醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物多樣性研究進(jìn)展

李巧玉，譚方根，焦 富，牟明月

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

白酒是中華民族具有傳統(tǒng)特色的飲料酒，主要采用糧谷等為原料，以酒曲、活性干酵母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而成，其獨特的生產(chǎn)工藝和風(fēng)味特征使得其在國際上也享有較高聲譽(yù)，為世界六大蒸餾酒之一。同時，因釀造原料、生產(chǎn)工藝及自然環(huán)境等因素的不同，導(dǎo)致參與釀造過程的微生物菌群結(jié)構(gòu)不同，最終形成了各具風(fēng)格特色的12種不同香型。

“曲乃酒之魂”，大曲作為發(fā)酵劑為白酒發(fā)酵過程提供豐富的微生物及酶系，酒醅中微生物群落的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及其生長、代謝對白酒風(fēng)味形成起著重要的作用。目前，各研究者針對中國白酒釀造中微生物多樣性、固態(tài)發(fā)酵工藝的復(fù)雜性和風(fēng)味化合物的豐富性這3 個典型特征，基于風(fēng)味導(dǎo)向技術(shù)對中國白酒微生物發(fā)酵特征及代謝風(fēng)味物質(zhì)調(diào)控進(jìn)行了研究，將對白酒的研究從傳統(tǒng)微生物學(xué)研究深入到分子微生物學(xué)層面，從經(jīng)驗型的操作應(yīng)用提升到風(fēng)味導(dǎo)向下的微生物定向代謝風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控的微生物代謝組學(xué)層面。細(xì)菌作為醬香白酒主要微生物類群之一，是發(fā)酵生香的動力來源，酵母直接關(guān)系到產(chǎn)酒率，且能夠代謝產(chǎn)生大量不同的風(fēng)味物質(zhì)，對醬香型白酒風(fēng)格的形成具有重要作用。大曲及酒醅中的微生物直接參與了醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成，因此微生物菌群的種類及數(shù)量對白酒風(fēng)味及香型形成極其重要，本文基于此對醬香型白酒發(fā)酵過程中的微生物多樣性進(jìn)行研究方法綜述，為進(jìn)一步從微生物的角度理解醬香型白酒的發(fā)酵機(jī)理提供參考。

1 微生物多樣性研究方法進(jìn)展

1.1 微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)法

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法是根據(jù)目標(biāo)微生物對碳源、氮源、生長因子等不同營養(yǎng)物質(zhì)的需求，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)比例的營養(yǎng)成分，進(jìn)行定時定溫培養(yǎng)，然后通過形態(tài)觀察，并結(jié)合生理生化特征等進(jìn)行鑒定，分析不同可培養(yǎng)微生物的種類和數(shù)量。王曉丹等利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法從醬香型白酒酒醅中分離篩選得到和，通過純培養(yǎng)研究得出上述兩株菌分別具有產(chǎn)乙酸乙酯和產(chǎn)乙酸苯乙酯的功能。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法有利于了解分離純化得到的微生物的形態(tài)特征和生理特性，對有價值的微生物進(jìn)行保藏、應(yīng)用等，但該方法在實際應(yīng)用中工作量大、流程繁瑣，且人工模擬的環(huán)境與醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物的生長環(huán)境存在一定偏差，僅對占微生物總數(shù)0.1 %～10 %的可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分析，不能準(zhǔn)確反映微生物在自然狀態(tài)下的群落組成、分布及變化特征。

1.2 微生物免培養(yǎng)法

1.2.1 化學(xué)的非培養(yǎng)方法

化學(xué)的非培養(yǎng)方法就是指非培養(yǎng)的生理生化方法。這種方法的實現(xiàn)主要有兩種，一種是脂肪酸甲酯與磷脂脂肪酸分析法，另一種是由美國Biolog公司開發(fā)出Biolog 法。脂肪酸甲酯與磷脂脂肪酸分析法基于微生物的組成中存在的磷酸。磷酸是微生物細(xì)胞膜的重要組成成分，具有特異性，因此人們可以用放射性元素對微生物的細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，然后分析提取出含有標(biāo)記物的磷酸，進(jìn)而分析得知此種微生物在取樣環(huán)境中的分布與含量。Biolog 法的原理是在微平板上的反應(yīng)孔中有不同碳源和四唑鹽染料，微生物在利用碳源的過程中產(chǎn)生自由電子，與染料發(fā)生還原顯色反應(yīng)，顏色的深淺可反映微生物對碳源利用能力的差異，以此鑒定純種微生物或比較分析不同的微生物群落，具有直觀、快捷的特點，因此常用于微生物分類鑒定分析。化學(xué)非培法相比較傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)分析手段，能較為全面的分析體系中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物，并且更詳盡地反映微生物的變化和波動情況，但因涉及的化學(xué)試劑較多，對環(huán)境及樣品的影響較大，常用于院?；蚩蒲袡C(jī)構(gòu)對微生物多樣性的研究，較少應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程在制品分析。為使微生物鑒定從一般表型特征的鑒定，深化到遺傳特性的鑒定，研究者在傳統(tǒng)的微生物實驗鑒定技術(shù)的基礎(chǔ)之上，利用基因序列同源性分析，建立一種客觀、靈敏、快速的微生物多樣研究方法。

1.2.2 基因指紋圖譜分析法

隨著DNA 提取技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于微生態(tài)學(xué)的研究，為發(fā)酵食品微生物群落多樣性的研究帶來了良好的契機(jī)?；蛑讣y圖譜技術(shù)是基于核酸分子成分、大小和構(gòu)型上的差異，利用電泳方法將不同的核酸分子分離，形成不同分子量的基因條帶圖譜，根據(jù)圖譜上條帶信息進(jìn)行基因分析的技術(shù)?；驐l帶圖譜中，每個條帶代表不同的操作分類單位（Operational Taxonomy Unit，OTU），條帶數(shù)量反映微生物種群的多樣性和相對豐度。原核微生物多樣性分析以核糖體基因序列（Ribosomal gene sequences，rRNA）為研究對象，16S rRNA 基因具有高度的保守性和高變異性，保守性能夠反映生物物種的親緣關(guān)系，高變異性則能反映生物物種特征核酸序列的差異性，擁有豐富的數(shù)據(jù)庫等優(yōu)點。真核微生物多樣性研究主要基于18S rRNA 基因、26S rRNA 基因和5.8S rRNA 間隔區(qū)（ITS 間隔區(qū)）的擴(kuò)增和分析。王莉等通過擴(kuò)增醬香型白酒窖底泥樣本中細(xì)菌16S rDNA 的V6 區(qū)并采用Illumina高通量測序平臺進(jìn)行深度測序發(fā)現(xiàn)，隨著窖底泥的不斷馴化，、和等厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢種群。目前，基因指紋圖譜技術(shù)在發(fā)酵食品微生物多樣性分析中應(yīng)用較廣泛。

1.2.3 宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)（Metagenome）又稱元基因組學(xué)、環(huán)境（生態(tài)）基因組學(xué)、群落基因組學(xué)，是一種不依賴于人工分離培養(yǎng)的微生物基因組技術(shù)。Handelsman 等將宏基因組學(xué)定義為：以某一特定環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、尋找新基因、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。宏基因組學(xué)研究常采用穩(wěn)定同位素探針技術(shù)（Stable isotope probe technique，SIP）實現(xiàn)目的基因組的富集，根據(jù)樣品的類型制定相應(yīng)的DNA 或RNA 提取方法，研究者發(fā)現(xiàn)疊氮溴化乙錠（Ethidium Monoazide Bromide，EMA）或疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）中的疊氮化物基團(tuán)被光解并發(fā)生C—H 插入反應(yīng)可與DNA形成共價鍵，從而產(chǎn)生永久性的DNA 修飾。EMA和PMA 無法通過功能完整的細(xì)胞膜，僅能與暴露的DNA 相結(jié)合，因此可用來選擇性地修飾來自死亡細(xì)胞的暴露DNA，同時保留來自活細(xì)胞的完整DNA，從而去除環(huán)境樣品群落中死亡微生物的DNA，達(dá)到高效提取高質(zhì)量基因組的目的。構(gòu)建的基因組文庫可根據(jù)活性物質(zhì)進(jìn)行功能篩選，或根據(jù)已知序列設(shè)計特異性PCR引物、雜交探針進(jìn)行序列分析篩選，通過宏基因組測定對待研究樣品的功能進(jìn)行分析。宏基因組技術(shù)的發(fā)展，為研究白酒釀造微生物多樣性提供了新的方法和手段。目前，宏基因組學(xué)技術(shù)因解析微生物種群間的相互協(xié)作作用，常應(yīng)用于發(fā)掘白酒大曲微生物資源及大曲酒生產(chǎn)相關(guān)酶類（淀粉酶、酯酶、蛋白酶、脂肪酶、氧化還原酶等新功能酶）的研究，為新功能酶類應(yīng)用于大曲酒釀造過程中提供技術(shù)支撐。

2 醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物多樣性研究進(jìn)展

2.1 細(xì)菌多樣性

高溫大曲作為醬香型白酒發(fā)酵劑，其中原核微生物種屬較多，主要是由、和等菌群構(gòu)成，菌株在發(fā)酵過程中利用原料生成大量的呈香呈味物質(zhì)及其前體。呂錫斌等通過高通量測序技術(shù)分析醬香型白酒下造沙輪次的微生物多樣性發(fā)現(xiàn)：下沙、造沙輪次分別檢測到203 個、184 個細(xì)菌屬。下沙輪次發(fā)酵過程中主要細(xì)菌屬為、、、、，其中豐度最高；造沙輪次發(fā)酵過程中主要細(xì)菌屬為、、、、、、，其中豐度最高。胡小霞等利用高通量測序等方法分析了醬香白酒一輪次堆積和窖池發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，堆積發(fā)酵過程中、和占主要優(yōu)勢。黃蘊(yùn)利等采用高通量測序技術(shù)解析了醬香型白酒二輪次發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化、微生物多樣性以及物種與樣品之間的關(guān)系，結(jié)果表明，堆積過程中絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬有、、、，在窖內(nèi)發(fā)酵酒醅中絕對優(yōu)勢細(xì)菌屬為。醬香型白酒釀造過程中優(yōu)勢細(xì)菌屬見表1。

表1 醬香型白酒釀造過程中優(yōu)勢細(xì)菌屬

2.2 真菌多樣性

大曲中的真核微生物主要是和。主要有和等；主要是（、、）、（、、、）、、、等；呂錫斌等通過高通量測序技術(shù)分析醬香型白酒下造沙輪次的微生物多樣性發(fā)現(xiàn)：下沙、造沙輪次分別檢測到160 個、109個真菌屬。在下沙輪次發(fā)酵過程中主要真菌屬為、、、、，其中豐度最高；造沙輪次主要真菌屬為、、、、。黃蘊(yùn)利等采用高通量測序技術(shù)解析了醬香型白酒二輪次發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化、微生物多樣性以及物種與樣品之間的關(guān)系，結(jié)果表明，堆積過程中絕對優(yōu)勢真菌屬有、、、；在窖池發(fā)酵酒醅中絕對優(yōu)勢真菌屬為、、、。郭敏等通過高通量測序技術(shù)分析醬香型白酒三輪次微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，、、、是醬香型白酒發(fā)酵過程絕對優(yōu)勢的真菌微生物屬。醬香型白酒釀造過程中優(yōu)勢真菌屬見表2。

表2 醬香型白酒釀造過程中優(yōu)勢真菌屬

2.3 微生物種群間的相互作用與影響

種群是微生物的基本生存單位，執(zhí)行相關(guān)代謝功能的種群組合在一起形成了微生物系統(tǒng)。醬香型白酒所采用的糖化發(fā)酵劑主要由高溫大曲組成，曲所帶入的微生物種群不同，加之開放式的生產(chǎn)工藝，釀造環(huán)境中微生物必將進(jìn)入發(fā)酵體系，從而形成了釀造微生物的多樣性與復(fù)雜性。經(jīng)過多年的實踐與探索，范光先等認(rèn)為，醬香型釀造微生物區(qū)系平衡的研究成果對醬香型白酒釀造工藝有著指導(dǎo)意義。陳筆等研究發(fā)現(xiàn)，和是醬香型白酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢霉菌，將XJ10 與混合發(fā)酵，最終發(fā)酵液中的釀酒酵母的生物量以及乙醇產(chǎn)量，酯類、醛酮類、乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)濃度均有不同程度的增加。許焰等將來源于茅臺醬香型白酒酒醅的4 種菌株CGMCC4745、CCTCCM2014463、CGMCC3962 及共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的生長受到的抑制作用，但幾乎不受及的抑制，分析原因可能為產(chǎn)生的乙醇、有毒化合物或者營養(yǎng)競爭作用抑制了的生長。在醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物種群間相互作用，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的多樣性與復(fù)雜性，給研究帶來很大的困難，通過實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）技術(shù)實現(xiàn)系統(tǒng)中微生物的原位分析，認(rèn)識微生物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，通過調(diào)控種群結(jié)構(gòu)達(dá)到系統(tǒng)功能的最佳狀態(tài)，從而建立適用于中國白酒微生物菌群研究的新方法。

3 展望

白酒釀造微生物多樣性的研究，多年來一直是行業(yè)熱點，但是對于微生物群落和多酶體的整體認(rèn)識是片面的，影響行業(yè)人士對微生物代謝機(jī)理及功能性成分的系統(tǒng)認(rèn)識。采用高通量測序技術(shù)，解析白酒釀造發(fā)酵過程中微生物的群落演替及相互作用，同時借助代謝組學(xué)對微生物代謝產(chǎn)量進(jìn)行定性、定量分析，并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)分析方法建立微生物與功能物質(zhì)的相關(guān)性研究，進(jìn)一步探究醬香型白酒的呈香呈味機(jī)理，對于企業(yè)理論結(jié)合實際指導(dǎo)生產(chǎn)具有極其重要的意義。結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)可在提取宏基因組的過程中加入EMA 或者PMA，以選擇性地去除環(huán)境樣品群落中死亡微生物的DNA，同時保留來自活細(xì)胞的完整DNA，達(dá)到高效提取高質(zhì)量基因組的目的，保證定量分析的準(zhǔn)確性。利用EMA 或者PMA 進(jìn)行熒光定量PCR解析醬香型白酒發(fā)酵過程中大曲、酒醅、窖泥等機(jī)制中微生物組成結(jié)構(gòu)，結(jié)合微生物的相互作用分析，對于研究醬香型白酒發(fā)酵機(jī)制和呈香機(jī)理具有十分重要的意義。