基于聚類分析和主成分分析的吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜研究

馬向慧，劉 燁，姜恒麗，王雙雙，康亞娟，陳云龍，曹麗娟

基于聚類分析和主成分分析的吳茱萸及制吳茱萸指紋圖譜研究

馬向慧，劉 燁，姜恒麗，王雙雙，康亞娟，陳云龍，曹麗娟*

盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司，天津市中藥飲片炮制技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300301

建立吳茱萸生品與炮制品HPLC指紋圖譜，通過計(jì)算相似度，結(jié)合化學(xué)模式識別方法，評價吳茱萸和制吳茱萸的質(zhì)量，探討炮制前后化學(xué)成分的差異，闡釋吳茱萸炮制后毒性降低的機(jī)制。通過高效液相色譜法建立吳茱萸及制吳茱萸的指紋圖譜，運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）和SPSS17.0軟件對相應(yīng)圖譜進(jìn)行相似度評價、聚類分析（cluster analysis，CA）和主成分分析（principal analysis，PCA）。吳茱萸和制吳茱萸的指紋圖譜相似度均大于0.985，均含有12個相同的共有峰，指認(rèn)出了其中的5個。以吳茱萸堿為參照峰，比較各共有峰的相對峰面積，發(fā)現(xiàn)吳茱萸炮制后除3號峰外，其余共有峰均有不同程度的下降，以2號峰和10號峰有顯著性下降。聚CA結(jié)果顯示，吳茱萸生品可分為2大類，其中來源于江西的為一類，來源于浙江和湖南的為一類；經(jīng)PCA分析，前3個主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為87.405%，以2、5（綠原酸）、6（金絲桃苷）、7、8（檸檬苦素）、9（吳茱萸堿）、10（吳茱萸次堿）和12號峰對吳茱萸炮制前后化學(xué)成分差異變化的貢獻(xiàn)較大。吳茱萸HPLC指紋圖譜的構(gòu)建及化學(xué)模式識別可為闡釋吳茱萸炮制后毒性降低機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

吳茱萸；制吳茱萸；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析；綠原酸；金絲桃苷；檸檬苦素；吳茱萸堿；吳茱萸次堿

吳茱萸為常用的溫里藥，又名食茱萸、吳萸、茶辣、漆辣子等，來源于蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth.、石虎(Juss.) Benth.var.(Dode) Huang或疏毛吳茱萸(Juss.) Benth.var(Dode) Huang的干燥近成熟果實(shí)?！吨袊幍洹?020年版[1]記載吳茱萸飲片有吳茱萸和制吳茱萸2種規(guī)格，能散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉，主要治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣等病癥。研究表明[2]，吳茱萸具有保護(hù)心肌、抑制血管生成、擴(kuò)張血管、抗胃腸道潰瘍、保護(hù)卵巢等藥理作用，在臨床上有較好的治療效果。然而，吳茱萸有小毒，若炮制不當(dāng)、超劑量服用或配伍不當(dāng)均可引起不良反應(yīng)，以肝臟損傷居多。實(shí)驗(yàn)顯示，與吳茱萸生品相比，通過甘草制、鹽制均能降低生品的肝毒性作用[3]，但對于吳茱萸的主要致毒性成分和炮制減毒機(jī)制現(xiàn)有研究尚未明確。

目前對于吳茱萸及其炮制品的研究，主要集中在其炮制方法、藥理作用、毒理機(jī)制方面，而采用HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)識別模式分析吳茱萸炮制前后成分變化的報道甚少，因此本課題擬采用指紋圖譜技術(shù)建立吳茱萸、制吳茱萸各10批次的指紋圖譜，進(jìn)行相似度評價，結(jié)合化學(xué)模式識別方法，探究吳茱萸炮制后化學(xué)成分的變化，進(jìn)而為闡釋吳茱萸炮制后毒性降低機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，為臨床安全使用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司），ME-204/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DZKW-110型恒溫水浴鍋（STWK有限公司）；H130型冷卻水循環(huán)裝置（萊伯泰科有限公司）；XP205型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試劑

吳茱萸堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，批號110802-201710）、吳茱萸次堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，批號110801-201608）、檸檬苦素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.9%，批號110800-201707）、金絲桃苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%，批號111521-201809）、綠原酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%，批號110753-201817），上述對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純（德國默克股份兩合公司），超純水（娃哈哈有限公司），磷酸為色譜純（和光純藥工業(yè)株式會社）。

1.3 樣品

樣品收集來源于江西、浙江和湖南3個產(chǎn)地，經(jīng)盛實(shí)百草藥業(yè)有限公司曹麗娟高級工程師鑒定為蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth的干燥近成熟果實(shí)10批次，對應(yīng)的炮制品吳茱萸和制吳茱萸均按照《中國藥典》2020年版規(guī)定的炮制方法加工。

表1 10批次吳茱萸樣品及炮制品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

COSMOSIL C18-MS-II色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈（B）-0.2%磷酸（A）溶液，梯度洗脫（0～20 min，5%～10% B；20～53 min，10%～30% B；53～58 min，30%～43% B；58～80 min，43%～65% B；80～90 min，65%～100% B），進(jìn)樣量為20 μL，體積流量為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為220 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制 分別取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素、金絲桃苷、綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成母液。各吸取適量母液于100 mL量瓶中，用50%甲醇定容稀釋，得各對照品質(zhì)量濃度分別為80.08、50.10、100.40、48.12、40.28 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取吳茱萸或制吳茱萸粉末（過三號篩）0.5 g，放置在具塞錐形瓶中，精密加入50 mL的50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲40 min，放置至室溫，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻。以轉(zhuǎn)速3300 r/min進(jìn)行離心，10 min后，用0.2 μm的微孔濾膜濾過上清液，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取吳茱萸樣品（W1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)配制供試品溶液1份，照“2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，以吳茱萸堿為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD＜2.0%，相對峰面積的RSD＜3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取吳茱萸樣品（W1）粉末6份，按“2.2.2”項(xiàng)配制供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)色譜條件項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，以吳茱萸堿為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD＜2.0%，相對峰面積的RSD＜3.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取吳茱萸樣品（W1）適量，按“2.2.2”配制供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測，以吳茱萸堿為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD＜2.0%，相對峰面積的RSD＜3.0%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 吳茱萸不同炮制品HPLC指紋圖譜的測定

3.1 指紋圖譜的建立

取“2.2.1”項(xiàng)下配制的混合對照品溶液，按“2.1色譜條件”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，得混合對照品的色譜圖，見圖1。分別取吳茱萸（W1～W10）、制吳茱萸（ZW1～ZW10），依照“2.2.2”配制供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)樣檢測，記錄數(shù)據(jù)，并將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012年版）軟件，采用平均數(shù)法和多點(diǎn)校正法，設(shè)置時間寬度為0.10 min，分別生成吳茱萸和制吳茱萸的指紋圖譜疊加圖和對照圖譜，見圖2～4。

指紋圖譜中，共標(biāo)定出12個共有峰，其中9號峰峰面積穩(wěn)定、響應(yīng)值高、分離度好，故定為參照峰。通過與對照品比對，共指認(rèn)出5、6、8～10號峰等5個共有峰，依次為綠原酸、金絲桃苷、檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿，結(jié)果見圖4。以9號峰為參照峰，計(jì)算各批次樣品共有峰的相對峰面積，各共有峰的RSD為16.639%～82.074%。

5-綠原酸 6-金絲桃苷 8-檸檬苦素 9-吳茱萸堿 10-吳茱萸次堿

圖2 10批吳茱萸樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖

圖3 10批制吳茱萸樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖

5-綠原酸 6-金絲桃苷 8-檸檬苦素 9-吳茱萸堿 10-吳茱萸次堿

3.2 相似度評價

分別通過10批次吳茱萸和10批次制吳茱萸生成的共有模式為對照指紋圖譜，計(jì)算各批次之間的相似度，結(jié)果見表2?？梢?0批次吳茱萸的相似度均＞0.989，10批次制吳茱萸的相似度均＞0.985，表明吳茱萸和制吳茱萸的質(zhì)量穩(wěn)定，炮制工藝穩(wěn)定，生品與生品、炮制品與炮制品之間成分組成差異小。

表2 吳茱萸與制吳茱萸指紋圖譜相似度結(jié)果

3.3 吳茱萸與制吳茱萸各共有峰相對峰面積差異分析

比較吳茱萸與制吳茱萸的共有峰相對峰面積，可知吳茱萸炮制后，1、2、4～7、10～12號峰的相對峰面積均有不同程度的下降，其中2號峰和10號峰（吳茱萸次堿）出現(xiàn)顯著性下降，僅3號峰的相對峰面積有增加，但無顯著性變化，結(jié)果見表3和圖5，提示吳茱萸炮制前后毒效發(fā)生差異變化可能與這些成分有關(guān)。

3.4 系統(tǒng)聚類分析

將10批次吳茱萸飲片共有峰的相對峰面積分別導(dǎo)入SPSS 17.0系統(tǒng)軟件，采用組間連接法，選用平方歐氏距離為樣品間距離計(jì)算方法，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖6。吳茱萸飲片可聚為2大類，W1～W3、W10為一類（均來源于江西），W4～W9為另一類（來源于浙江和湖南），表明江西所產(chǎn)的吳茱萸與其他產(chǎn)地的在質(zhì)量上存在一定的差異。

表3 吳茱萸及制吳茱萸共有峰相對保留時間和相對峰面積(n= 10)

圖5 吳茱萸與制吳茱萸相對峰面積均值對比圖

圖6 10批吳茱萸樣品聚類分析圖

3.5 主成分分析

采用SPSS 17.0軟件對吳茱萸及制吳茱萸樣品（各10批次）的共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，以特征值及累積方差貢獻(xiàn)率為依據(jù)對共有峰進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表4、圖7。以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，共得到3個主成分因子，特征值分別為4.907、3.756、1.826，方差百分比分別為40.893%、31.298%、15.215%，累積貢獻(xiàn)率為87.405%，且碎石圖中前3個特征值的變化曲線陡峭，提示這3個主成分因子能夠揭示引起不同批次樣品間差異的信息，可作為吳茱萸和制吳茱萸的評價指標(biāo)。

表4 特征值及方差貢獻(xiàn)率

由表5可知12個變量均與主成分因子1呈正相關(guān)，其中以峰2、峰5（綠原酸）、峰6（金絲桃苷）和峰7對其貢獻(xiàn)較大；6個變量與主成分因子2成呈相關(guān)，峰8（檸檬苦素）、峰9（吳茱萸堿）和峰10（吳茱萸次堿）對其貢獻(xiàn)較大；4個變量與主成分因子3成正相關(guān)，峰12對其貢獻(xiàn)較大。對上述主成分載荷值進(jìn)行計(jì)算，得出各主成分因子的線性模型。

1＝0.34×峰1＋0.37×峰2＋0.35×峰3＋0.28×峰4＋0.40×峰5＋0.40×峰6＋0.38×峰7＋0.12×峰8＋0.08×峰9＋0.07×峰10＋0.18×峰11＋0.14×峰12

2＝?0.21×Z峰1－0.03×Z峰2－0.1×Z峰3－0.05×Z峰4＋0.08×Z峰5－0.09×Z峰6－0.17×Z峰7＋0.47×Z峰8+0.48×Z峰9＋0.48×Z峰10+0.41×Z峰11＋0.17×Z峰12

圖7 主成分分析碎石圖

表5 主成分因子載荷矩陣

3＝0.34×Z峰1＋0.33×Z峰2－0.18×Z峰3－0.34×Z峰4－0.16×Z峰5－0.16×Z峰6－0.15×Z峰7－0.12×Z峰8－0.19×Z峰9－0.15×Z峰10＋0.32×Z峰11＋0.61×Z峰12

其中，1、2、3分別代表主成分因子1、2、3的綜合得分值，Z峰1～Z峰12分別代表12個共有峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值。將各樣品數(shù)據(jù)代入上述計(jì)算模型后，可得其主成分得分，結(jié)果見表6，以3個主成分因子的得分值為軸、軸和軸建立3D散點(diǎn)圖（圖8）。結(jié)果顯示，吳茱萸與制吳茱萸的分布區(qū)域明顯不同，基本能區(qū)分開，說明吳茱萸生品與炮制品在化學(xué)成分上存在一定的差異。此外，得分圖中W1～W3、W10分布較為集中，W4～W9較為集中，與聚類分析的結(jié)果基本一致。

表6 吳茱萸不同炮制品的主成分因子得分

圖8 主成分因子得分圖

4 討論

吳茱萸為臨床常用中藥材，除銷往全國外，還有部分出口。據(jù)《中藥大辭典》[4]、《全國中草藥匯編》[5]等記載，吳茱萸原植物以栽培為主，全國各地都有大面積的栽種，主要分布在長江以南的貴州、重慶、湖南、浙江、江西、廣西等省區(qū)。魏寶陽[6]對上述產(chǎn)地2007—2010年的吳茱萸資源情況進(jìn)行實(shí)地調(diào)研，發(fā)現(xiàn)由于市場價格、土壤類型等因素的影響，已有大面積的吳茱萸栽培地被人為破壞，以江西的種植規(guī)模較大。為體現(xiàn)本項(xiàng)研究的代表性與全面性，前期結(jié)合該藥材的市場流通現(xiàn)狀，除收集了多批次代表性產(chǎn)地江西的吳茱萸藥材外，還收集了來源于有一定種植規(guī)模產(chǎn)區(qū)浙江和湖南的多批次樣本。由聚類分析結(jié)果可知，10批次吳茱萸樣品可分為2大類，W1～W3、W10為一類（均來源于江西），W4～W9為另一類（來源于浙江和湖南），與主成分分析的結(jié)果相一致?？梢姴煌a(chǎn)地的吳茱萸在質(zhì)量上還是存在差異的，推測可能與生長環(huán)境不同密切相關(guān)。

本研究前期采用DAD檢測器對吳茱萸樣品進(jìn)行了190～400 nm的全波長掃描，篩選出最優(yōu)波長；對不同色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq（Dim：250 mm×4.6 mm，5 μm）、COSMOSIL C18-MS-II（Dim：250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus（Dim：250 mm×4.6 mm，5 μm）、AccurasilC18（Dim：250 mm×4.6mm，5 μm）、Diamonil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等進(jìn)行了考察；對不同流動相系統(tǒng)乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等進(jìn)行了篩選；對梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化；對不同柱溫（20、25、30、35、40 ℃）和不同體積流量（0.6、0.8、1.0和1.2 mL/min）也進(jìn)行了篩選；同時對樣品的提取方法也都進(jìn)行了考察，包含提取溶劑、提取方式和提取時間3個方面。最終篩選優(yōu)化出本文所需的色譜條件，建立了吳茱萸及制吳茱萸的指紋圖譜，所建方法簡便、易操作、重復(fù)性好。

通過比較吳茱萸和制吳茱萸的HPLC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)兩者的相似度均大于0.985，說明兩者質(zhì)量穩(wěn)定，炮制工藝穩(wěn)定；兩者的色譜峰數(shù)量無明顯變化，有12個共有峰，其中5、6、8、9、10號峰被分別指認(rèn)出，依次為綠原酸、金絲桃苷、檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿。通過比較共有峰的相對峰面積，發(fā)現(xiàn)1、2、4、5（綠原酸）、6（金絲桃苷）、7、10（吳茱萸次堿）、11和12號峰在炮制后的相對峰面積均有不同程度的下降，其中2號峰和10號峰（吳茱萸次堿）出現(xiàn)顯著性下降，僅3號峰的相對峰面積在炮制后出現(xiàn)增加，卻無顯著性變化，由此可知吳茱萸炮制后所含化學(xué)成分發(fā)生了一定程度的量變。

吳茱萸所含化學(xué)成分較多，以生物堿類、檸檬苦素類和揮發(fā)油類占比最高，其中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素是評價吳茱萸及其炮制品質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)，臨床顯示它們也是吳茱萸發(fā)揮藥效的主要活性成分。文獻(xiàn)報道吳茱萸堿具有抗癌、抗炎、抗菌、調(diào)脂、舒張血管、改善肥胖、保護(hù)神經(jīng)等藥理作用[7]，吳茱萸次堿具有保護(hù)心臟、擴(kuò)張血管、降血壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌、抗抑郁、抗肥胖等藥理作用[8]，檸檬苦素具有抗胃潰瘍、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[9-10]，然而Li等[11]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從吳茱萸藥材中篩選出了薯蕷皂苷元、吳茱萸次堿、吳茱萸堿、粉防己堿、柴胡皂苷D等6種可能導(dǎo)致肝損傷的生物堿；李文蘭等[12]運(yùn)用UPLC-Q- TOF-MS法檢測吳茱萸的致肝毒性部位，鑒定出吲哚類生物堿、喹諾酮類生物堿、三萜、黃酮、有機(jī)酸等29個成分；伊利順等[13]發(fā)現(xiàn)吳茱萸的揮發(fā)油組分也可導(dǎo)致動物肝臟損傷；張茜等[14]通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大劑量的吳茱萸次堿可能對肝腎具有一定的毒性作用。本研究的主成分分析結(jié)果顯示吳茱萸與制吳茱萸樣品分布區(qū)域存在明顯不同，提示兩者的化學(xué)成分確實(shí)存在差異，并且兩者的共有峰中2、5（綠原酸）、6（金絲桃苷）、7、8（檸檬苦素）、9（吳茱萸堿）、10（吳茱萸次堿）和12號峰對吳茱萸炮制前后化學(xué)成分差異變化的貢獻(xiàn)較大。結(jié)合共有峰相對峰面積差異分析的結(jié)果及文獻(xiàn)報道，推測上述色譜峰所對應(yīng)的化學(xué)成分含量降低可能是降低吳茱萸炮制后毒性的因素，以有顯著性降低的2號峰和10號峰（吳茱萸次堿）為主要因素。

綜上，本研究建立的吳茱萸及制吳茱萸HPLC指紋圖譜，能真實(shí)地反映吳茱萸炮制前后化學(xué)成分變化，聯(lián)合聚類分析和主成分分析可為闡釋吳茱萸炮制后毒性降低機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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HPLC fingerprint ofand processedbased on cluster analysis and principal component analysis

MA Xiang-hui, LIU Ye, JIANG heng-li, WANG Shuang-shuang, KANG Ya-juan, CHEN Yun-long, CAO Li-juan

Tianjin Key Laboratory of TCM Decoction Processing Technology Enterprise, China Medico Corporation, Tianjin 300301, China

To establish HPLC fingerprints ofand processed, evaluate the quality ofand processedby similarity calculation and chemical pattern recognition method, explore the changes of chemical components before and after processing, and explain the mechanism of toxicity reduction after processing.The fingerprints ofand processedwere established by HPLC, and the similarity evaluation system of Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint (2012 edition) and SPSS17.0 software were used for similarity evaluation, cluster analysis (CA) and principal analysis (PCA).The fingerprint similarity ofand preparedwere greater than 0.985, and they all contained 12 identical common peaks, five of which were recognized.Using evodiamine as the reference peak, comparing the relative peak area of common peaks, it was found that the common peaks of processeddecreased in varying degrees except peak 3, and there were significant decreases in peak 2 and peak 10.The results of cluster analysis showed that the raw products ofcould be divided into two categories, one from Jiangxi and the other from Zhejiang and Hunan.Principal component analysis results showed that the cumulative variance contribution rate of the first three principal component factors was 87.405%, with peak 2, peak 5 (chlorogenic acid) and peak 6 (hypericin), peak 7, peak 8 (limonin), peak 9 (evodiamine), peak 10 (rutacarpine) and peak 12 contribute greatly to the difference of chemical components before and after processing.The construction of HPLC fingerprint and chemical pattern recognition ofcan provide a scientific basis for explaining the mechanism of toxicity reduction after processing.

(Juss.) Benth.; processed(Juss.) Benth.; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; chlorogenic acid; hypericin; limonin; evodiamine; rutacarpine

R286

A

0253 - 2670(2022)10 - 3171 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.028

2021-10-09

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707000）

馬向慧（1991—），女，碩士，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 18222016292 E-mail: maxianghui@linmura.com.cn

通信作者：曹麗娟，研究員，主要從事中藥材及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: caolijuan@linmura.com.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]