基于UPLC-Q/TOF-MS的金振口服液在大鼠體內(nèi)外源物表征

張嘉穎，李海波，劉苓嫻，石丹楓，王振中，曹 亮，姚新生，肖 偉*，于 洋*

基于UPLC-Q/TOF-MS的金振口服液在大鼠體內(nèi)外源物表征

張嘉穎1，李海波2，劉苓嫻1，石丹楓1，王振中2，曹 亮2，姚新生1，肖 偉2*，于 洋1*

1.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

采用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)對(duì)大鼠ig金振口服液后的血漿、尿液、膽汁和糞便中的原型成分及代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，描繪金振口服液體內(nèi)代謝輪廓，初步揭示其體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)。采用Waters ACQUITYTMBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫，體積流量0.4 mL/min，柱溫40 ℃。電噴霧離子源（ESI），centroid 模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集?；诟叻直尜|(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)，建立5步檢識(shí)策略來(lái)表征金振口服液在大鼠體內(nèi)的相關(guān)外源物。大鼠ig金振口服液，在生物樣本中共檢識(shí)112個(gè)外源性成分，包括44個(gè)原型成分（22個(gè)成分經(jīng)對(duì)照品比對(duì)）和68個(gè)代謝產(chǎn)物，主要的代謝途徑為II相代謝葡萄糖醛酸化、硫酸化及I相代謝甲基化等。采用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)及建立的檢識(shí)策略可對(duì)金振口服液在大鼠血漿、尿液、糞便和膽汁中的外源物進(jìn)行快速有效的定性檢識(shí)，有助于揭示其體內(nèi)藥效成分，為其藥動(dòng)學(xué)特征的描繪及建立與功效相關(guān)聯(lián)的質(zhì)量控制方法提供一定的參考依據(jù)。

金振口服液；UPLC-Q/TOF-MS；原型成分；代謝產(chǎn)物；黃芩苷；甘草苷

金振口服液（Jinzhen Oral Liquid，JZOL）為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家產(chǎn)品，由山羊角、大黃、黃芩、平貝母、人工牛黃、石膏、青礞石、甘草8味中藥組成，已列為國(guó)家中藥保護(hù)品種[1]。方中山羊角、黃芩、平貝母為君藥，其中山羊角具有解熱、鎮(zhèn)靜和抗驚厥的功效，黃芩通腹泄肺熱，平貝母清熱散結(jié)、化痰止咳；大黃、石膏、人工牛黃為臣藥，大黃瀉熱通腑，使肺之痰熱由下而解，生石膏瀉火、化痰，協(xié)助君藥清泄肺熱，人工牛黃降溫、化痰、止咳、平喘；青礞石為佐藥，墜痰下氣，平肝定驚；甘草為使藥，和中緩急，調(diào)和諸藥；諸藥合用，共奏清熱解毒、去痰止咳的功效[2]。金振口服液臨床上主要用于治療小兒急性支氣管炎符合痰熱咳嗽者[3-4]，表現(xiàn)為咳嗽、咳吐不爽、咳吐黃痰、發(fā)熱、舌質(zhì)紅、苔黃膩。其療效可靠、不良反應(yīng)少、服用方便、依從性高，是我國(guó)兒童醫(yī)療保險(xiǎn)品種，被譽(yù)為治療小兒肺熱咳嗽的妙藥[5]。

前期采用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)描繪了JZOL的整體化學(xué)輪廓，共檢識(shí)鑒定了90余個(gè)化學(xué)成分，總結(jié)了不同結(jié)構(gòu)類型化合物的色譜行為和碎片裂解途徑，為金振口服液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考。到目前為止，JZOL在臨床試驗(yàn)、藥理學(xué)和質(zhì)量控制等領(lǐng)域都進(jìn)行了大量的研究[6-8]。其中，JZOL中組方藥味及相關(guān)單體化合物的代謝研究報(bào)道較多[9-14]，為JZOL體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析和鑒定奠定了一定的基礎(chǔ)。然而，對(duì)于口服JZOL后外源性成分的入血情況及其在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化的報(bào)道甚少，給藥效的深入研究、臨床安全用藥及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提升造成了一定的困難。因此，有必要對(duì)JZOL進(jìn)行全面地體內(nèi)代謝產(chǎn)物表征。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q/TOF-MS），建立一種快速有效的JZOL在大鼠體內(nèi)外源性成分及代謝途徑的分析方法，為其藥動(dòng)學(xué)特征描繪及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升奠定基礎(chǔ)，也為JZOL深入的藥理活性研究及進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備

超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀：色譜系統(tǒng)為Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜儀，Waters ACQUITYTMI-Class超高效液相色譜儀（包括二元梯度泵-自動(dòng)進(jìn)樣器-柱溫箱-二極管陣列檢測(cè)器）；質(zhì)譜系統(tǒng)為Waters SYNAPTTMG2 Q/TOF HDMS四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（Manchester，U.K.）；Waters ACQUITYTMBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；Sartorius BP 211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；Anke TGL-16G-A型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Sigma臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)3K-15（德國(guó)Sigma公司）。

1.2 試劑與材料

質(zhì)譜用水，北京屈臣氏蒸餾水有限公司；質(zhì)譜級(jí)乙腈及甲醇，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；質(zhì)譜級(jí)甲酸，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；JZOL制劑，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)201114）。甘草苷（批號(hào)110714-201711）、黃芩苷（批號(hào)110715- 201821）、大黃酸（批號(hào)110757-201607）、漢黃芩素（批號(hào)111514-201706）、膽酸（批號(hào)100078- 201415）、豬去氧膽酸（批號(hào)100087-201411）、去氧膽酸（批號(hào)110724-201808）、黃芩黃酮Ⅱ（批號(hào)111610-201908），以上均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；漢黃芩苷（批號(hào)BP1454）、異甘草素（批號(hào)BP0787）、千層紙苷（批號(hào)BP1046）、白楊素7--β--葡萄糖醛酸（批號(hào)BP3423）、(18β,20)-甘草酸（批號(hào)BP2052）、甘草次酸（批號(hào)BP0681），以上購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；蘆薈大黃素-8--β--葡萄糖苷（批號(hào)DST141028-013）、甘草素（批號(hào)DST190920-010）、異甘草苷（批號(hào)DST190802-142），購(gòu)自成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司；甘草酸（批號(hào)B20417）、大黃酚-8--β--葡萄糖苷（批號(hào)B20239），購(gòu)自源葉生物有限公司；貝母素乙（批號(hào)B20081-20），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；甘草皂苷G2、甘草素二糖苷為課題組自制，所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

1.3 動(dòng)物

雄性SPF 級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物房溫度（23±2）℃，濕度（55±10）%，大鼠每天接受光照12 h，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)暨南大學(xué)倫理審批（20220304-010）。

2 方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 大鼠ig溶液的配制 取10支JZOL（10 mL/支，共100 mL，批號(hào)201114），采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至20 mL，作為JZOL大鼠ig溶液。

2.1.2 分組及給藥 大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，隨機(jī)分成2組：給藥組（＝6）和對(duì)照組（＝4），給藥組大鼠ig給藥JZOL濃縮液7.576 g/(kg·d)（生藥量），對(duì)照組ig給予等量飲用水。連續(xù)ig 5 d，最后1 d ig后，分別采集大鼠0.5、1、2、4 h肝門靜脈血置于涂有肝素鈉溶液的2 mL EP管中，14 000 r/min離心10 min制備血漿樣本，合并各時(shí)間點(diǎn)血漿，?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。收集給藥后第3～5天的尿液和糞便；取最后1次給藥后0～8 h膽汁。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷、漢黃芩苷、甘草苷、甘草酸、大黃酸、貝母素乙等對(duì)照品適量，加甲醇定容至10 mL，配制成各化合物終質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。經(jīng)14 000 r/min高速離心10 min后，取上清液進(jìn)樣UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.2.2 JZOL樣品溶液的制備 取JZOL適量，經(jīng)14 000 r/min高速離心10 min后，取上清液進(jìn)樣UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.3 體內(nèi)樣品前處理

2.3.1 血漿樣品的制備 取100 μL血漿樣品于1.5 mL EP管中，加入400 μL冰乙腈沉淀蛋白，渦旋2 min，經(jīng)14 000 r/min高速離心10 min后，上清液常溫下氮?dú)獯蹈桑?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋2 min，14 000 r/min高速離心20 min，取4 μL上清液進(jìn)樣UPLC-Q/TOF-MS分析?？瞻籽獫{樣品處理方法同上。

2.3.2 膽汁樣品前處理 混合不同時(shí)間段的給藥組膽汁樣本，取收集的膽汁樣本上樣于活化平衡后的SPE小柱，待其充分吸附后，先用3 mL 5%的甲醇-水溶液洗去極性大的雜質(zhì)，再用3 mL純甲醇進(jìn)行洗脫，收集純甲醇洗脫部位，在室溫下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL純甲醇復(fù)溶，經(jīng)14 000 r/min高速離心20 min后，取4 μL上清液進(jìn)樣UPLC-Q/TOF-MS分析?？瞻啄懼幚矸椒ㄍ?。

2.3.3 尿液樣品前處理 將不同時(shí)間段的給藥組尿液樣本混合，14 000 r/min高速離心10 min，上清液濃縮至6 mL，上樣于活化平衡后的SPE小柱，每次1 mL，重復(fù)6次。其他處理步驟同膽汁樣品?？瞻啄蛞簶颖景赐N方法處理并進(jìn)樣分析。

2.3.4 糞便樣品前處理 混合給藥組的糞便樣本，風(fēng)干。干糞便樣本（1 g）粉碎成粉末后置錐形瓶中，加入10 mL純甲醇，浸泡24 h后，超聲提取30 min，過(guò)濾取上清液，經(jīng)14 000 r/min高速離心10 min后，上清液常溫下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)? mL純水復(fù)溶后，上樣于活化平衡后的SPE小柱，其他處理步驟同膽汁樣品?？瞻准S便處理方法相同。

2.4 UPLC-Q/TOF-MS條件

2.4.1 色譜檢測(cè)條件 Waters ACQUITYTMBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫40 ℃；體積流量0.4 mL/min；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）- 0.1%甲酸乙腈（B）。洗脫梯度：0～13 min，50% B；13～16 min，50%～100% B；16～17 min，100% B；17～18 min，100%～5% B。

2.4.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 電噴霧離子化源（ESI），離子源毛細(xì)管電壓正離子模式3.0 kV，負(fù)離子模式?2.5 kV，錐孔電壓正離子模式35 V，負(fù)離子模式為40 V。二級(jí)錐孔電壓4 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣體積流量600 L/Hr，在MSE模式中，低能通道碰撞能6 eV，高能通道碰狀能20～50 eV。質(zhì)譜掃描范圍為/50～1500，以甲酸鈉溶液校正質(zhì)量軸，以亮氨酸腦啡肽為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)量精度，LockSprayTM體積流量5 μL/min。數(shù)據(jù)采集為centroid 模式。

閉式熱水系統(tǒng)壓力膨脹罐的選型需結(jié)合具體熱水系統(tǒng)經(jīng)計(jì)算后選定，同一系統(tǒng)熱水回水溫度設(shè)定值不同則所需壓力膨脹罐的體積也不同且差距明顯。用水點(diǎn)多的大型熱水系統(tǒng)壓力膨脹罐體積較大，在熱水設(shè)備房專業(yè)提資時(shí)需充分考慮其安裝位置。

2.5 數(shù)據(jù)采集及分析技術(shù)

數(shù)據(jù)采集應(yīng)用Waters Masslynx 4.1質(zhì)譜控制平臺(tái)，在MSE模式下采集分析樣本總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）。目標(biāo)物篩選應(yīng)用基于MDF技術(shù)的Waters MetabolynxTM數(shù)據(jù)處理軟件。高分辨質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)（mass defect filter，MDF）是指一個(gè)化合物的準(zhǔn)確分子質(zhì)量和該化合物的整數(shù)質(zhì)量之間的差值，是一項(xiàng)隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展而誕生的一種技術(shù)[15]。數(shù)據(jù)處理參數(shù)設(shè)置如下：分析窗口0～16 min，質(zhì)量殘差過(guò)濾窗口設(shè)置±70 mDa，代謝物質(zhì)量數(shù)波動(dòng)窗口0.02；代謝物與空白樣本匹配保留時(shí)間波動(dòng)范圍±0.4 min；峰面積大于10倍以上，以甲基化等常見代謝反應(yīng)設(shè)置質(zhì)量虧損數(shù)據(jù)庫(kù)[16]。

3 結(jié)果與分析

采用“2.4”項(xiàng)的UPLC-Q/TOF-MS條件，在正、負(fù)離子模式下，對(duì)JZOL、給藥組及空白組生物樣本（血漿、尿液、糞便、膽汁）進(jìn)行檢測(cè)分析。課題組前期對(duì)JZOL的化學(xué)成分進(jìn)行快速檢識(shí)，根據(jù)復(fù)方的檢識(shí)結(jié)果，以空白大鼠生物樣本作為對(duì)照，共檢識(shí)到112個(gè)大鼠體內(nèi)外源物。其中原型成分共44個(gè)（22個(gè)成分經(jīng)對(duì)照品準(zhǔn)確指認(rèn)，結(jié)構(gòu)見圖1），代謝產(chǎn)物共68個(gè)（數(shù)據(jù)見表1，離子色譜提取圖見圖2、3），TOF-MS的測(cè)得值與理論值比較，精確質(zhì)量數(shù)的誤差均小于1×10?5。

3.1 JZOL吸收成分及代謝產(chǎn)物分析策略

采用5步策略法表征igJZOL后大鼠體內(nèi)相關(guān)外源物。（1）根據(jù)前期對(duì)JZOL化學(xué)成分表征所建立的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)比較其保留時(shí)間和碎片離子確定原型成分。（2）基于MDF技術(shù)處理篩選大鼠生物樣本中的潛在代謝物。JZOL中的成分可以根據(jù)其不同的基本骨架劃分為幾個(gè)類型，其中同源成分是在其基本結(jié)構(gòu)上被不同的取代基取代[17]。因此，這一步最關(guān)鍵是確定幾個(gè)具有代表性的結(jié)構(gòu)，以便于JZOL在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物分析。（3）基于文獻(xiàn)檢索，從文獻(xiàn)中尋找代表性化合物的代謝反應(yīng)和特征碎片離子。（4）與空白生物樣品的對(duì)比，找出潛在代謝物。（5）識(shí)別和確認(rèn)大鼠生物樣本中代謝物的分子離子和碎片離子。綜上，本實(shí)驗(yàn)將五步策略法應(yīng)用于描述JZOL在大鼠體內(nèi)的代謝特征。

3.2 原型成分的鑒定

在給藥組（JZOL）的大鼠血漿、尿液、糞便和膽汁中鑒定出44個(gè)原型成分（22個(gè)成分經(jīng)對(duì)照品比對(duì)），包括21個(gè)黃酮類成分、6個(gè)三萜類成分、6個(gè)膽烷酸類成分、5個(gè)生物堿類成分、4個(gè)蒽醌類成分、2個(gè)有機(jī)酸類成分。其中來(lái)源于血漿中29個(gè)、尿液中34個(gè)、膽汁中7個(gè)、糞便中20個(gè)（圖1和表1）。

通過(guò)對(duì)比空白與含藥樣品色譜峰的保留時(shí)間及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合對(duì)照品及JZOL化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對(duì)JZOL體內(nèi)原型成分進(jìn)行了鑒定，其色譜圖如圖3所示。P6的準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/431.098 0，確定分子式為C21H20O10，二級(jí)碎裂給出碎片離子為[M－H－Glc]?/269.045 0，[M－H－Glc－CH2O]?/239.035 2，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，鑒定P6為蘆薈大黃素-8--β--葡萄糖苷。

P23的準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/459.092 4，確定分子式為C22H20O11，脫去葡萄糖醛酸形成碎片離子[M－H－GluA]?/283.060 4，再脫去CH3形成/268.036 6，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[16]，P23鑒定為漢黃芩苷?；衔颬14（R＝6.06 min）、P18（R＝7.34 min）在負(fù)離子模式下質(zhì)譜圖中顯示出相同的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?/445.077 7，確定分子式為C21H18O11，MSE高能圖中均給出脫掉1分子葡萄糖醛酸形成的特征碎片離子[M－H－GluA]?/269.045 0。此外，P18檢識(shí)到碎片峰[M－H－GluA－2CO－H2O]?/195.045 8。P14在血漿、尿液及膽汁中檢出，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，確定為黃芩苷。經(jīng)過(guò)裂解規(guī)律分析及課題組前期體外檢識(shí)結(jié)果對(duì)比[18]，化合物P18確定為去甲漢黃芩素-7--β--葡萄糖醛酸，在血漿、尿液及糞便中均有檢出。

*表示經(jīng)對(duì)照品準(zhǔn)確指認(rèn)

表1 大鼠生物樣品中JZOL原型及代謝產(chǎn)物的UPLC-Q/TOF-MS數(shù)據(jù)

續(xù)表1

續(xù)表1

P-原型成分 M-代謝產(chǎn)物；P、U、B和F代表血漿、尿液、膽汁和糞便樣本；*與對(duì)照品比較；gluA-葡萄糖醛酸化結(jié)合；sul-硫酸化結(jié)合

P-prototypes M-metabolites; P, U, B and F represent plasma, urine, bile and fecal samples; *compared with the reference substance; gluA-glucuronide; sul-sulfate

圖2 漢黃芩苷和黃芩苷可能的代謝途徑

通過(guò)查閱文獻(xiàn)、與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間及碎片信息等，共準(zhǔn)確指認(rèn)了包括甘草素二糖苷、異甘草素二糖苷[16,19]等在內(nèi)的22個(gè)原型成分。

3.3 代謝物的鑒定

基于策略第3步，定義了6個(gè)化合物為代表結(jié)構(gòu)，涵蓋了JZOL的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)類型（黃酮、三萜、生物堿、蒽醌）：甘草苷、黃芩苷、漢黃芩素、甘草酸、貝母素乙、大黃酸。將6種代表性結(jié)構(gòu)的分子式輸入Metabolynx XS軟件，分別進(jìn)行了處理。通過(guò)對(duì)軟件處理預(yù)測(cè)所得潛在的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，最終在ig JZOL后的大鼠的生物樣本中共檢識(shí)到68個(gè)JZOL相關(guān)的代謝物，包括30個(gè)黃酮類成分，23個(gè)生物堿類成分、9個(gè)蒽醌類成分和6個(gè)三萜類成分（表1和圖3～5，圖4為部分代表性代謝產(chǎn)物色譜和碎片離子譜圖）。將甘草苷的分子式（C21H22O9）輸入Metabolynx XS軟件計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，其主要發(fā)生的代謝反應(yīng)包括還原、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化，基于MDF技術(shù)類似外源物篩選出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行抽提，通過(guò)代謝特征及文獻(xiàn)比對(duì)結(jié)果確定代謝產(chǎn)物。

甘草苷結(jié)構(gòu)中含有1分子葡萄糖，在體內(nèi)容易丟失葡萄糖，以苷元的形式存在[20]。代謝物M13準(zhǔn)分子離子峰為[M－H]?/431.097 5，保留時(shí)間為3.74 min，分子式為C21H20O10，MSE模式下主要碎片離子為/255.065 3、135.008 8、119.049 1，且碎片離子/255.065 3為母離子丟失176（C6H8O6）產(chǎn)生，推測(cè)M13為甘草素的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。同樣的，保留時(shí)間在6.23 min的色譜峰M36也為甘草素不同位點(diǎn)的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。因此，判斷M13和M36分別為甘草素-7--β--葡萄糖醛酸苷和甘草素-4′--β--葡萄糖醛酸苷[20]。

P、U、B、F分別代表大鼠血漿、尿液、膽汁和糞便樣本；Pos和Neg分別表示正負(fù)離子模式；*表示經(jīng)對(duì)照品準(zhǔn)確指認(rèn)的原型成分；Prot代表原型成分；Meta 表示代謝產(chǎn)物

M5、M24的準(zhǔn)分子離子同為[M－H]?/335.023 1，確定分子式為C15H12O7S，脫去1分子硫酸酯基（80）形成[M－H－SO3]?/255.066 1碎片離子，與甘草素的準(zhǔn)分子離子（/255.066 1）相同，且發(fā)生RDA裂解，形成/135.008 6與119.049 8的碎片離子，與甘草素裂解碎片相同，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21]，甘草素經(jīng)過(guò)硫酸酯結(jié)合代謝途徑形成甘草素-7--硫酸酯和甘草素-4′--硫酸酯，結(jié)合位點(diǎn)與葡萄糖醛酸化途徑相似，且前者保留時(shí)間先于后者，M5和M24的保留時(shí)間為3.10、4.36 min，綜合文獻(xiàn)報(bào)道[20]可判斷M5為甘草素-7--硫酸酯，M24為甘草素-4′--硫酸酯。

M4的準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/511.055 1，保留時(shí)間為3.03 min，確定分子式為C21H20O13S，脫去1分子葡萄糖醛酸（176）形成[M－H－GluA]?/335.023 2 的碎片離子，提示其為通過(guò)葡萄糖醛酸化代謝途徑所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，又脫去SO3形成與甘草素準(zhǔn)分子離子相同碎片離子，提示可能經(jīng)過(guò)了硫酸酯結(jié)合代謝途徑，推測(cè)M3為甘草素的硫酸酯和葡萄糖醛酸結(jié)合物。

黃芩苷的準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/445.077 1，在體內(nèi)易脫去葡萄糖醛酸，以其苷元黃芩素（/269.044 5）存在[22]，給藥后可在大鼠血漿中發(fā)現(xiàn)。黃芩素在體內(nèi)易發(fā)生硫酸酯化反應(yīng)，結(jié)合1分子硫酸酯基（80）形成準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/349.001 8 的硫酸化產(chǎn)物M16、M52。同時(shí)，再結(jié)合1分子葡萄糖醛酸（176）形成準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/525.033 9，葡萄糖醛酸化和硫酸酯化合物M8、M11、M33。M55、M58分別在8.27、9.04 min出峰，前者丟失176，后者丟失80均形成[M－H]?/283.060 7碎片離子，進(jìn)一步丟失15（CH3）得到268.037 8，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)[23]，M55、M58為黃芩素在體內(nèi)甲基化后的葡萄糖醛酸化和硫酸酯化產(chǎn)物。

圖4 JZOL的主要代謝產(chǎn)物的MS色譜圖

圖5 JZOL在大鼠體內(nèi)的代謝特征

漢黃芩苷（[M－H]?/459.092 7），在體內(nèi)易脫去1分子葡萄糖醛酸形成漢黃芩素，M46的準(zhǔn)分子離子[M－H]?/459.093 2與漢黃芩苷相同，其碎片離子為 [M－H－GluA]?/283.059 0，推測(cè)其為漢黃芩素-5--葡萄糖醛酸苷。漢黃芩素在體內(nèi)易發(fā)生去甲基化反應(yīng)，M59的準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/269.044 9，其碎片離子為[M－H－H2O]?/251.034 7，[M－H－CO]?/241.049 9，[M－H－CO－H2O]?/223.040 1，與漢黃芩素裂解規(guī)律相同，推測(cè)其為漢黃芩素丟失1分子甲基（14）后形成。M30為[M－H]?/635.124 4，確定分子式為C28H28O17，碎片離子/459.091 6，為母離子丟失葡萄糖醛酸（176）而形成，提示結(jié)構(gòu)里含有1分子葡萄糖醛酸，碎片離子/283.060 6為/459.091 6脫去葡萄糖醛酸（176）形成，與漢黃芩素準(zhǔn)分子離子相同，提示可能是經(jīng)過(guò)葡萄糖醛酸化代謝途徑產(chǎn)生，推測(cè)M30為漢黃芩素的2分子葡萄糖醛酸結(jié)合形成的代謝產(chǎn)物（圖2）。

生物堿主要的活性成分為貝母素乙，生物堿類化合物在正離子模式下出峰，負(fù)離子下無(wú)響應(yīng)。通過(guò)Metabolynx XS軟件對(duì)貝母素乙進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其以I相代謝為主，易發(fā)生水合反應(yīng)、還原反應(yīng)和羥基化，相關(guān)代謝產(chǎn)物在血中幾乎無(wú)響應(yīng)，主要存在于尿液和糞便當(dāng)中。M1準(zhǔn)分子離子為[M＋H]+/448.342 4，脫去1分子H2O得到/430.332 5，與原型成分貝母素乙的準(zhǔn)分子離子相同。連續(xù)丟失2分子H2O，得到/412.320 3，判斷M1為貝母素乙的水合化產(chǎn)物。M15準(zhǔn)分子離子為[M＋H]+/446.326 4，為貝母素乙的羥基化代謝產(chǎn)物。M45保留時(shí)間為7.18 min，準(zhǔn)分子離子為[M＋H]+/416.316 0，脫去1分子H2O得到[M＋H－H2O]+/398.305 9，同時(shí)檢測(cè)到其他碎片[M＋H－2H]+/414.304 1，[M＋H－C18H26O2]+/141.102 6，符合貝母素乙的裂解規(guī)律，判斷M45為貝母素乙的去甲基化合物。

甘草酸分子結(jié)構(gòu)中由1分子甘草次酸和2分子葡萄糖醛酸組成，在體內(nèi)易丟失2分子葡萄糖醛酸而水解形成苷元[24]，以苷元的形式發(fā)生I相及Ⅱ相代謝反應(yīng)，主要代謝產(chǎn)物能在血中檢出。M65的保留時(shí)間為13.41 min，準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/485.327 0，確定分子式為C30H46O5，其碎片信息為[M－H－C6H8O]?/389.270 0，推測(cè)該代謝物為甘草次酸羥基化產(chǎn)物。

蒽醌類主要的活性代表成分為大黃酸，大黃酸發(fā)生I相和II相代謝。I相代謝以甲基化、羥基化為主。M62的保留時(shí)間為10.40 min，準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/297.040 9，確定分子式為C16H10O6，其碎片信息為[M－H－CO2]?/253.051 7，[M－H－CO2－CO]?/225.055 1，與文獻(xiàn)報(bào)道的相同[24]，因此確定該代謝物為大黃酸甲基化產(chǎn)物。結(jié)合CH3后，極易發(fā)生II相代謝，得到葡萄糖醛酸化產(chǎn)物（M42）。II相代謝以葡萄糖醛酸化和硫酸化為主。M21保留時(shí)間為4.19 min，準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/362.981 2，脫去1分子硫酸酯基（80），得到[M－H－SO3]?/283.024 3碎片離子，與大黃酸的準(zhǔn)分子離子相同，同時(shí)還檢測(cè)到碎片[M－H－SO3－CO2]?/239.034 7，[M－H－SO3－CO2－CO]?/211.039 5，可以判斷M21為大黃酸的硫酸酯結(jié)合物。

此外，文獻(xiàn)報(bào)道[25]大黃酸在體內(nèi)易發(fā)生還原反應(yīng)，還原成蒽酮類化合物（M64：大黃酸-9-蒽酮），大黃酸-9-蒽酮發(fā)生Ⅱ相代謝，結(jié)合SO3，準(zhǔn)分子離子為[M－H]?/349.001 8（C15H10O8S）的硫酸酯結(jié)合物M56為大黃酸-9-蒽酮-8--硫酸酯。

4 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合五步分析策略法對(duì)JZOL大鼠ig后體內(nèi)原型成分及代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速檢識(shí)，鑒定了112個(gè)源自JZOL的外源性成分，包括44個(gè)原型成分和68個(gè)代謝產(chǎn)物。其中，共29個(gè)原型成分和31個(gè)代謝成分被吸收入血。上述結(jié)果表明，JZOL吸收入血成分主要為黃酮類、三萜類和蒽醌類。在大鼠體內(nèi)主要代謝反應(yīng)類型為水合、羥基化、葡萄糖醛酸化及硫酸酯化等。

以黃芩苷為代表的黃酮類成分是JZOL的藥效成分。有研究表明黃芩苷及其衍生物具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等多種重要的藥理作用[21-24]，同時(shí)黃芩苷入血迅速，能在體內(nèi)產(chǎn)生多種類型的代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)與空白樣品的比較，共檢測(cè)到了5個(gè)黃芩苷相關(guān)代謝產(chǎn)物，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，主要為黃芩苷葡萄糖醛酸化代謝物、黃芩素硫酸酯化代謝物、3個(gè)黃芩素葡萄糖醛酸和硫酸化代謝物[22]。本實(shí)驗(yàn)中，平貝母的生物堿成分的相關(guān)原型在血中幾乎沒(méi)有檢出，其主要暴露于尿液中，這可能與生物堿類成分在血中的達(dá)峰時(shí)間較快，半衰期較短[26]，藥物成分經(jīng)血液循環(huán)至腎小球中，隨尿液排出；另一種可能是由于JZOL作為一個(gè)復(fù)方制劑，藥味多，所含化學(xué)成分復(fù)雜，各個(gè)成分在吸收入血過(guò)程中可能形成競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同作用，而未表現(xiàn)出與單味藥或單個(gè)成分相同的多種代謝途徑?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，后期可以聚焦入血代表性活性成分，探究口服JZOL后，大鼠血漿中多成分藥動(dòng)學(xué)特征，以揭示JZOL發(fā)揮臨床功效的體內(nèi)潛在藥效物質(zhì)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Characterization of xenobiotics of Jinzhen Oral Liquid in rats based on UPLC-Q/TOF-MS

ZHANG Jia-ying1, LI Hai-bo2, LIU Ling-xian1, SHI Dan-feng1, WANG Zhen-zhong2, CAO Liang2, YAO Xin-sheng1, XIAO Wei2, YU Yang1

1.Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Jinan University, Guangzhou 510632, China 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China

To study the prototypes and their metabolites in rat plasma, urine, bile and feces after intragastric administration of Jinzhen Oral Liquid (金振口服液, JZOL) by UPLC-Q/TOF-MS technique.A Waters ACQUITYTMBEH C18column (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) was used for gradient elution with mobile phase 0.1% formic acid aqueous solution (A) and 0.1% formic acid acetonitrile (B), and the flow rate was 0.4 mL/min, the column temperature was 40 ℃.Electrospray ion (ESI) source was applied for the qualitative analysis under the positive and negative ion modes.Data is collected in centroid mode.Mass defect filter (MDF) technique and a five-step strategy were established to characterize the related xenobiotics of JZOL in four biological samples of rats.A total of 112 xenobiotics were identified, including 44 prototype components and 68 metabolites, of which 22 prototype components were identified with reference substance.The main metabolic pathways were phase Ⅱ metabolic reactions (mainly including glucuronidation and sulfonation) and phase Ⅰ metabolic methylation, etc.The established five-step strategy based on UPLC-Q/TOF-MS technique can be used for the rapid and effective qualitative identification of the xenobiotics in rat plasma, urine, feces and bile after oral administration of JZOL, which would be helpful to reveal the effective components.It provides some reference for the characterization of pharmacokinetic characteristics and the establishment of quality control methods related to efficacy.

Jinzhen Oral Liquid; UPLC-Q/TOF-MS; prototypes; metabolites; baicalin; liquiritin

R284.1

A

0253 - 2670(2022)10- 2956 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.004

2021-12-06

江蘇省省級(jí)工業(yè)和信息產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)專項(xiàng)資金項(xiàng)目：多組分中藥研究關(guān)鍵技術(shù)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（81903426）

張嘉穎（1997—），女，廣東省韶關(guān)市人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬锏幕钚猿煞盅芯?。E-mail: 574487287@qq.com

通信作者：于 洋，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬锘钚猿煞盅芯?。E-mail: 1018yuyang@163.com

肖 偉，研究員級(jí)高級(jí)工程師，博士生導(dǎo)師，中國(guó)工程院院士，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬锘钚猿煞盅芯?。E-mail: xw_kanion@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]