

五、肺腺癌組織中SPP1表達(dá)與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)分析

我們又對(duì)SPP1蛋白表達(dá)與肺腺癌患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以免疫組化評(píng)分中位數(shù)分為SPP1高表達(dá)組(n=69)和低表達(dá)組(n=69)，結(jié)果顯示在T3/4組(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.041)、Ⅲ/Ⅳ期(P=0.023)與死亡(P=0.003)組患者的腫瘤組織中SPP1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(表1)。SPP1蛋白表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮入組數(shù)較少(n=5)有關(guān)。

表1 肺腺癌中SPP1蛋白表達(dá)和臨床病理參數(shù)關(guān)系

六、肺腺癌組織中SPP1表達(dá)與患者預(yù)后

最后我們通過(guò)免疫組化結(jié)果，分析SPP1蛋白表達(dá)對(duì)患者總體生存時(shí)間(OS)的影響，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組中位生存時(shí)30個(gè)月，而低表達(dá)組中位生存時(shí)間52個(gè)月。K-M生存曲線表明，肺腺癌患者中SPP1高表達(dá)組OS顯著降低(P=0.0017，圖9)。為了進(jìn)一步分析SPP1蛋白高表達(dá)與患者預(yù)后影響因素，我們通過(guò)單因素Cox分析顯示LUAD患者預(yù)后的影響因素為SPP1蛋白表達(dá)(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)和M分期(P<0.001)。多因素Cox分析顯示LUAD患者預(yù)后獨(dú)立影響因素為SPP1蛋白表達(dá)(P<0.001)、TNM分期(P=0.034)和M分期(P=0.001)(表2)。

圖9 SPP1蛋白高表達(dá)與肺腺癌不良預(yù)后相關(guān)

表2 138例的肺腺癌患者總體生存期單因素與多因素Cox 回歸分析

討 論

肺腺癌因其局部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及耐藥等諸多原因，導(dǎo)致肺癌的治療效果仍不理想[10]。2019年美國(guó)有22.8萬(wàn)人被診斷為肺癌，而死亡人數(shù)約16萬(wàn)人[11]，數(shù)據(jù)表明，肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高、預(yù)后差的特性，因此，探明肺癌發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍然是目前肺癌研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)[12]。如今隨著生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多技術(shù)突破，分子靶向治療、免疫抑制劑治療的手段已廣泛應(yīng)用于臨床，但仍未明顯降低肺癌患者的死亡率[13]。

SPP1基因是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在多種腫瘤中高表達(dá)[14]。它屬于小整合素結(jié)合配體N型糖蛋白(SIBLING)家族，其在淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞及多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[15]。并且分為兩個(gè)功能序列，分別為N端RGD序列以及C端非RGD序列。在腫瘤組織中，細(xì)胞外基質(zhì)被各種通路分泌的uPA、MMP等影響，進(jìn)而對(duì)腫瘤的侵襲和遷移影響;C端非RGD結(jié)合CD44，促進(jìn)信號(hào)通路激活[16]，進(jìn)而可以導(dǎo)致免疫逃逸[17]。近年越來(lái)越多研究報(bào)道，SPP1參與多種惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程，如肝癌、胰腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌的生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。SPP1促進(jìn)肝癌細(xì)胞增長(zhǎng)并與肺腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，且SPP1可促進(jìn)肝癌的增殖和侵襲[19]。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞和組織中SPPI表達(dá)上調(diào)，下調(diào)SPPI抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡[20]。

但SPPI在肺腺癌的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道，我們前期利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)全面分析SPP1在人類(lèi)常見(jiàn)惡性腫瘤中的表達(dá)，分析顯示多種惡性腫瘤組織中SPP1 mRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織，進(jìn)一步挖掘GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)同樣驗(yàn)證在肺腺癌組織中SPP1表達(dá)顯著高于肺正常組織。為了深入了解SPP1的表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系，我們通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘SPP1 mRNA表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SPP1 mRNA高表達(dá)與更差的OS顯著相關(guān)，鑒于GEPIA中LUAD患者病例數(shù)有限，我們又對(duì)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中SPP1 mRNA表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的進(jìn)行驗(yàn)證，得到相似結(jié)果，從而進(jìn)一步證實(shí)SPP1 mRNA高表達(dá)與肺腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。

為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，我們從分子水平分析SPP1的表達(dá)情況，采用qPCR、western blot 和免疫組化方法檢測(cè)SPP1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，均顯示肺腺癌中SPP1表達(dá)上調(diào)。以上分析表明在肺腺癌中SPP1可能起到致癌作用。又對(duì)臨床資料分析可見(jiàn)， SPP1表達(dá)與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存狀況顯著相關(guān)。因多數(shù)發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者已無(wú)法通過(guò)手術(shù)治療，導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例數(shù)偏少，可能導(dǎo)致研究結(jié)果與實(shí)際產(chǎn)生偏倚。本研究收集138例肺腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，進(jìn)而從蛋白水平探討SPP1在LUAD中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SPP1蛋白高表達(dá)與LUAD患者的OS縮短密切相關(guān)，此結(jié)果與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。Cox單因素和多因素回歸分析表明， SPP1蛋白表達(dá)、臨床分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示， SPP1在肺腺癌組織中呈高表達(dá)并可在一定程度上預(yù)測(cè)肺腺癌患者的不良預(yù)后。以上結(jié)果為肺腺癌患者在早期診治、臨床預(yù)后等多領(lǐng)域提供重要參考。但本研究?jī)H從分子、蛋白水平對(duì)肺腺癌患者SPP1表達(dá)與預(yù)后分析，因而SPP1的表達(dá)與腫瘤的分子機(jī)制的研究將作為我們的后續(xù)研究方向。