不同種源華重樓根莖生長(zhǎng)性狀表型變異和皂苷含量研究

周世水， 徐 梁， 江應(yīng)欽， 韓素芳， 程詩(shī)明 ，成 亮，楊少宗， 柳麗娜

( 1.開(kāi)化縣林場(chǎng)， 浙江 開(kāi)化 324300; 2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院， 浙江 杭州 310023； 3.開(kāi)化縣林業(yè)局， 浙江開(kāi)化 324300； 4.安吉縣林業(yè)技術(shù)推廣中心， 浙江 安吉 313300)

華重樓(Parispolyphyllavar.chinensis)為百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物，在全國(guó)很多省都有分布，是《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[1]收載的重樓藥材中2種基原植物之一，屬二級(jí)瀕危物種，其藥用價(jià)值突出，是著名中成藥云南白藥、官血寧膠囊、季德勝蛇藥片、抗病毒顆粒等產(chǎn)品的主要原料[1-2]。據(jù)《浙江植物志》記載，華重樓在浙江省許多縣市都有分布，是浙江省的珍貴野生藥材資源[3]，也是浙江省林下經(jīng)濟(jì)發(fā)展主要種植的藥材。目前，在測(cè)定重樓皂苷類(lèi)成分的研究中，以測(cè)定寬瓣重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)皂苷含量及其成分比較的研究較多[4-14]，此外，也有重樓屬其他種之間皂苷含量比較的研究[19-24]，但有關(guān)華重樓皂苷成分的研究相對(duì)較少[15-18]。因此，本研究對(duì)9個(gè)不同種源的野生華重樓根莖生長(zhǎng)性狀和皂苷含量進(jìn)行測(cè)定和分析，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和種源選擇提供參考。

1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院白巖寺林區(qū)。該區(qū)地處天目山脈余脈，地理位置為119°59′51″—120°01′13″E，30°09′30″—30°10′23″N；氣候溫和，雨量充沛，全年平均氣溫16.5 ℃，極端高溫39.8 ℃，極端低溫-14.4 ℃，年平均濕度81%；森林覆蓋率93%，海拔約102 m。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2018年5—9月，于浙江、江西、福建等地的林下采集9個(gè)種源華重樓野生植株，依據(jù)莖痕判定，華重樓植株均為7年生以上，均移栽于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院白巖寺林區(qū)。于4—6月花期時(shí)進(jìn)行鑒定，經(jīng)楊少宗副研究員鑒定為華重樓，標(biāo)本保存于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院分析中心實(shí)驗(yàn)室。華重樓種源采集地具體信息見(jiàn)表1。

表1 華重樓種源采集地信息Tab.1 provenances information of Paris polyphylla var. chinensis samples 編號(hào)種源經(jīng)度/°E緯度/°N海拔/m1浙江安吉119.64730.4715152浙江磐安120.53829.0219083浙江龍泉118.91328.0075234浙江龍游119.12628.8283835浙江淳安119.10829.8223446江西分宜114.68127.9503057福建連城116.90825.8306838福建寧化116.87226.3854449浙江遂昌119.04928.594535

2.2 儀器與試劑

(1)儀器。Waters Alliance E2695高效液相色譜儀(Waters 2996DAD檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司生產(chǎn))；BSA1245萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó)sartotius公司生產(chǎn))；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn))；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)生產(chǎn))；DZF-0真空干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))。

(2)試劑。對(duì)照品重樓皂苷Ⅰ(批號(hào)：50733-41-6)、重樓皂苷Ⅱ(批號(hào)：50773-42-7)、重樓皂苷Ⅵ(批號(hào)：55916-51-3)和重樓皂苷Ⅶ(批號(hào)：68124-04-9)均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，其中皂苷Ⅶ的純度≥95%，其他皂苷的純度均≥98%；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純，均購(gòu)于杭州惠普生物科技有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 根莖生長(zhǎng)性狀測(cè)量 2019年10月，在華重樓地上部分停止生長(zhǎng)后，采集其地下根莖(以下簡(jiǎn)稱(chēng)根莖)，每個(gè)種源取4株，用直尺和游標(biāo)卡尺測(cè)量主根、須根的長(zhǎng)和直徑，用電子天平測(cè)量根莖的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，數(shù)據(jù)保留2位小數(shù)。

2.3.2 根莖皂苷含量測(cè)定 將采集的華重樓根莖低溫干燥后打粉過(guò)60目篩，應(yīng)用HPLC法進(jìn)行皂苷類(lèi)成分的測(cè)定。色譜條件的確立、對(duì)照品和供試品溶液的制備、線(xiàn)性關(guān)系的考察、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)、樣品測(cè)定的具體方法采用《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[1]規(guī)定的方法。藥材留樣存放于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院分析中心。

2.3.3 根莖折干率測(cè)定 將華重樓根莖用清水洗凈，除凈地上部分及須根，用吸水紙吸干表面水分后稱(chēng)鮮質(zhì)量；然后放入60 ℃的烘箱烘干至恒質(zhì)量。藥材折干率=干質(zhì)量÷鮮質(zhì)量×100%。

2.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016軟件處理初始數(shù)據(jù)；用SPSS 22.0軟件進(jìn)行表型變異、方差分析和相關(guān)性分析等。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同種源華重樓根莖生長(zhǎng)性狀表型變異

從表2可知：華重樓種源主根長(zhǎng)、主根直徑、須根數(shù)、須根長(zhǎng)、須根直徑及根莖鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、折干率的表型變異系數(shù)分別為0.137 0～0.405 1、0.080 2～0.325 2、0.100 4～0.429 7、0.101 9～0.605 8、0.147 9～0.393 1和0.190 4～0.726 2、0.260 5～0.741 0、0.053 7～0.196 7。說(shuō)明種源間根莖生長(zhǎng)性狀的表型變異豐富，受遺傳因素和環(huán)境因素的影響明顯。種源間平均根莖折干率變化范圍為28.20%～44.90%，折干率變化較大，9個(gè)種源平均折干率為36.72%。浙江淳安種源的平均根莖折干率最大，達(dá)到44.90%；浙江龍游種源的最小，只有28.20%。這些為選優(yōu)提供了基礎(chǔ)。

表2 不同種源華重樓根莖生長(zhǎng)性狀表型變異Tab.2 Growth phenotypic variation in provenances of Par-is polyphylla var. chinensis samples性狀種源最小值最大值平均值標(biāo)準(zhǔn)差表型變異系數(shù)127.3667.5846.5318.8460.405 1232.9854.3040.509.8040.242 1358.00104.0078.2519.1550.244 8458.3479.5872.959.9970.137 0主根長(zhǎng)/mm555.0077.0061.2510.5950.173 0658.0096.0079.0016.4320.208 0729.0647.6538.177.7680.203 5850.0095.0076.0020.3470.267 7945.0077.0066.7514.7960.221 7113.0228.3020.316.6030.325 2216.2022.9319.453.2830.168 8315.4034.0025.907.7540.299 4420.5027.5424.993.1240.125 0主根直徑/mm517.5023.3020.602.5730.124 9624.2028.5026.502.1240.080 278.6014.6112.402.7360.220 7822.3030.0027.303.4240.125 4919.0027.0022.253.4030.153 01162720.254.7170.232 92113018.758.0570.429 73162722.504.6550.206 94233227.003.9160.145 0須根數(shù)根5142619.005.5980.294 66112416.256.0210.370 57152421.004.0820.194 48212523.002.3090.100 49142519.004.6900.246 9159.63214.79113.7468.900.605 8253.66222.69151.4875.2910.497 0388.14155.54135.7532.0070.235 84115.62148.53132.6513.5140.101 9須根長(zhǎng)/mm5100.25199.07147.8149.0110.331 66133.14312.58206.3279.9390.387 5777.56133.35110.4723.5180.212 98131.13340.07232.55104.8520.450 99136.40311.19235.1675.4720.320 9

續(xù)表2 不同種源華重樓根莖生長(zhǎng)性狀表型變異Continued Tab.2 Growth phenotypic variation in provenances of Paris polyphylla var. chinensis samples性狀種源最小值最大值平均值標(biāo)準(zhǔn)差表型變異系數(shù)10.892.451.650.6500.393 121.032.171.610.4840.300 330.450.680.550.0990.181 041.201.771.530.2480.162 3須根直徑/mm50.340.780.540.1840.343 160.620.880.720.1190.165 170.901.851.430.3990.279 180.480.660.550.0810.147 990.450.730.570.1420.249 816.4732.2416.1311.7160.726 223.8417.3010.735.8550.545 538.5036.7026.9313.2350.491 5415.3027.2023.105.5650.241 0根莖鮮質(zhì)量/g56.7021.4014.137.2130.510 7615.0038.1025.809.4720.367 172.117.645.732.4630.430 0814.7039.9029.4311.9260.405 3914.6023.1018.703.5600.190 411.8410.135.053.7440.741 020.966.964.052.5740.635 533.5515.3710.625.1570.485 544.248.406.551.8180.277 6根莖干質(zhì)量/g53.648.435.952.3310.391 666.8815.3710.273.6220.352 770.922.852.170.8580.396 284.7816.3211.215.4450.485 794.468.616.671.7360.260 5128.4432.2330.841.6560.053 7225.0040.2335.286.9410.196 7336.5141.8839.892.5260.063 3426.4430.8828.201.8890.067 0根莖折干率/%534.6754.3344.908.0930.180 3635.4545.8740.364.2720.105 9735.4243.6038.803.4990.090 2832.5240.9036.933.8840.105 2930.5537.2735.263.1750.090 0

3.2 不同種源華重樓根莖生長(zhǎng)性狀差異性

表3方差分析結(jié)果表明：除須根數(shù)和須根長(zhǎng)外，華重樓的其他根莖生長(zhǎng)性狀在種源間都存在極顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明長(zhǎng)期的地理隔離使其根莖生長(zhǎng)性狀在種源間已產(chǎn)生明顯分化。這為進(jìn)一步進(jìn)行華重樓優(yōu)良家系選擇奠定了基礎(chǔ)。

表3 不同種源華重樓根莖生長(zhǎng)性狀方差分析Tab.3 Anova on growth characters in provenances of Paris polyphylla var. chinensis samples變異來(lái)源平方和自由度均方F值P值主根長(zhǎng)8 646.78681 080.8484.8790.001主根直徑703.130887.8914.7600.001須根數(shù)311.500838.9381.4860.208須根長(zhǎng)76 531.44389 566.4302.2860.052須根直徑8.61181.07610.0790.000根莖鮮質(zhì)量2 044.2868255.5363.3800.008根莖干質(zhì)量315.209839.4013.4600.007根莖折干率823.1468102.8935.0870.001

3.3 華重樓根莖生長(zhǎng)性狀相關(guān)性

表4相關(guān)性分析結(jié)果表明：根莖鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均與主根長(zhǎng)、主根直徑、須根數(shù)、須根長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)；鮮質(zhì)量與須根直徑呈顯著負(fù)相關(guān)；干質(zhì)量與須根直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)。根莖鮮質(zhì)量與主根直徑的相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)到0.911；與主根長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)次之，為0.868。以上結(jié)果說(shuō)明，華重樓的根莖鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與其他性狀間存在著顯著相互影響的關(guān)系，根莖鮮質(zhì)量和干質(zhì)量隨其他生長(zhǎng)性狀(除須根直徑外)值的增大而增長(zhǎng)。

表4 華重樓根莖生長(zhǎng)性狀相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation among growth traits of Paris polyphylla var.chinensis samples主根長(zhǎng)主根直徑須根數(shù)須根長(zhǎng)須根直徑根莖鮮質(zhì)量根莖干質(zhì)量主根長(zhǎng)1.000主根直徑0.775**1.000須根數(shù)0.409*0.409*1.000須根長(zhǎng)0.414*0.521**0.0641.000須根直徑-0.451**-0.366*0.102-0.3041.000根莖鮮質(zhì)量0.868**0.911**0.544**0.469**-0.345*1.000根莖干質(zhì)量0.867**0.860**0.458**0.470**-0.428**0.969**1.000 注:* 表示在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);**表示 在 0.01 水平(雙側(cè))上極顯著相關(guān)。

3.4 不同種源華重樓皂苷含量

表5結(jié)果顯示：不同種源華重樓中各種皂苷含量和總皂苷含量差異較大。除遂昌種源未檢測(cè)出纖細(xì)薯蕷皂苷外，其他種源均檢測(cè)出了7種皂苷。依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[1]收載的重樓藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量>0.6%，只有安吉1個(gè)種源沒(méi)有達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。龍泉種源的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總含量最高，為1.252%；遂昌種源的其次，為1.158%；安吉種源的最低，僅為0.485%。磐安和淳安種源的重樓皂苷Ⅰ含量均最高；寧化種源的重樓皂苷Ⅱ含量最高；淳安種源的重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷H含量均最高；龍泉種源的重樓皂苷Ⅶ、纖細(xì)薯蕷皂苷含量均最高；磐安種源的偏諾皂苷含量最高。

表5 不同種源華重樓皂苷的含量Tab.5 Contents of polyphyllins in saponins collected from different provenances%種源重樓皂苷Ⅰ重樓皂苷Ⅱ重樓皂苷Ⅵ重樓皂苷Ⅶ偏諾皂苷重樓皂苷H纖細(xì)薯蕷皂苷重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)總皂苷安吉0.0120.0170.0100.4460.4410.5300.0820.4851.538磐安0.0250.0300.0150.8001.9680.6410.3810.8693.860龍泉0.0120.0250.0101.2051.0840.5891.6631.2524.588龍游0.0120.0170.0070.5820.9550.6930.0940.6192.360淳安0.0250.0250.0170.7031.6390.8190.2720.7703.500分宜0.0200.0150.0070.7181.1390.6110.1210.7602.631龍巖0.0070.0250.0050.6780.1680.2770.0320.7151.192寧化0.0120.0350.0100.7130.4110.5000.0920.7701.773遂昌0.0120.0170.0051.1240.0720.168—1.1581.398

4 結(jié)論與討論

不同種源華重樓根莖生長(zhǎng)性狀表型變異豐富，除須根數(shù)和須根長(zhǎng)外，其他性狀在種源間都存在極顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明華重樓根莖生長(zhǎng)性狀受環(huán)境因素的影響極顯著，這為其進(jìn)一步的優(yōu)良家系選擇奠定了基礎(chǔ)。華重樓根莖鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均與主根長(zhǎng)、主根直徑、須根數(shù)、須根長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)；鮮質(zhì)量與〗須根直徑呈顯著負(fù)相關(guān)；干質(zhì)量與須根直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)。根莖鮮質(zhì)量與主根直徑的相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)到0.911；與主根長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)次之，為0.868。這說(shuō)明華重樓的根莖鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與其他性狀間存在著顯著相互影響的關(guān)系。

9個(gè)種源華重樓的皂苷種類(lèi)與含量有明顯差異，其中龍泉種源的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總含量最高，達(dá)1.252%；安吉種源的最低，僅為0.485%。除遂昌種源未檢測(cè)出纖細(xì)薯蕷皂苷外，其他種源均檢測(cè)出了7種皂苷，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[1]收載的重樓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量>0.6%，只有安吉1個(gè)種源沒(méi)有達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。陳鐵柱等[15]報(bào)道，21個(gè)產(chǎn)地的華重樓中，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量只有3個(gè)產(chǎn)地的達(dá)標(biāo)到了合格標(biāo)準(zhǔn)；葉菲菲等[16]報(bào)道，來(lái)自7個(gè)產(chǎn)地的18個(gè)種源中，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量只有5個(gè)種源的未達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；周愛(ài)存等[17]報(bào)道，來(lái)自浙江不同采集地的華重樓，其種源間重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量存在顯著差異，有1/2種源的未達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)中，9個(gè)種源華重樓的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總含量合格率高，可能是因?yàn)椴杉闹仓晟L(zhǎng)年限都在7年以上，說(shuō)明重樓藥材質(zhì)量的影響因子除立地條件外，生長(zhǎng)年限也是重要的影響因子。

重樓皂苷是華重樓的主要藥效成分，其根莖生物量的高低直接影響藥材產(chǎn)量，而中藥材有效成分的積累和產(chǎn)量高低是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，既受自身遺傳因素的影響，也與氣候條件、地理環(huán)境及栽培管理等密切相關(guān)。要獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，篩選華重樓優(yōu)質(zhì)種源并進(jìn)行規(guī)范化栽培的研究顯得尤為重要。