高效液相色譜法同時(shí)測定牛奶中阿苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑及4種代謝物殘留量

趙雪寧，雷浩，賀習(xí)文，高勤葉，李易軒

（陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測股份有限公司，渭南 714000）

阿苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑和噻苯達(dá)唑同屬于苯并咪唑類藥物。苯并咪唑類藥物是含有2個(gè)氮原子的芳香雜環(huán)，以苯并咪唑環(huán)構(gòu)筑的藥物分子，具有廣泛的生物活性，可作為組胺受體拮抗劑、抗高血壓藥、廣譜驅(qū)蟲類藥、抗真菌藥物、抗病毒類藥物等。阿苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑和噻苯達(dá)唑均作為廣譜驅(qū)腸蟲類藥物被廣泛使用[1,2]。

苯并咪唑類藥物雖然具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和靶動(dòng)物中有致畸和致突變的作用，且在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝物具有毒理性，所以在動(dòng)物源性食品中是重點(diǎn)監(jiān)控的對象[3,4]。目前有關(guān)苯并咪唑類藥物檢測方法的報(bào)道多見于動(dòng)物組織[5]、動(dòng)物血清和飼料等基質(zhì)樣品，測定乳制品的報(bào)道相對較少。湯娟等[6]利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了奶粉中3種苯并咪唑類藥物殘留，吳宇鵬等[7]利用UPLC-MS/MS法測定了牛奶中14種苯并咪唑類藥物及部分代謝物殘留，吳鵬等[8]研制了能測定噻苯咪唑的ELISA檢測試劑盒。這些報(bào)道中大都使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，檢測成本較高，而ELISA雖然操作快捷簡單，但通常僅能篩查一種化合物，具有較大的局限性。

目前，常用的苯并咪唑檢測方法有高效液相色譜法[9～11]、ELISA法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12～17]。本研究采用經(jīng)濟(jì)實(shí)用，同時(shí)能夠準(zhǔn)確定性的高效液相色譜法，通過調(diào)整儀器條件和樣品處理過程，建立了一種能同時(shí)測定牛奶中3種苯并咪唑類藥物和4種代謝物的完整方法，該方法前處理快捷，檢出限低，回收率高，穩(wěn)定性良好，具有廣泛使用的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

Ultimate 3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；H1850型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；MS205DU型十萬分之一天平（Mettler Toledo公司）；CP224C型萬分之一天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；MX-S型渦旋混合儀（大龍興創(chuàng)儀器（北京）股份有限公司）；KQ-100DB型數(shù)控超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MTN-4800A型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

阿苯達(dá)唑（壇墨質(zhì)檢，純度97.2%）；阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜（阿爾塔科技有限公司，純度98.0%）；氟苯達(dá)唑、2-氨基氟苯達(dá)唑，噻苯達(dá)唑、5-羥基噻苯達(dá)唑（Dr.Ehrenstorfer，純度99.3%）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Sigma公司）；超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；鹽酸（優(yōu)級純，西隴科學(xué)股份有限公司）；氨水（25%優(yōu)級純）、冰乙酸（分析純）（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；2%乙酸溶液；10%鹽酸溶液。

C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱，均為200mg/3mL（月旭科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為2%乙酸溶液，0～10min 60%B，10～12min 60%B～30%B，12～17min 30%B，17～20min 30%B～60%B；流速：1.0mL/min；檢測波長：292nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.2.2 樣品前處理過程

提取：準(zhǔn)確稱取5.00g牛奶試樣，置于50mL具塞離心管中，加入10mL乙腈，渦旋混合1min，超聲提取5min，8 000r/min離心3min，準(zhǔn)確移取上清液5.00mL于10mL離心管中，40℃下氮?dú)獯蹈?，加?mL 10%鹽酸溶液復(fù)溶，待凈化。

凈化：取C18固相萃取小柱，依次用3mL甲醇、3mL水活化，將上述凈化液全部轉(zhuǎn)移至固相萃取小柱中，控制流速不超過1mL/min，待樣液全部通過固相萃取小柱后，用3mL水淋洗，抽干，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，在40℃下氮?dú)獯蹈?，加?mL甲醇復(fù)溶，過0.45μm濾膜后供高效液相色譜儀測定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：準(zhǔn)確稱取阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑亞砜、2-氨基氟苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑、5-羥基噻苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10mg，分別置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為1mg/mL的6種化合物的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；準(zhǔn)確稱取氟苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10mg于10mL棕色容量瓶中，用10%鹽酸溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為1mg/mL的氟苯達(dá)唑標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

標(biāo)準(zhǔn)混合中間液的配制：準(zhǔn)確移取7種標(biāo)準(zhǔn)貯備液各1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為100μg/mL的混合中間液。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的確定

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)阿苯達(dá)唑和氟苯達(dá)唑保留時(shí)間較長，其余5種化合物保留時(shí)間較短，因此采用水相加有機(jī)相梯度洗脫的方式。

在水相的選擇上，考察了20mmol/L乙酸銨溶液、2%乙酸溶液和0.1%磷酸溶液，其中乙酸銨溶液的洗脫時(shí)間最長，磷酸溶液的峰型尖銳，但2-氨基氟苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑砜難以分離，綜合考察下，乙酸溶液的洗脫時(shí)間和分離效果最為理想。

在有機(jī)相的選擇上，結(jié)合所使用的C18色譜柱，優(yōu)先考慮甲醇和乙腈作為有機(jī)相。使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，5-羥基噻苯達(dá)唑保留時(shí)間過短，與溶劑倒峰相連，無法進(jìn)行積分計(jì)算，同時(shí)在梯度洗脫時(shí)由于有機(jī)相比例變化，基線浮動(dòng)明顯；使用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，5-羥基噻苯達(dá)唑保留時(shí)間明顯后延，同時(shí)梯度洗脫時(shí)基線沒有明顯浮動(dòng)，因此流動(dòng)相選擇2%乙酸溶液和甲醇梯度洗脫，7種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖和加標(biāo)樣品圖譜見圖1。

圖1 7種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖和加標(biāo)樣品圖譜

2.2 檢測波長的確定

使用二極管陣列檢測器對7種化合物進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示最大吸收波長集中在290～310nm之間，使用292nm時(shí)7種化合物峰高差距較小。

2.3 提取溶劑的確定

考慮阿苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑在丙酮和三氯甲烷等有機(jī)溶劑中不溶或微溶，因此提取溶劑考慮甲醇和乙腈兩種有機(jī)試劑。經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，兩種溶劑對除氟苯達(dá)唑外的6種化合物均有良好的提取效果。氟苯達(dá)唑在甲醇中溶解性差，回收效果低于乙腈。除此之外，乙腈能夠沉淀牛奶樣品中的蛋白，離心后相比甲醇提取更加澄清，有助于固相萃取柱的凈化。

2.4 固相萃取柱的選擇

試驗(yàn)考察了HLB、MCX和C18三種不同填料的固相萃取柱，3種固相萃取柱對7種化合物的回收效果見圖2。

圖2 不同填料固相萃取柱的回收效果

從圖2可以看出，HLB填料和C18填料的固相萃取柱回收效果明顯優(yōu)于MCX填料固相萃取柱，C18固相萃取柱對氟苯達(dá)唑的回收效果優(yōu)于HLB固相萃取柱，綜合考慮，采用C18固相萃取柱作為凈化材料。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 曲線方程和線性范圍

使用1.2.3中的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成一系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以最優(yōu)的色譜條件將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測試，以化合物濃度作為橫坐標(biāo)，以化合物峰面積作為縱坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。

表1 目標(biāo)化合物的曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

從表1可以看出，7種化合物在0.05～100μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均≥0.9998，滿足試驗(yàn)要求。

2.5.2 檢出限與定量限

試驗(yàn)以3倍信噪比作為檢出限（LOD），以10倍信噪比作為定量限（LOQ），通過向空白樣品中添加目標(biāo)物的方式來確定檢出限和定量限值。所測得的結(jié)果見表2。

表2 目標(biāo)化合物的檢出限、定量限、回收率和精密度

從表2可以看出，噻苯達(dá)唑檢出限為0.025mg/kg，定量限為0.10mg/kg，5-羥基噻苯達(dá)唑等6種化合物檢出限為0.05mg/kg，定量限為0.20mg/kg。

2.5.3 回收率試驗(yàn)

使用空白樣品分別進(jìn)行了檢出限、定量限以及10倍檢出限的添加回收試驗(yàn)，試驗(yàn)所得結(jié)果見表2。從表2可以看出，7種化合物的回收率在68.9%～94.5%之間，回收效果良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在回收率試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將每個(gè)組別再同時(shí)做6平行的添加試驗(yàn)，以測定的試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算7種化合物的日內(nèi)變異系數(shù)，并將樣品保存于4℃陰暗處，連續(xù)測定3d，記錄試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算7種化合物的日內(nèi)和日間變異系數(shù)，所得結(jié)果見表2。從表2可以看出，7種化合物的日內(nèi)變異系數(shù)在0.7%～3.4%之間，日間變異系數(shù)在1.5%～4.8%之間，證明該方法穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本研究基于高效液相色譜法和固相萃取技術(shù)，建立了一種能同時(shí)測定牛奶中阿苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑和4種代謝物殘留量的定量分析方法。經(jīng)過試驗(yàn)論證，方法具有良好的回收率和穩(wěn)定性，檢出限和定量限都很低，且實(shí)驗(yàn)成本低廉，操作簡單，為牛奶中廣譜驅(qū)腸蟲類藥物的測定提供了技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐。