不同C/N條件下菌酶制劑對牛糞堆肥中細菌多樣性的影響

梁天，張曉東，張玉，張佐忠，斯日古楞，蘇布登格日勒，娜仁花

（內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018）

堆肥是由細菌、真菌和其他微生物共同作用分解有機物質的過程。為了加速生物性降解，通常接種幾種功能菌株進入堆肥中，以加快腐殖質的形成和縮短堆肥周期[1]。在堆肥初期，畜禽糞便中土著微生物含量少，且厭氧菌在系統(tǒng)中占據優(yōu)勢，導致堆體升溫緩慢，并容易產生惡臭，而添加外源微生物菌劑后可明顯改善這一現象。Zhao等[2]研究認為，接種有助于提高初始微生物種群和加快堆肥成熟進程。Sarkar等[3]報道，接種可以延長堆肥高溫期，提高細菌和真菌群落的多樣性，進一步增加腐殖酸和類黃腐酸化合物的分子量和腐殖化程度。此外，外源微生物接種不僅可以增加堆肥過程中的微生物活性進而促進堆肥的成熟，而且還可以提高有效微生物濃度，從而迅速提高堆肥速率、溫度，并提高底物特異性微生物的豐度[4]。

在堆肥過程中，有機物降解和腐殖質的形成都離不開微生物酶的生物化學作用，通過有目的的腐解作用，將有機物轉化為養(yǎng)分和活性物質。任平等[5]研究發(fā)現，添加復合酶處理可促進牛糞堆肥前期纖維素類物質的分解轉化，從一開始就對整個發(fā)酵起到積極作用。酶對堆肥內纖維素物質的快速降解有利于好氧微生物的快速增殖，從而迅速分解物料中的有機質，產生大量的生物熱，加速物料的升溫，延長發(fā)酵的高溫期，進而縮短發(fā)酵周期。

本研究通過不同C/N條件下，在牛糞中添加不同菌種和酶劑組合，探究在牛糞堆肥進程中細菌的多樣性演替變化規(guī)律，以期為堆肥高效發(fā)酵提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛糞和小麥秸稈均取自內蒙古某奶牛養(yǎng)殖場。將小麥秸切碎至1～2cm長度。菌劑包括枯草芽孢桿菌（有效活菌數200億/g）、黑曲霉菌（有效活菌數50億/g）、細黃鏈霉菌（有效活菌數50億/g），3種菌配制成比例為1:1:1的復合菌劑。將纖維素酶（有效酶活為20萬U/g）和蛋白酶（有效酶活為50萬U/g）配制成比例為3:1的復合酶制劑。三種菌和兩種酶均購自湖北某生物工程有限公司。牛糞及小麥秸稈的基本性質見表1。

表1 堆肥原料的基本性質

1.2 試驗設計

堆肥試驗于2020年9月28日-11月1日在內蒙古某奶牛養(yǎng)殖場彩鋼瓦棚中進行。將牛糞和小麥秸稈按一定比例混合，分別設25/1、30/1、35/1三個C/N組，每個C/N組設三個處理組，每個處理3個重復。按質量比添加菌劑和酶制劑，具體分組見表2。

表2 堆肥處理組物料配比情況

各處理組的含水量調節(jié)在45%～60%之間。將物料進行條垛式堆肥，每個堆體長1.2m，堆底寬1m，高0.8m，每堆的堆體間隔為1～2m。所有處理組每隔5d人工翻堆一次。

1.3 取樣方法

在堆肥開始的第1、5、10、15、20、26、34天進行取樣。采樣深度分別距堆體頂部20cm、40cm、60cm處，各層均采用五點采樣方法取樣，取樣后混合均勻。每個堆體取500g樣品，放入自封袋中，置于-80℃冰箱中保存。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 發(fā)酵堆體中細菌多樣性分析

通過高通量測序技術測定各處理組在堆體發(fā)酵過程中細菌多樣性變化特征。

1.4.2 堆體微生物DNA的提取

根據FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals,GA, U.S.）說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。

1.4.3 堆體微生物目標基因擴增

細菌16S rRNA基因使用338F/806R進行擴增，引物序列如表3所示。

表3 PCR擴增引物堿基序列

1.4.4 細菌16S rRNA-PCR 擴增

細菌擴增反應體系見表4。

表4 細菌PCR擴增反應體系

擴增反應參數：95℃預變性3min，之后95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，此步驟循環(huán)27次，然后72℃穩(wěn)定延伸10min，最后保存于10℃。PCR擴增產物大小為468bp。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.5 微生物數據處理

利用FASTP軟件對原始測序序列進行質控，用FLASH軟件進行拼接。利用UPARSE軟件對序列進行OTU聚類（相似度為97%）并剔除嵌合體。用RDP classifier對序列進行物種分類注釋。使用美吉云平臺進行圖形制作與部分數據分析。

2 結果與分析

2.1 堆肥樣品細菌OTU聚類分析和Alpha多樣性分析

Venn圖用來統(tǒng)計多組樣本之間共有和獨有的OTU個數，從而比較直觀地表達不同組OTU組成的相似和重疊情況。如圖1所示，處理組C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9組細菌分別有1795、1948、1931、1849、1969、1921、2220、1954、1927個OTU，每組共有的OTU為1207個，每組特有的OTU為C1組34個、C2組19個、C3組18個、C4組38個、C5組36個、C6組32個、C7組89個、C8組18個、C9組47個。

圖1 細菌Venn圖

堆肥樣品中的細菌多樣性分析（Alpha Diversity）見表5。其中Shannon（香儂指數）、Simpson（辛普森指數）可以反映微生物的多樣性，Shannon值越高說明群落多樣性越高，Simpson值越高說明群落多樣性越低；Chao指數常用于估計物種的總數，從而反映物種平均豐度。與堆肥初期相比，堆肥末期各處理組Shannon指數、Chao指數均有增加，Simpson指數均有下降。堆肥各樣品文庫的覆蓋率（Coverage）均超過98.60%。

表5 堆肥樣品中細菌多樣性

2.2 牛糞堆肥進程中門水平細菌菌群豐度分析

本研究中細菌門水平相對豐度大于1%的有9個，分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、棲熱球菌門（Deinococcota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、髕骨細菌門（patescibacteria）、黏球菌門（myxococcota）和Halanaerobiaeota菌門。隨著堆肥進程的推進，不同門水平的細菌群落的相對豐度變化趨勢見圖2～4。

如圖2所示，在堆肥初期（1d），C/N為25/1的C1、C2、C3組的第一優(yōu)勢菌群為放線菌門，相對豐度分別為46.43%、52.52%、46.48%。高溫期（5d），C1、C2、C3組第一優(yōu)勢菌群演替為厚壁菌門，豐度分別為46.29%、54.94%、45.72%。堆肥結束時（34d），C1、C2組第一優(yōu)勢菌群演替為變形菌門，豐度為34.06%、33.30%，C3組第一優(yōu)勢菌群演替為放線菌門，為26.06%。

圖2 C/N為25/1組細菌門水平的相對豐度

圖3 C/N為30/1組細菌門水平的相對豐度

圖4 C/N為35/1組細菌門水平的相對豐度

由圖3所示，在堆肥初期（1d），C/N為30/1的C4、C5、C6組放線菌門相對豐度分別為52.27%、53.35%、50.86%，為優(yōu)勢菌群。高溫期（5d），厚壁菌門成為第一優(yōu)勢菌群，豐度分別為51.58%、47.00%、60.57%。堆肥結束時（34d），C4組放線菌門再次成為第一優(yōu)勢菌群，豐度為53.35%，C5、C6組變形菌門成為第一優(yōu)勢菌，豐度分別為29.95%、31.00%。

由圖4所示，在堆肥初始期（1d），C/N為35/1的C7、C8、C9組放線菌門細菌相對豐度分別為47.26%、50.05%、40.50%，為該時期的優(yōu)勢菌群。高溫期（5d），3個處理組放線菌門細菌相對豐度均下降，厚壁菌門成為高溫期第一優(yōu)勢菌群，豐度分別為39.90%、35.54%、60.36%。堆肥結束時（34d），C7組變形菌門成為第一優(yōu)勢菌群，豐度為29.49%；C8、C9組放線菌門再次成為第一優(yōu)勢菌群，豐度分別為37.12%、29.39%。

2.3 牛糞堆肥進程中綱水平細菌菌群豐度分析

本研究中細菌水平綱相對豐度大于1%的有14個，分別為放線菌綱（Actinobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、α-變性菌綱（Alphaproteobacteria）、梭菌綱（Clostridia）、恐球菌綱（Deinococci）、綠彎菌綱（Chloroflexia）、Halanaerobiia菌綱、Rhodothermia菌綱、Limnochordia菌綱、酸微菌綱（Acidimicrobiia）、Saccharimonadia菌綱、Polyangia菌綱。綱水平細菌群落相對豐度的變化見圖5～7。

圖5 C/N為25/1組細菌綱水平的相對豐度

圖6 C/N為30/1組細菌綱水平的相對豐度

圖7 C/N為35/1組細菌綱水平的相對豐度

如圖5所示，在堆肥初始期（1d），C/N為25/1的C1、C2、C3組放線菌綱的相對豐度分別為45.81%、52.29%、46.21%，為第一優(yōu)勢菌群。高溫期（5d），C1組優(yōu)勢菌群仍為放線菌綱，豐度為43.71%；C2、C3組芽孢桿菌綱成為第一大優(yōu)勢菌群，豐度分別為43.20%、38.57%。堆肥結束時（34d），C1、C2組γ一變形菌綱成為第一大優(yōu)勢菌群，豐度分別為28.10%、26.34%，C3組的優(yōu)勢菌群不變，仍為放線菌綱，豐度為24.27%。

如圖6所示，在堆肥初始期（1d），C/N為30/1的C4、C5、C6組放線菌綱的相對豐度分別為52.14%、53.11%、50.72%，為該時期的第一優(yōu)勢菌群。高溫期（5d），芽孢桿菌綱成為第一大優(yōu)勢菌群，C4、C5、C6組豐度分別為48.04%、43.06%、49.82%。堆肥結束時（34d），放線菌綱再次成為第一大優(yōu)勢菌群，C4、C5、C6組豐度分別為24.88%、25.64%、25.18%。

如圖7所示，在堆肥初始期（1d），C/N為35/1的C7、C8、C9組放線菌綱相對豐度為47.12%、49.82%、40.35%，為該時期第一優(yōu)勢菌群。高溫期（5d），C7、C8組放線菌綱仍為第一優(yōu)勢菌群，豐度分別為33.88%、30.19%；C9組芽孢桿菌綱成為第一優(yōu)勢菌群，豐度為51.17%。堆肥結束時（34d），放線菌綱再次成為第一優(yōu)勢菌群，豐度分別為27.45%、35.44%、27.94%。

2.4 牛糞堆肥進程中屬水平細菌菌群豐度分析

本研究共得到19個細菌屬，所有樣品中屬水平相對豐度均大于0.05%。包括棒桿菌屬（Corynebacterium）、高溫雙岐菌屬（Thermobifida）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、特呂珀菌屬（Truepera）、Marinimicrobium屬、喬治菌屬（Georgenia）、肉桿菌屬（Atopostipes）、嗜冷咸海鮮球菌屬（Jeotgalicoccus）、未命名菌屬（norank_f__Cellvibrionaceae屬）、嗜熱新芽孢桿菌屬（Novibacillus）、未命名菌屬（norank_f__JG30-KF-CM45屬）、嗜鹽菌屬（Halocella）、熱微菌屬（Tepidimicrobium）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、薄壁芽孢桿菌屬（Garcilibacillus）、費克藍姆菌屬（Facklamia）。沒有科學名稱細菌，以noran作為標記。屬水平細菌群落的相對豐度變化見圖8～10。

圖8 C/N為25/1組細菌屬水平的相對豐度

圖9 C/N為30/1組細菌屬水平的相對豐度

圖10 C/N為35/1組細菌屬水平的相對豐度

如圖8所示，在堆肥初始期（1d），C/N為25/1的C1、C2、C3組棒桿菌屬相對豐度分別為31.19%、42.15%、37.81%，為該時期第一優(yōu)勢菌群。高溫期（5d），棒桿菌屬豐度下降最大，C1、C3組芽孢桿菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，分別為31.07%、21.59%；C2組高溫雙岐菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，為19.93%。堆肥結束時（34d），C1、C2組嗜鹽單胞菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，分別為8.80%、6.18%；C3組特呂珀菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，為6.60%。C1、C2、C3組在堆肥初始期嗜冷桿菌屬相對豐度分別為5.08%、12.65%、10.54%，其他時期幾乎檢測不到。

如圖9所示，在堆肥初始期（1d），C/N為30/1的C4、C5、C6組棒桿菌屬相對豐度分別為45.33%、42.70%、42.28%，為該時期第一優(yōu)勢菌群，隨著堆肥的進行棒桿菌屬呈下降趨勢。高溫期（5d），C4組高溫雙岐菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，為13.23%；C5、C6組芽孢桿菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，分別為13.15%、13.77%。堆肥結束時（34d），C4、C6組喬治菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，為6.93%、5.54%；C5組芽孢桿菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，為6.77%。

如圖10所示，在堆肥初始期（1d），C/N為35/1的C7、C8、C9組棒桿菌屬相對豐度最大，分別為41.03%、41.17%、35.47%，為該時期第一優(yōu)勢菌群，隨著堆肥的進行棒桿菌屬呈下降趨勢。高溫期（5d），C7、C8組棒桿菌屬仍為第一優(yōu)勢菌群，分別為12.70%、17.62%；C9組芽孢桿菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，為17.93%。堆肥結束時（34d），C7組高溫雙岐菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，為7.03%；C8、C9組喬治菌屬成為第一優(yōu)勢菌群，分別為8.34%、7.40%。

3 討論

微生物是堆肥物料的分解者，不同的優(yōu)勢細菌類群在堆肥進程中呈現菌群演替。本研究中，各處理組在堆肥結束時細菌群落的香儂多樣性指數均呈增加的變化趨勢，此結果與Ren等[6]的研究結果一致。主要是因為在堆肥的升溫期產生了充足的營養(yǎng)物質，有利于細菌的生長和代謝[7]，致使該時期香儂指數的增加。當進入高溫期后香儂指數下降，此時耐熱細菌開始占據優(yōu)勢[8]，其他物種由于溫度過高死亡。

細菌豐度結果顯示，門水平的細菌群落多樣性隨堆肥進程有一定的改變。無處理組（C1組、C4組、C7組）在堆肥初期放線菌門為優(yōu)勢菌群，高溫期演替為厚壁菌門。堆肥結束時，除C4組外，其他2組的優(yōu)勢細菌門均演替為變形菌門。添加菌酶制劑后（C2組、C3組、C5組、C6組、C8組、C9組），優(yōu)勢菌群在堆肥初期和高溫期與無處理組相同，堆肥結束時，除C2組外，其他組優(yōu)勢菌群均又演替為放線菌門。放線菌門和厚壁菌門是堆肥初始期相對豐度最大的細菌門。在堆肥過程中，難被降解的纖維素和木質素含量較高，放線菌門能夠有效降解纖維素、半纖維素和木質素，因此占據主導地位，這與Insam等[9]的研究結果相似。Steger等也提到，放線菌門可分解堆肥中有機物，并能釋放與腐殖質產生有關的無機物[10]。因此放線菌門對于堆肥的腐熟起著重要的作用。本研究顯示，無論C/N如何，添加菌酶制劑堆肥結束腐熟時均有助于增加放線菌門的豐度。厚壁菌門能夠產生內生孢子[11]，所以它具有較高的耐受性[12]，能夠生存在不適宜的環(huán)境中[13]，本研究中，各試驗組在高溫期優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門。另外，擬桿菌門和變形菌門也占一定主導地位。有研究表明擬桿菌門中很多種細菌都具有降解大分子有機物的能力，包括纖維素、淀粉和幾丁質等[14]，本試驗中，牛糞及小麥秸稈均含有較多的纖維素，為擬桿菌門細菌生長代謝提供了充足的營養(yǎng)物質。變形菌門是細菌中最大的類群，具有固氮和降解木質素等多種功能，在堆肥各時期均有大量的分布。本研究表明，這四種細菌門占總鑒定序列的90%以上，這與Tortosa等[15]研究結果一致，表明這四種細菌門對堆肥過程中的有機物分解起主要作用[11,16]。

本研究的優(yōu)勢綱共有14個，放線菌綱是所有處理組在堆肥初始期相對豐度最大的優(yōu)勢菌綱。芽孢桿菌綱對高溫的耐受性較高，能夠在45～70℃溫度范圍內生長繁殖[17]，會在高溫期明顯增加。本試驗在高溫期除了C8組的優(yōu)勢菌為放線菌綱外，其他處理組優(yōu)勢菌群均為芽孢菌綱。而放線菌綱在堆肥的整個階段起著重要作用，尤其在對于難降解化合物的降解和和腐殖質的形成過程中[18]。除在堆肥末期C1組、C2組的γ一變形菌綱成為第一大優(yōu)勢菌群外，其他處理組優(yōu)勢菌群再次演替為放線菌綱，尤其是C/N為25組變化較為一致。

在本研究中，優(yōu)勢菌屬共有19個，這些細菌屬在自然環(huán)境以及人為環(huán)境中分布廣泛，包括土壤和許多堆肥體系[19,20]。在堆肥初始期，糖類、淀粉和蛋白質等易降解成分得到迅速分解；半纖維素、纖維素及木質素等難降解物質開始緩慢分解。該時期主要是嗜溫微生物占優(yōu)勢，而棒狀桿菌屬屬于堆肥嗜溫期優(yōu)勢微生物。本試驗同樣顯示了各組的棒桿菌屬相對豐度最大，為該時期第一優(yōu)勢菌群。高溫期嗜熱微生物迅速繁殖成為優(yōu)勢菌落，進而對結構復雜的半纖維素、纖維素及木質素等進行分解。而在嗜熱期優(yōu)勢菌群大多分布于高溫雙岐菌屬、嗜熱霉菌屬、曲霉屬、泛菌屬、芽孢桿菌屬、糖單胞菌屬等[21]。芽孢桿菌屬能夠產生孢子來抵御高溫環(huán)境，由于高溫期堆體中噬中溫細菌因不耐高溫而大量死亡，所以使其相對豐度增加。本研究結果顯示，在高溫期除了C7、C8組的第一優(yōu)勢菌群仍為棒桿菌屬外，其他處理組優(yōu)勢菌群演替為芽孢桿菌屬和高溫雙岐菌屬。堆肥結束時優(yōu)勢細菌多樣性增加，轉變成嗜鹽單胞菌屬、特呂珀菌屬、喬治菌屬、芽孢桿菌屬、高溫雙岐菌屬。

4 結論

本研究中各試驗組細菌多樣性隨不同的堆肥進程呈現高-低-高的趨勢。堆肥初期，各組優(yōu)勢細菌門均為放線菌門，添加菌酶制劑處理組的放線菌門豐度大于無添加處理組。高溫期時，各組優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門，但各組之間厚壁菌門豐度變化不一致。堆肥結束時，除C2組外，其他組優(yōu)勢菌群均又演替為放線菌門。在堆肥初始期、高溫期及結束期各組菌群基本是放線菌綱-芽孢菌綱-放線菌綱的演替規(guī)律。堆肥初期，各組優(yōu)勢菌屬均為棒桿菌屬，但組間棒桿菌屬豐度變化不一致。在高溫期除了C7、C8組的第一優(yōu)勢菌群仍為棒桿菌屬外，其他處理組優(yōu)勢菌群演替為芽孢桿菌屬和高溫雙岐菌屬。堆肥結束時優(yōu)勢細菌多樣性增加，轉變成嗜鹽單胞菌屬、特呂珀菌屬、喬治菌屬、芽孢桿菌屬、高溫雙岐菌屬。