甘草瀉心湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑HPLC指紋圖譜一致性研究

何 穎，鄒愛英*，涂正偉，劉慧敏

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250；2.天津市南開醫(yī)院，天津市急腹癥器官損傷與中西醫(yī)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300100；3.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 518000）

甘草瀉心湯始載于《傷寒雜病論》，由甘草四兩（炙）、黃芩三兩、干姜三兩、半夏半升（洗）、大棗十二枚（擘）、黃連一兩組成，主要用治誤下所致脾胃損傷嚴(yán)重，胃虛氣逆致心下痞證［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗炎［2-4］、抗?jié)儯?］、抑菌［6］等藥理作用；在治療潰瘍性結(jié)腸炎［7］、口腔潰瘍［8］及部分自身免疫疾病［9］等方面均有較好療效。

中藥傳統(tǒng)湯劑具有組方靈活、可隨證加減的優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用傳承至今。但隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，中藥傳統(tǒng)湯劑因其煎煮費(fèi)時(shí)、不易儲(chǔ)存、攜帶不便等缺點(diǎn)，制約了其在臨床的使用與發(fā)展。中藥配方顆粒是用符合炮制規(guī)范的傳統(tǒng)中藥飲片做原料，經(jīng)過提取、濃縮、分離、干燥、制粒、包裝等現(xiàn)代化制藥技術(shù)制成的單味中藥顆粒劑［10］，具有劑量準(zhǔn)確、易攜帶、服用方便、可提高患者用藥依從性等優(yōu)勢，在一定程度上推動(dòng)了傳統(tǒng)劑型的改革與創(chuàng)新。但中藥傳統(tǒng)湯劑的共煎過程是否對其物質(zhì)基礎(chǔ)產(chǎn)生影響，中藥配方顆粒組成的復(fù)方湯劑與傳統(tǒng)湯劑是否存在物質(zhì)基礎(chǔ)上的差異的困惑，是擺在中藥配方顆粒湯劑推廣應(yīng)用一個(gè)亟需解決的問題。建立中藥指紋圖譜能較為全面地反映藥材中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，其整體性和模糊性的特點(diǎn)適于對中藥質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià)［11］?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)的引入進(jìn)而將中藥復(fù)雜的多成分鑒別轉(zhuǎn)化為對數(shù)據(jù)的解析，達(dá)到定性與定量研究的目的［12］，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評價(jià)的中藥質(zhì)量評價(jià)方法在中藥質(zhì)量研究領(lǐng)域得到了大量的應(yīng)用［13-15］。本試驗(yàn)以甘草瀉心湯為研究對象，通過比較配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑的指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評價(jià)中藥配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑質(zhì)量一致性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Heraeus Pico17微量高速離心機(jī)（美國賽默飛公司）；Elix Essential純水/Simplicity Ultrapure超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；BT25S分析天平（德國賽多利斯公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮公司）；MO-2型電熱套（黃驊新興電器廠）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版，國家藥典委員會(huì)）。

1.2 試劑與試藥 乙腈（HPLC級，天津市康科德公司）、甲酸（HPLC級，Merck公司）、流動(dòng)相用水為純水/超純水系統(tǒng)制備。甘草苷對照品（批號111610-201908，含量以95.0%計(jì)）、黃芩苷對照品（批號110715-201821，含量以95.4%計(jì)）、鳥苷對照品（批號111977-201501，含量以93.6%計(jì)）、鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201814，含量以86.7%計(jì)）均購自中國食品藥品檢定研究院，甘草酸銨對照品（批號1001167400）購自Sigma-Aldrich公司。炙甘草、清半夏、黃芩、黃連、干姜、大棗飲片與配方顆粒（相關(guān)藥材、配方顆粒批次及換算得率見表1）均由江陰天江藥業(yè)公司提供，飲片經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定，均符合2020版《中國藥典》第一部項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。

表1 飲片、配方顆粒信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela venusil MP C18（2）（250 mm×4.6 mm，5μm，序列號：029080）；流動(dòng)相：A相為0.2%甲酸-水，B相為乙腈，流速1.0 ml/min，梯度洗脫程序?yàn)椋?~6 min，4.0%B；6~9 min，4.0%→7.0%B；9~20 min，7.0%→15.0%B；20~25 min，15.0%→17.5%B；25~35 min，17.5%→19.0%B；35~50 min，19.0%→25.0%B；50~65 min，25.0%→27.5%B；65~80 min，27.5%→35.0%B；80~95 min，35.0%→50.0%B；95~100 min，50.0%→90.0%B；100~110 min，90.0%B；雙檢測波長為265 nm、327 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量：10μl，采集時(shí)間：110 min。

2.2 湯劑的制備 每味藥材飲片按照組方配比（炙甘草12 g，黃芩9 g，干姜9 g，半夏12 g，大棗36 g，黃連3 g）稱取10份全方（從現(xiàn)有的3個(gè)批次中取組合成10份，組合見表2）及對應(yīng)重量各單味藥，10份全方傳統(tǒng)湯劑組方T1～T10，約81 g。加約9倍量水，浸泡30 min，回流提取30 min，以200目濾網(wǎng)濾過；再加約7倍量水，回流提取20 min，200目濾網(wǎng)濾過，合并濾液，減壓濃縮（溫度不超過50度）后轉(zhuǎn)移至量瓶定容成約0.2 g生藥/ml的混懸液，冷藏備用。各單味藥加水量及定容濃度按全方重量計(jì)算，并按上述方法制備。

表2 10份湯劑飲片批次組合表

根據(jù)各單味藥配方顆粒得率換算等同組方比例的生藥量，按表2組合每組稱取2份全方配方顆粒，1份按0.2 g生藥/ml的濃度計(jì)算加水量，加開水混懸搖勻后加熱回流5 min，放冷后轉(zhuǎn)移至量瓶定容，冷藏備用，記為配方顆粒煎煮湯劑dec.FD1～dec.FD10；另1份加等量開水混懸搖勻放冷后轉(zhuǎn)移至量瓶定容，冷藏備用，記為配方顆粒熱溶湯劑dis.FD1～dis.FD10。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液制備 依次精密吸取上述T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10、6個(gè)單味藥傳統(tǒng)湯劑樣品各1 ml，置于EP管中，加入1 ml甲醇，渦旋振蕩1 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，即得傳統(tǒng)湯劑供試品溶液T1～T10、各單味藥供試品溶液、配方顆粒煎煮湯劑供試品溶液dec.FD1～dec.FD10和配方顆粒熱溶湯劑供試品溶液dis.FD1～dis.FD10。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨、黃芩苷、鹽酸小檗堿、鳥苷對照品適量，加50%甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為0.221 6、0.214 0、0.215 6、0.202 4和0.215 2 mg/ml的對照品溶液，分別精密吸取甘草苷、甘草酸銨、黃芩苷、鹽酸小檗堿、鳥苷對照品溶液母液5.0、1.0、1.0、1.0和2.0 ml至10 ml量瓶中，混勻，制成混合對照品溶液。

2.4 精密度試驗(yàn) 取T1號傳統(tǒng)湯劑1份，按供試品溶液處理方法制備T1號供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，導(dǎo)出數(shù)據(jù)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行匹配處理。根據(jù)匹配結(jié)果，265 nm色譜圖各共有峰tR（保留時(shí)間）的RSD值均小于0.37%，A（峰面積）的RSD值均小于2.83%，以39號共有峰為參照峰，各共有峰Ar（相對峰面積）的RSD值均小于3.21%；327 nm色譜圖各共有峰tR的RSD值均小于0.14%，A的RSD值均小于2.85%，以25號共有峰為參照峰，各共有峰的Ar的RSD值均小于3.29%，表明該方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 制備6份T1號傳統(tǒng)湯劑，按供試品溶液處理方法得6份T1號供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣，導(dǎo)出數(shù)據(jù)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行匹配處理。根據(jù)匹配結(jié)果，265 nm色譜圖各共有峰的tR的RSD值均低于0.38%，A的RSD值均小于2.88%，以39號共有峰為參照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于4.08%；327 nm色譜圖各共有峰tR的RSD值均低于0.33%，A的RSD值均小于2.89%，以25號共有峰為參照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于3.95%，表明方法具有較好的重復(fù)性。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取T1號傳統(tǒng)湯劑的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別在0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣，導(dǎo)出數(shù)據(jù)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行匹配處理。根據(jù)匹配結(jié)果，265 nm色譜圖各共有峰tR的RSD值均小于0.64%，A的RSD值均小于2.84%，以39號共有峰為參照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于3.85%；327 nm色譜圖各共有峰tR的RSD值均小于0.18%，A的RSD值均小于2.68%，以25號共有峰為參照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于3.63%，表明樣品放置24 h較穩(wěn)定。

2.7 甘草瀉心湯樣品測定及指紋圖譜的建立

2.7.1 樣品測定 精密吸取T1～T10、各單味藥、各單味藥陰性對照、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10和混合對照品溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。

2.7.2 傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜的建立 導(dǎo)出265 nm和327 nm色譜文件，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對10批傳統(tǒng)湯劑樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以S1樣品（T1）圖譜作為參照譜，設(shè)置中位數(shù)法，時(shí)間窗0.2 min，多點(diǎn)校正后進(jìn)行全譜峰匹配，生成對照指紋圖譜（R），匹配共有峰，計(jì)算非共有峰占比、相似度。選取兩個(gè)波長共有峰的并集作為綜合共有峰，選取T2樣品溶液、混合對照品溶液和各單味藥樣品溶液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用測定（該試驗(yàn)及數(shù)據(jù)將在“基于HPLC-QTOF/MS技術(shù)的甘草瀉心湯化學(xué)成分分析”一文中同時(shí)發(fā)表，本文引用），以標(biāo)定綜合共有峰的化合物歸屬。根據(jù)中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)分析，265 nm指紋圖譜匹配出50個(gè)共有峰，T1~T10非共有峰占比分別為3.03%、6.57%、2.51%、2.21%、2.01%、1.72%、2.56%、2.19%、3.04%、3.05%，10批樣品間相似度不低于0.992。327 nm指紋圖譜匹配出31個(gè)共有峰，T1~T10非共有峰占比分別為10.56%、13.16%、10.67%、7.90%、10.06%、8.25%、10.08%、9.06%、8.45%、7.94%，10批樣品間相似度不低于0.994。10批傳統(tǒng)湯劑265 nm和327 nm色譜指紋圖譜見圖1。

圖1 10批傳統(tǒng)湯劑265 nm（A）和327nm（B）色譜指紋圖譜

2.7.3 傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜綜合共有峰的標(biāo)定 對兩個(gè)波長色譜圖分別按Mark峰匹配方法生成對照指紋圖譜，再將兩個(gè)對照指紋圖譜導(dǎo)入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行全譜峰匹配生成對照指紋圖譜，包含54個(gè)色譜峰（兩個(gè)波長共有峰的并集，見圖2），本文將其定義為綜合共有峰，將各綜合共有峰分別以43號色譜峰（對應(yīng)于265 nm的39號和327 nm的25號共有峰）為參照峰，計(jì)算各綜合共有峰的tRr（相對保留時(shí)間）。前期試驗(yàn)［16］已對甘草瀉心湯樣品溶液進(jìn)行化合物鑒定分析，根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用測定各離子峰的tRr與指紋圖譜各綜合共有峰tRr比較來標(biāo)定綜合共有峰的化合物名稱及單味藥來源（見表3）。

表3 綜合共有峰化合物歸屬和藥材歸屬情況

圖2 甘草瀉心湯傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜對照指紋圖譜綜合共有峰情況

2.7.4 傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑指紋圖譜的比較對10批配方顆粒煎煮湯劑、10批配方顆粒熱溶湯劑進(jìn)行組內(nèi)相似度分析，并比較配方顆粒湯劑綜合共有峰匹配情況。以傳統(tǒng)湯劑共有模式分別作為煎煮湯劑和熱溶湯劑的對照圖譜，分析各自與傳統(tǒng)湯劑共有模式的相似度。10批配方顆粒煎煮湯劑樣品兩個(gè)波長指紋圖譜相似度均在0.999以上，內(nèi)部相似度良好，與傳統(tǒng)湯劑綜合共有峰比較，煎煮湯劑共有峰中未匹配到4、6、16、22、26號綜合共有峰。10批配方顆粒熱溶湯劑樣品兩個(gè)波長指紋圖譜相似度均在0.998以上，內(nèi)部相似度良好，與傳統(tǒng)湯劑綜合共有峰比較，熱溶湯劑共有峰中未匹配到4、6、9、22、26、30、31、32、39、40、51、52號綜合共有峰。dec.FD1～dec.FD10與傳統(tǒng)湯劑共有模式的相似度兩個(gè)波長下均在0.996以上，dis.FD1～dis.FD10與傳統(tǒng)湯劑共有模式的相似度兩個(gè)波長下均在0.995以上；說明配方顆粒煎煮湯劑、配方顆粒熱溶湯劑與傳統(tǒng)湯劑之間相似度良好。

2.8 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.8.1 層次聚類分析 將T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10三組匹配結(jié)果剔除綜合共有峰以外的色譜峰，且選取吸光度大的波長的色譜峰面積數(shù)據(jù)作為綜合共有峰峰面積，導(dǎo)入聯(lián)川生物云平臺(tái)的熱圖云工具采用歐式距離進(jìn)行層次聚類分析。層次聚類分析數(shù)據(jù)矩陣中，每一行代表一個(gè)特征峰，每一列代表一個(gè)樣品，深色代表表達(dá)量較高，淺色代表表達(dá)量較低。圖中大致被分成三部分：10、47、53、11、36、34、35號峰為第一部分；17、12、19、20、1、25、9、5、15、46、14、24、4、6、22、21、23、27、29、26、44、16、28、41、42、37、45號峰為第二部分；18、48、50、38、49、33、40、30、39、31、32、7、8、51、52、2、13、43、3、54號 峰 為 第三部分。通過觀察第一部分和第二部分共有峰的表達(dá)，可以明顯地區(qū)分傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑，而配方顆粒煎煮湯劑和熱溶湯劑共有峰表達(dá)差異不大，見圖3。

圖3 甘草瀉心湯三種湯劑層次聚類分析

續(xù)表3 綜合共有峰化合物歸屬和藥材歸屬情況

2.8.2 主成分分析 本文通過對T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10指紋圖譜綜合共有峰峰面積進(jìn)行無監(jiān)督的PCA分析。無監(jiān)督PCA分析顯示（見圖4），第一主成分（PC1）的累積貢獻(xiàn)率為53.6%，第二主成分（PC2）的累積貢獻(xiàn)率為15.3%，第三主成分（PC3）的累積貢獻(xiàn)率為7.52%，其他累積貢獻(xiàn)率忽略不計(jì)，PCA累計(jì)貢獻(xiàn)率R2X=0.764，貢獻(xiàn)度較高；PCA模式識(shí)別，Q2=0.531，預(yù)測能力一般。傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑被劃分在不同的區(qū)域范圍，區(qū)分效果明顯。配方顆粒湯劑樣本聚落得較為集中，傳統(tǒng)湯劑樣本聚落得較為分散。

圖4 甘草瀉心湯3種湯劑主成分分析

2.8.3 偏最小二乘法判別分析 通過對T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10指紋圖譜綜合共有峰峰面積進(jìn)行PLS-DA分析。PLS-DA分析顯示（見圖5），模式識(shí)別的建模參數(shù)優(yōu)于PCA，R2Y=0.779，Q2=0.66，模型對組間變量的解釋度較好，預(yù)測能力一般，得分圖中三組間分離趨勢明顯，特別是顆粒劑兩組樣品既相對集中又體現(xiàn)出提取方式不同的差異，與傳統(tǒng)湯劑相比，說明顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑存在差異，但是根據(jù)模型解釋度與預(yù)測性數(shù)據(jù)判斷，差異顯著性不大。三組之間差異綜合共有峰得分圖見圖6，提取VIP>1的潛在差異綜合共有峰分別為47、49、16、26、9、38、32、11、7、22、8、36、53、24、42、6、14、27、4、46和17號峰。

圖5 甘草瀉心湯3種湯劑PLS-DA分析

圖6 甘草瀉心湯3種湯劑差異綜合共有峰得分圖

3 討論

近年來，中藥配方顆粒運(yùn)用得到了較快發(fā)展，一些問題也隨之出現(xiàn)，其與傳統(tǒng)湯劑的一致性也成了大家關(guān)心的一個(gè)重要問題。中藥作為一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)體系，在考查配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑一致性時(shí)很難像化學(xué)藥一樣以某個(gè)化學(xué)實(shí)體作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，指紋圖譜可以有效地表征中藥復(fù)雜體系所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量。當(dāng)前中藥指紋圖譜研究方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳、高效液相色譜法等色譜方法，以及紫外光譜法、（近）紅外光譜法等光譜方法。其中HPLC因其良好的分離性能、較高的檢測靈敏度，且在醫(yī)藥研發(fā)、生產(chǎn)、監(jiān)管單位具有較高的普及率而使得中藥HPLC指紋圖譜成為指紋圖譜的主流。本文以甘草瀉心湯為研究對象，建立了兩個(gè)波長下傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒湯劑（熱溶、煎煮）HPLC指紋圖譜，分析方法精密、穩(wěn)定，可重復(fù)。10批傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜相似度較高，配方顆粒（熱溶、煎煮）湯劑指紋圖譜組內(nèi)相似度及與傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜之間相似度均較高。根據(jù)層次聚類分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑之間可以明顯的區(qū)分開，而配方顆粒煎煮湯劑和熱溶湯劑共有峰表達(dá)差異不大，這也表明配方顆粒直接用熱水溶解即可，無需再進(jìn)行煎煮；配方顆粒（熱溶、煎煮）湯劑樣本聚落得較為集中，傳統(tǒng)湯劑樣本聚落得較為分散，說明配方顆粒具有良好均一性。

本文通過比對了多個(gè)波長的指紋圖譜，確定了265 nm和327 nm兩個(gè)波長，其中265 nm出峰較多，但有一些色譜峰265 nm波長下沒有或者非常低，而在327 nm波長峰較高，故采用了兩個(gè)波長的指紋圖譜。同時(shí)為了便于比較，本文提出了綜合共有峰的概念，即兩個(gè)波長共有峰的并集，取峰面積大的波長的數(shù)據(jù)作為進(jìn)一步多元統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)。

本文出于考查配方顆粒生產(chǎn)過程及調(diào)配成湯劑過程中加熱煎煮、熱水溶解等環(huán)節(jié)對藥材成分的影響，選用與配方顆粒對應(yīng)的同批次藥材制成傳統(tǒng)湯劑進(jìn)行比較，基于本文的結(jié)果及研究方法，后期將進(jìn)一步擴(kuò)大藥材產(chǎn)地批次建立更具有代表性的傳統(tǒng)湯劑對照指紋圖譜，并對更大范圍廠家的配方顆粒商品進(jìn)行一致性評價(jià)。