β-arrestin2通過調(diào)控自噬水平在結(jié)腸炎中的作用

郭佳翔 翟曉明 劉慧玲 徐敏儀 吳淑云 陶金

【摘要】 目的 研究β-抑制蛋白2 （β-arrestin2）是否通過調(diào)控自噬水平在結(jié)腸炎中發(fā)揮作用。方法β-arrestin2野生型（WT）小鼠和β-arrestin2基因敲除（KO）小鼠各20只，隨機分為4組，每組各10只，分別為β-arrestin2 WT對照組和實驗組，β-arrestin2 KO對照組和實驗組。實驗組小鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉7 d誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎，對照組給予無菌ddH2O。觀察并記錄各組小鼠的疾病活動指數(shù)。收集小鼠結(jié)腸組織，免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）、Beclin1的表達水平。在HCoEpiC細胞中，通過siRNA沉默β-arrestin2的表達，Earle’s平衡鹽溶液（EBSS）處理細胞以誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生，檢測LC3B表達水平。結(jié)果 β-arrestin2 WT實驗組小鼠的結(jié)腸黏膜自噬相關(guān)蛋白表達水平上調(diào)，而β-arrestin2 KO實驗組小鼠的結(jié)腸炎癥程度明顯改善，自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平下降（P < 0.05），但Beclin1表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。在HCoEpiC細胞中沉默β-arrestin2的表達，EBSS處理后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平下調(diào)。結(jié)論 在結(jié)腸炎中，β-arrestin2調(diào)控自噬水平，當(dāng)β-arrestin2缺失時，可以通過抑制自噬改善結(jié)腸炎。

【關(guān)鍵詞】 潰瘍性結(jié)腸炎;自噬;β-抑制蛋白2;小鼠;HCoEpiC細胞

【Abstract】 Objective To explore whether β-arrestin2 plays a role by regulating autophagy in colitis. Methods 20 β-arrestin2 wild-type （WT） and 20 β-arrestin2 knockout （KO） mice were randomly and evenly divided into four groups， including β-arrestin2 WT control group and experimental group， β-arrestin2 KO control group and experimental group. In the experimental groups， the mice were given free access to 3% dextran sulfate sodium （DSS） for 7 d to induce acute colitis. In the control groups， the mice were given sterile ddH2O. The disease activity index of mice was observed and recorded in each group. The colon tissues of mice were collected， and the expression levels of autophagy-related proteins including LC3B and Beclin1 were observed and detected by immunohistochemistry and western blot. The expression of β-arrestin2 was knockdown by siRNA in HCoEpiC cells， and then the cells were treated by Earle’s Balanced Salt Solution （EBSS） to induce autophagy. Then， the expression level of LC3B protein was detected. Results The expression of autophagy-related proteins was significantly up-regulated in the colon mucosal tissues of WT experimental mice. Compared with WT mice， the colonic inflammation was significantly ameliorated in β-arrestin2 KO mice after DSS treatment. And the expression levels of autophagy-related proteins LC3B-Ⅱ/Ⅰ were significantly down-regulated in β-arrestin2 KO mice in the experimental groups（P < 0.05）.There is no significant difference in the expression levels of Beclin1（P > 0.05）. After knocking down the expression of β-arrestin2 in HCoEpiC cells and EBSS treatment， the expression levels of LC3B-Ⅱ/Ⅰ were significantly down-regulated （P < 0.05）. Conclusion β-arrestin2 can regulate the autophagy in colitis， and the deficiency of β-arrestin2 can inhibit autophagy to ameliorate the colonic inflammation.

【Key words】 Ulcerative colitis; Autophagy; β-arrestin2; Mouse; HCoEpiC cell

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性非特異性炎癥性腸?。↖BD），主要累及結(jié)直腸黏膜層及黏膜下層。血性腹瀉、腹痛是UC最常見的臨床癥狀。目前病因尚不明確，研究表明其與環(huán)境、遺傳易感性、腸道菌群失調(diào)和免疫反應(yīng)紊亂等因素相關(guān)[1]。自噬是真核細胞的一個基本生物過程，自噬通過對蛋白質(zhì)和細胞器的分解代謝，在能量穩(wěn)態(tài)中起重要作用，主要分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬等[2]。巨自噬是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體來源的隔膜在待降解物質(zhì)周圍形成自噬小體，運輸至溶酶體內(nèi)進行降解的過程。全基因組關(guān)聯(lián)研究確定IBD的多個易感基因，大量的研究表明自噬在維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，可能與IBD的發(fā)病機制相關(guān)[3]。β-抑制蛋白2 （β-arrestin2）是Arrestins家族中的一員，是廣泛存在于細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)的支架蛋白[4]。β-arrestin2不僅介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的脫敏、內(nèi)化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo);同時還通過參與胰島素生長因子1（IGF-1）、核因子-κB （NF-κB）、p53、Wnt、PI3K/Akt等多條信號通路，進而調(diào)節(jié)細胞的趨化、凋亡、自噬等功能，在許多生理和病理過程中起著重要作用[5]。筆者團隊既往的研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin2可以促進葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎黏膜的細胞凋亡，然而在結(jié)腸炎中，β-arrestin2是否對自噬存在調(diào)控作用尚不清楚[6]。本研究通過建立β-arrestin2野生型（WT）和β-arrestin2基因敲除型（KO）小鼠急性UC模型以及干擾β-arrestin2在HCoEpiC細胞中的表達，探討β-arrestin2在小鼠UC中對自噬水平的調(diào)控。

材料與方法

一、材 料

1.實驗動物

SPF級別的C57BL/6J小鼠20只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自廣東藥康生物科技有限公司。β-arrestin2 KO小鼠于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院疫苗研究所動物中心進行繁育、飼養(yǎng)并用于實驗。本動物實驗倫理經(jīng)中山大學(xué)實驗動物管理與使用委員會審批通過（F2-09-0901）。

2.實驗細胞系

人源的正常結(jié)腸上皮細胞系HCoEpiC細胞由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室凍存保種。

3.主要試劑與抗體

DSS（MP Biomedicals，美國）、高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）、胎牛血清（Gibco，美國）、β-arrestin2 siRNA（吉瑪基因，中國）、β-actin抗體（Santa Cruz，美國）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）抗體（Abcam，美國）、 Beclin1抗體（CST，美國）、p-Akt（CST，美國）、β-arrestin2抗體（Proteintech，中國）、Earle’s平衡鹽溶液（EBSS，Gibco，美國）。

4.主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國）、SDS-PAGE電泳槽（BIO-RAD，美國）、半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD，美國）、PCR儀（BIO-RAD，美國）。

二、方 法

1.小鼠急性UC模型的建立

選取8周大的C57BL/6J小鼠，隨機分為β-arrestin2 WT對照組、β-arrestin2 WT實驗組、β-arrestin2 KO對照組和β-arrestin2 KO實驗組，每組10只。WT對照組和KO對照組小鼠給予無菌的ddH2O自由飲用，WT實驗組和KO實驗組小鼠自由飲用含3%DSS的無菌ddH2O 7 d，誘導(dǎo)小鼠急性UC。

2.疾病活動指數(shù)評分

從造模的第1日起，每日觀察小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀和糞便隱血情況，計算小鼠疾病活動指數(shù)。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：體質(zhì)量正常為0分，體質(zhì)量下降1%～5%為1分，下降5%～10%為2分，下降10%～20%為3分，下降大于20%為4分;大便成形為0分，呈糊狀或半成形為1分，稀便為4分;糞便潛血陰性為0分，大便潛血陽性為2分，肉眼血便為4分。

3.小鼠結(jié)腸標(biāo)本的收集

造模結(jié)束后，對小鼠進行腹腔注射10%水合氯醛，深度麻醉后行頸椎脫臼處死。剖開腹部暴露腹腔，取出全結(jié)腸，放置冰盒上?？v行剖開小鼠結(jié)腸，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗結(jié)腸內(nèi)容物。部分結(jié)腸組織進行固定后續(xù)包埋，部分結(jié)腸組織刮取腸黏膜后置于-80℃冰箱中保存，后續(xù)提取蛋白質(zhì)。

4. HE染色

將制備好的蠟塊切片，進行脫蠟和梯度水化處理后，滴加蘇木素染液30 s，流水沖洗后置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中反藍。隨后用伊紅染液染色1 min，流水沖洗后顯微鏡下觀察染色情況，封片，拍照。

5.免疫組織化學(xué)染色

將制備好的蠟塊切片，進行脫蠟和梯度水化處理后，在3%雙氧水中孵育10 min，然后進行抗原修復(fù)，用5%的牛血清白蛋白封閉30 min。一抗稀釋液4℃孵育過夜，PBS清洗，對應(yīng)的二抗稀釋液37℃孵育2 h。PBS沖洗后DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木素染液染色后，封片，拍照。

6.細胞培養(yǎng)

將HCoEpic細胞用完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察細胞的生長狀況。待細胞處于對數(shù)增長期時，胰酶消化，用培養(yǎng)基重懸細胞，按1∶4的比例傳代。

7. siRNA沉默β-arrestin2基因的表達

當(dāng)細胞生長到50%的密度時，根據(jù)siRNA說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染，沉默β-arrestin2基因的表達。siRNA干擾效率通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）和蛋白免疫印跡進行檢測。將消化重懸的細胞鋪于12孔板中，使24 h后達到50%，用siRNA沉默β-arrestin2的表達。EBSS處理細胞2 h。

8. 細胞RNA提取及RT-PCR檢測mRNA表達

根據(jù)試劑盒說明書提取細胞中的總RNA，測定提取的RNA樣品的純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄后測定目的基因的mRNA表達水平。目的基因引物序列見表1。

9. 結(jié)腸黏膜和細胞總蛋白提取及蛋白免疫印跡

根據(jù)總蛋白提取裂解液說明書對結(jié)腸黏膜細胞總蛋白進行提取和定量。取蛋白樣品進行電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉2 h。用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌后，一抗4℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌后，對應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯像，采用Image J圖像分析軟件進行灰度分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)均以? 表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P < 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad prism 8.0軟件進行作圖。

結(jié) 果

一、小鼠急性UC的結(jié)腸黏膜自噬水平上調(diào)

用DSS誘導(dǎo)β-arrestin2 WT小鼠進行急性UC造模后，與β-arrestin2 WT對照組相比，β-arrestin2 WT實驗組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 8.933，P < 0.001），見圖1A和B。結(jié)腸切片HE染色結(jié)果顯示，β-arrestin2 WT對照組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，未見炎癥細胞浸潤，而β-arrestin2 WT實驗組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)被破壞，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，糜爛和潰瘍形成，炎癥細胞浸潤，見圖1C。以上結(jié)果說明小鼠急性UC造模成功。

根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與β-arrestin2 WT對照組小鼠相比，β-arrestin2 WT實驗組小鼠結(jié)腸黏膜Beclin1表達水平明顯增加，見圖1D。蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示，β-arrestin2 WT實驗組小鼠結(jié)腸黏膜組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1表達水平均高于β-arrestin2 WT對照組，2組蛋白相對表達量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tBeclin1=2.907，tLC3B-Ⅱ/Ⅰ= 3.194，P均< 0.05），見圖1E、F。

二、β-arrestin2的缺失減輕小鼠急性UC的炎癥反應(yīng)

小鼠自由飲用3%DSS 7 d后，收集小鼠部分結(jié)腸組織并制備成石蠟標(biāo)本，HE染色結(jié)果顯示，與β-arrestin2 WT實驗組比較，β-arrestin2 KO實驗組結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度明顯減輕，炎癥細胞的浸潤減少，見圖2A。從第2日起至第7日，β-arrestin2 KO實驗組的疾病活動指數(shù)均低于β-arrestin2 WT實驗組，見圖2B，且從第4日起，2組疾病活動指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.01）。與β-arrestin2 KO實驗組比較，β-arrestin2 WT實驗組造模后結(jié)腸長度縮短更為明顯，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 6.441，P < 0.001），見圖2C、D。

三、β-arrestin2的缺失下調(diào)小鼠UC結(jié)腸黏膜和HCoEpiC細胞中的自噬水平

β-arrestin2 KO實驗組Beclin1表達水平較β-arrestin2 WT實驗組明顯減少（圖3A），蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示，β-arrestin2 KO實驗組和β-arrestin2 WT實驗組的LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.868，P < 0.01），但Beclin1表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見圖3B、C。

在人源性結(jié)腸上皮細胞HCoEpiC細胞中，根據(jù)說明書使用siRNA進行瞬時轉(zhuǎn)染，RT-PCR和蛋白免疫印跡結(jié)果表明，β-arrestin2 siRNA能有效地沉默β-arrestin2基因的表達，見圖3D。在HCoEpiC細胞中沉默了β-arrestin2的表達后，采用EBSS處理細胞2 h，誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生，免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，當(dāng)沉默β-arrestin2的表達后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平降低，表明β-arrestin2的沉默可以下調(diào)自噬水平，見圖3E。

討 論

UC是一種累及結(jié)直腸的慢性非特異性炎癥疾病，與多種致病因素相關(guān)，被認(rèn)為與環(huán)境因素、遺傳易感性、腸道微生物失調(diào)以及免疫功能紊亂有關(guān)[7-8]。β-arrestins幾乎在所有組織細胞上表達，主要分為β-arrestin1和β-arrestin2，其中β-arrestin1存在于細胞質(zhì)和細胞核中，而β-arrestin2僅存在于細胞質(zhì)中[4]。作為銜接蛋白，β-arrestin2不僅介導(dǎo)GPCR的內(nèi)吞和脫敏，是GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)節(jié)因子;同時又參與多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、自噬、遷移、炎癥等功能[5]。大量研究表明β-arrestin2可能通過多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。β-arrestin2可以通過與IκBα結(jié)合從而阻止NF-κB降解，或與TRAF6結(jié)合從而阻止TRAF6寡聚化和自泛素化，從而抑制NF-κB的激活[9-10]。同時，β-arrestin2可以抑制自然殺傷細胞的毒性作用，參與調(diào)節(jié)T淋巴細胞的活化等[11-13]。β-arrestin2在腸道炎癥中起保護作用還是損傷作用仍存在爭議。已有研究表明，β-arrestin2可以通過調(diào)節(jié)Th1和Th17細胞的比例從而抑制腸道炎癥的進展[13]。而β-arrestin2又介導(dǎo)肥大細胞對腸道通透性的調(diào)節(jié)，削弱結(jié)腸細胞間的緊密連接，增加細胞間的通透性[14]。本實驗在β-arrestin2 WT小鼠和β-arrestin2 KO小鼠上建立了急性UC模型，通過HE染色、疾病活動指數(shù)、結(jié)腸長度對比等分析方法，再次驗證了β-arrestin2的缺失可以減輕小鼠急性UC的炎癥反應(yīng)。

同時，既往研究報道，全基因組關(guān)聯(lián)性研究證實了與IBD相關(guān)的多個基因位點的單核苷酸多態(tài)性如ATG16L、NOD2、LRRK2、IRGM等分別調(diào)控IBD中的自噬發(fā)生[3， 16]。研究表明，具有ATG16L1的單核苷酸多態(tài)性的人類細胞自噬受損，對病原體的清除能力減弱，潘氏細胞和杯狀細胞功能紊亂[17]。目前已有大量的研究報道自噬在腸道固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著重要的作用。在固有免疫中，自噬與模式識別受體相互作用，如Toll樣受體、Nod樣受體等，識別并消除侵入細胞的病原體。同時在腸道中，內(nèi)源性和外源性微生物可通過自噬進行抗原呈遞，并對共生物抗原耐受性的產(chǎn)生具有重要作用[18]。許多自噬相關(guān)蛋白（如Beclin1、Atg3、Atg5和Atg7）對T淋巴細胞的生存、發(fā)育和成熟是必要的[19-20]。干擾自噬導(dǎo)致腸道內(nèi)固有免疫和適應(yīng)性免疫受損，自噬缺陷可影響細胞抗原肽的呈遞、損害細胞內(nèi)細菌清除能力等[16-18]。然而，自噬是把雙刃劍，在炎癥中具有雙向調(diào)節(jié)作用，適當(dāng)?shù)淖允煽梢越到馐軗p或衰老的細胞器以及錯誤折疊的蛋白質(zhì)，而過度的自噬會引起細胞自噬性死亡。有研究報道，過度的自噬會損害上皮細胞的緊密連接，抑制過度的自噬，從而恢復(fù)ZO-1和E-cadherin的表達[21]。為此，我們在實驗中先探究了小鼠急性UC模型中自噬水平的變化，通過蛋白免疫印跡、免疫組織化學(xué)等檢測方法，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)小鼠急性UC后，自噬相關(guān)蛋白的表達水平上調(diào)。而β-arrestin2的缺失可以改善小鼠結(jié)腸黏膜的炎癥，于是我們進一步探究β-arrestin2是否可以通過調(diào)控自噬來調(diào)節(jié)腸道的炎癥。因此我們分析了β-arrestin2 WT小鼠和β-arrestin2 KO小鼠在急性UC模型中自噬水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-arrestin2的缺失可以抑制自噬的發(fā)生，進一步在人源性的結(jié)腸上皮細胞HCoEpic中進行驗證。通過饑餓誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)沉默β-arrestin2表達的細胞中，自噬相關(guān)蛋白表達水平下降，自噬水平受到抑制。

綜上所述，β-arrestin2的缺失抑制自噬的發(fā)生，緩解腸道的炎癥反應(yīng)，為UC的治療提供新的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-10-25）

（本文編輯：楊江瑜）