甲狀腺激素受體相互作用因子13在B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義

錢(qián)新月 陳麗花 周泉 沈文艷 莫娟芬 王宙政 韓艷霞 張東凱 張斌忠 胡蓓莉

B細(xì)胞淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤的一種，其異質(zhì)性很強(qiáng)，療效差別很大。甲狀腺激素受體相互作用因子 13（thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13）是一種AAA-ATP酶，在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。腫瘤的發(fā)生往往從DNA損傷開(kāi)始，TRIP13可重塑希爾丁復(fù)合物——一種DNA損傷修復(fù)相關(guān)的重要物質(zhì)，從而干擾損傷DNA的修復(fù)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，TRIP13不但與肺癌、膠質(zhì)瘤、腎癌的發(fā)病有關(guān)[3-4]，而且在惰性B細(xì)胞淋巴瘤中也有表達(dá)[5]。因此，本研究探討TRIP13在B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年9月至2020年11月在嘉興市第二醫(yī)院就診后進(jìn)行淋巴結(jié)活檢，并留取多余的新鮮淋巴結(jié)活檢組織凍存的B細(xì)胞淋巴瘤患者44例為研究對(duì)象，其中男23例，女21例；年齡44～83（66.09±9.64）歲。所有患者病理學(xué)診斷結(jié)果均為B細(xì)胞淋巴瘤。所有患者活檢前均未接受任何化療、放療或生物學(xué)治療；經(jīng)病理確診后按照臨床指南規(guī)范診治，接受標(biāo)準(zhǔn)化療至少2個(gè)療程。參照2016年WHO對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，將44例患者分為惰性淋巴瘤組（包括3a級(jí)及以下的濾泡淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、小B細(xì)胞淋巴瘤、惰性套細(xì)胞淋巴瘤）20例和侵襲性淋巴瘤組（包括3b級(jí)濾泡淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、經(jīng)典型套細(xì)胞淋巴瘤、高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤）24例。本研究經(jīng)嘉興市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑和儀器 Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PrimeScriptRTMaster Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Fast qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司；TRIP13 antibody試劑購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司；二抗山羊抗兔IgG（H+L）、HRP試劑均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；NanoDrop分光光度儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；ABI Stepone Plus熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Axio LabA1顯微鏡購(gòu)自德國(guó)蔡司公司。

1.3 TRIP13 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。使用Trizol試劑提取淋巴結(jié)活檢組織RNA，并使用NanoDrop分光光度儀檢測(cè)RNA濃度。按照Prime－ScriptRTMaster Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法，在冰上配制10 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，37℃ 15 min，85℃5 s，4℃結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后按照SYBR Fast qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明在冰上配制20 μl反應(yīng)體系。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，引物序列由上海生工科技生物公司合成。GAPDH上游引物：5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，下游引物：5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'；TRIP13 上游引物：5'-TGCAGCAAATCACTGGGTTCT-3'， 下 游 引 物 ：5'-GGTTCCAGGTGATGAGGTTGC-3'。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液與反應(yīng)體系輕輕混勻后放置在ABI Stepone Plus熒光定量PCR儀上。PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)：95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束確認(rèn)熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 TRIP13蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用En Vison免疫組化染色法。淋巴瘤組織石蠟切片脫蠟至水。3%過(guò)氧化氫室溫孵育消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗3遍后PBS浸泡，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育后棄血清。滴加一抗工作液，4℃過(guò)夜。洗滌，滴加二抗，37℃孵育30 min。洗滌，滴加適量辣根酶，37℃孵育30 min。洗滌，滴加顯色劑顯色。在Axio LabA1顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取至少4個(gè)不同高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核著色，淡黃色為弱染色，棕黃色為中度染色，棕褐色為強(qiáng)染色。無(wú)染色為0，＜25%的腫瘤細(xì)胞呈弱染色為1+，25%～50%的腫瘤細(xì)胞呈中度染色為2+，＞50%～100%的腫瘤細(xì)胞呈強(qiáng)染色為3+。根據(jù)TRIP13免疫組化表達(dá)情況，將B細(xì)胞淋巴瘤患者分為T(mén)RIP13陰性組（0）和TRIP13陽(yáng)性組（≥1+），比較兩組患者的臨床特征；再根據(jù)TRIP13免疫組化表達(dá)強(qiáng)度，將TRIP13陽(yáng)性患者分為T(mén)RIP13弱陽(yáng)性組（1+）和TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組（≥2+），比較兩組患者的臨床特征。

1.5 臨床資料收集 收集所有患者性別、年齡、B細(xì)胞淋巴瘤分型情況、增殖指數(shù)（Ki-67）、乳酸脫氫酶、β2微球蛋白、白蛋白水平、外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)包括T淋巴細(xì)胞比例、T輔助細(xì)胞比例、T抑制細(xì)胞比例、B細(xì)胞比例、NK細(xì)胞比例、活化CD4+細(xì)胞比例、活化CD8+細(xì)胞比例及CD4+/CD8+。按照《美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)B細(xì)胞淋巴瘤治療指南》規(guī)范治療2個(gè)療程后采用Lugarno評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估療效[6]，統(tǒng)計(jì)2個(gè)療程達(dá)完全緩解（complete response,CR）及未達(dá)CR的例數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惰性淋巴瘤組和侵襲性淋巴瘤組TRIP13 mRNA表達(dá)水平比較 惰性淋巴瘤組和侵襲性淋巴瘤組TRIP13 mRNA表達(dá)水平分別為0.37（0.17，1.36）和0.69（0.28，1.15），兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.141，P＞0.05）。

2.2 B細(xì)胞淋巴瘤患者TRIP13蛋白表達(dá)情況分析免疫組化染色顯示，TRIP13可表達(dá)于淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，也可表達(dá)于淋巴瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中。根據(jù)TRIP13 免疫組化表達(dá)情況，分為 0、1+、2+、3+四個(gè)等級(jí)，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。TRIP13免疫組化為0者12例，1+者20例，2+者9例，3+者3例。

2.3 不同TRIP13免疫組化表達(dá)強(qiáng)度B細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床特征比較

2.3.1 TRIP13陰性組和TRIP13陽(yáng)性組患者臨床特征比較 44例B細(xì)胞淋巴瘤患者中，TRIP13陰性組12例，TRIP13陽(yáng)性組 32例。TRIP13陽(yáng)性組患者TRIP13 mRNA表達(dá)水平、Ki-67水平及活化CD8+細(xì)胞比例均高于TRIP13陰性組，T輔助細(xì)胞比例、活化CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+均低于TRIP13陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而兩組患者性別、年齡、B細(xì)胞淋巴瘤分型、乳酸脫氫酶水平、β2微球蛋白水平、白蛋白水平、外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞比例、T抑制細(xì)胞比例、B細(xì)胞比例、NK細(xì)胞比例、2個(gè)療程達(dá)CR例數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 TRIP13陰性組和TRIP13陽(yáng)性組患者臨床特征比較

2.3.2 TRIP13弱陽(yáng)性組和TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組患者臨床特征比較 32例TRIP13陽(yáng)性患者中，TRIP13弱陽(yáng)性組20例，TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組12例。TRIP13弱陽(yáng)性組患者TRIP13 mRNA表達(dá)水平、Ki-67水平、活化CD8+細(xì)胞比例均低于TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組，活化CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+均高于TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而兩組患者性別、年齡、B細(xì)胞淋巴瘤分型、乳酸脫氫酶水平、β2微球蛋白水平、白蛋白水平、外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞比例、T輔助細(xì)胞比例、T抑制細(xì)胞比例、B細(xì)胞比例、NK細(xì)胞比例、2個(gè)療程達(dá)CR例數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 TRIP13弱陽(yáng)性組和TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組患者臨床特征比較

3 討論

TRIP13作為一種新型的有絲分裂檢查點(diǎn)沉默蛋白，是一種AAA-ATP酶。它與亞基閉合型有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（closed mitotic arrest deficiency protein 2,c-Mad2）結(jié)合能夠?qū)е掠薪z分裂檢查點(diǎn)復(fù)合物（mitotic checkpoint complex,MCC）的失活，從而導(dǎo)致姐妹染色單體錯(cuò)誤分離[7]。

本研究結(jié)果顯示，免疫組化TRIP13陰性組和陽(yáng)性組之間、TRIP13弱陽(yáng)性組和強(qiáng)陽(yáng)性組患者之間TRIP13 mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示免疫組化法測(cè)定TRIP13在淋巴瘤組織中的表達(dá)情況與使用RT-PCR方法檢測(cè)組織中TRIP13的mRNA水平具有較好的一致性，免疫組化法測(cè)定TIRP13的表達(dá)情況一定程度上可以反映其組織中的基因水平。在臨床特征上，本研究結(jié)果顯示，TRIP13陽(yáng)性組和陰性組相比、TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組與弱陽(yáng)性組相比，具有更高的Ki-67水平，提示TRIP13的表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤的癌細(xì)胞具有更高增殖速度存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。這和實(shí)體瘤的研究結(jié)果一致，即染色體不穩(wěn)定是癌細(xì)胞產(chǎn)生的遺傳學(xué)機(jī)制，TRIP13過(guò)表達(dá)觸發(fā)有絲分裂檢查點(diǎn)過(guò)早的沉默可能促進(jìn)癌癥發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。這一點(diǎn)已在很多實(shí)體瘤中被證實(shí)[9-12]。在血液系統(tǒng)腫瘤中，TRIP13是高危多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）中過(guò)度表達(dá)的 70個(gè)基因之一[13]，也是構(gòu)成 MM染色體不穩(wěn)定性特征的10個(gè)基因之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞淋巴瘤中，蕈樣真菌病腫瘤組織中TIRP13表達(dá)水平高于對(duì)照組[15]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，TRIP13的免疫組化情況和淋巴細(xì)胞亞群有關(guān)。TRIP13陽(yáng)性組和陰性組相比、TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組與弱陽(yáng)性組相比，活化CD4+細(xì)胞比例更低，活化CD8+細(xì)胞比例更高。以往研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)越低，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)越高，分期越晚，預(yù)后越差[16]。提示細(xì)胞免疫與B細(xì)胞淋巴瘤的進(jìn)展有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者外周血淋巴細(xì)胞亞群具有更低的CD4+T細(xì)胞比例和更高的CD8+T細(xì)胞比例[17]?？赡芎土馨土龅陌l(fā)生過(guò)程中，淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生應(yīng)激性變化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TRIP13表達(dá)強(qiáng)度不但與淋巴瘤細(xì)胞Ki-67水平有關(guān)，而且與T淋巴細(xì)胞亞群的應(yīng)激性反應(yīng)程度有關(guān)。TRIP13陽(yáng)性組和陰性組相比、TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組與弱陽(yáng)性組相比，T細(xì)胞免疫應(yīng)激情況更紊亂。研究發(fā)現(xiàn)在MM中，CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+下降，也提示存在免疫紊亂[18]，和本研究結(jié)果相符。但在膠質(zhì)瘤中，與低 TRIP13水平腫瘤組織相比，高TRIP13水平腫瘤組織CD8+T細(xì)胞特異性基因與調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞特異性基因mRNA水平降低[19]，似乎和本研究不符。這可能與膠質(zhì)瘤和淋巴瘤在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中細(xì)胞免疫反應(yīng)存在一定差異有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)TRIP13陰性組和TRIP13陽(yáng)性組、TRIP13弱陽(yáng)性組和TRIP13強(qiáng)陽(yáng)性組患者2個(gè)療程達(dá)CR例數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然有研究表明TRIP13可激活A(yù)kt信號(hào)通路，導(dǎo)致包括MAD在內(nèi)的蛋白質(zhì)的泛素化、磷酸化和降解，從而導(dǎo)致腫瘤的化學(xué)抗藥性[20]，但本研究結(jié)果并未反映這一點(diǎn)，考慮可能與樣本量較小有關(guān)。

綜上所述，本研究采用免疫組化法分析B細(xì)胞淋巴瘤組織中TRIP13蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TRIP13蛋白表達(dá)水平與mRNA水平一致，且TRIP13陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性與更高的Ki-67水平、活化CD8+細(xì)胞比例及更低的活化CD4+細(xì)胞比例有關(guān)。提示TRIP13陽(yáng)性可能和腫瘤細(xì)胞增殖及免疫調(diào)控異常等發(fā)病機(jī)制有關(guān)。