基于指紋圖譜和體外抗胰脂肪酶活性的硫熏山楂飲片質(zhì)量分析

高利興，戴衍朋，石典花，周 倩

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 250014；3.國家中醫(yī)藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術(shù)與原理重點(diǎn)研究室，山東 250014）

山楂為薔薇科植物山里紅Cralaegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果實(shí)［1］，自古藥食兩用，有消食化積，健脾開胃的功效［2］。山楂的藥用價(jià)值很高，不僅可以調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)脂代謝，還具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗氧化、抗腫瘤等作用［3］。硫磺熏蒸具有增白、防潮、防蟲的功效，但過度硫磺熏蒸不僅會(huì)導(dǎo)致藥材殘留二氧化硫等有毒有害物質(zhì)超標(biāo)，而且會(huì)對(duì)中藥成分產(chǎn)生較大影響，如白芷［4］、苦杏仁［5］、浙貝［6］、西洋參［7］等均有報(bào)道。同時(shí)過度硫熏的藥材不僅無法產(chǎn)生應(yīng)有的療效，反而會(huì)產(chǎn)生毒副反應(yīng)，從而影響其療效。因此《中國藥典》2020版明確規(guī)定10個(gè)品種的中藥飲片可以用適量的硫磺熏制，這10個(gè)品種是天麻、白及、山藥、天冬、牛膝、白芍、粉葛、天花粉、白術(shù)、黨參，而且明確規(guī)定了硫磺處理后的藥品二氧化硫殘留限量為不得超過400 mg/kg，《中國藥典》未做規(guī)定的品種其二氧化硫殘留限量為不能超過150 mg/kg。為了考查硫磺熏蒸對(duì)山楂質(zhì)量的影響，本文制備了同一來源的多批次烘干和硫熏山楂飲片，進(jìn)行了指紋圖譜分析和抑制胰脂肪酶活性測(cè)定，為山楂飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 山楂鮮果（13批）；金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)

PRF10052541，購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；乙腈（色譜純，購于默克公司），磷酸（色譜純，購于天津科密歐）；胰脂肪酶（PL）購于合肥博美生物科技有限公司，奧利司他（Orlistat）購于上海源葉生物科技有限公司，對(duì)硝基苯基丁酸酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三羥甲基氨基甲烷、二甲基亞砜、乙腈、升華硫、過氧化氫、氫氧化鈉、甲基紅均為市售分析純。

1.2 儀器 1100型高效液相色譜儀（Agilent）；DKS22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Multiskan FC酶標(biāo)儀（Thermo Scientitic），TGL-16B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器），PHS-3E pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），渦旋混勻器（廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司），96孔板（NEST生物科技），移液槍（Eppendorf）。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ThermoSyncronisC18（250mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣量：10 μl；檢測(cè)波長：203 nm［1］。

2.1.2 山楂飲片的制備 取山楂鮮果，除去果核，切5～7 mm厚的片，平鋪于篩網(wǎng)上，置熱風(fēng)循環(huán)烘箱內(nèi)，60℃烘干，得烘干品。取山楂鮮果，除去果核，切5～7 mm厚的片，平鋪于篩網(wǎng)上，置自制硫熏棚內(nèi)，點(diǎn)燃硫磺，熏蒸5 min，然后再置熱風(fēng)循環(huán)烘箱內(nèi)，60℃烘干，得硫熏品。

2.1.3 溶液制備

2.1.3.1 供試品溶液的制備 取山楂飲片粉末（過40目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水20 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，14 000×g離心10 min，取上清液即得［3］。

2.1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取山楂1號(hào)樣品的供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，根據(jù)所得指紋圖譜計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.83%，相對(duì)峰面積RSD＜1.52%，表明精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山楂1號(hào)樣品的供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣，根據(jù)所得指紋圖譜計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2.17%，相對(duì)峰面積RSD＜1.98%，表明穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取山楂1號(hào)供試品5份，按照供試品的制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)所得指紋圖譜計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2.77%，相對(duì)峰面積RSD＜2.90%，表明重復(fù)性良好。

2.2 山楂飲片指紋圖譜構(gòu)建和相似度評(píng)價(jià)

2.2.1 共有峰的標(biāo)識(shí) 按照供試品溶液的制備方法將13批烘干山楂飲片制備供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)樣，得到S1-S13供試品溶液的HPLC指紋圖譜。將HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（國家藥典委員會(huì)2004版）”，經(jīng)過分析，選擇19個(gè)共有色譜峰作為其特征峰，13批山楂飲片的指紋圖譜的主要色譜峰峰形基本一致，見圖1和圖2。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，對(duì)各主要色譜峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明各色譜峰的峰面積存在一定的差異，見表2。

表2 13批烘干山楂飲片共有峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

圖1 烘干山楂樣品的HPLC特征圖譜峰

圖2 13批烘干山楂樣品的HPLC疊加圖

按照供試品溶液的制備方法將13批硫熏山楂飲片制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，得到S1-S13供試品溶液的HPLC指紋圖譜。同上方法進(jìn)行分析，同樣選擇19個(gè)共有色譜峰作為特征峰，13批硫熏山楂飲片的指紋圖譜的主要色譜峰峰形基本一致，見圖3和圖4。以金絲桃苷色譜峰為參照峰，對(duì)各主要色譜峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明各色譜峰的峰面積存在一定的差異，見表3。

表3 13批硫熏山楂飲片共有峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

圖3 硫熏山楂樣品的HPLC特征圖譜

圖4 13批硫熏山楂樣品的HPLC疊加圖

2.2.2 相似度計(jì)算 使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行相似度計(jì)算，首先將13批烘干山楂和13批硫熏山楂飲片的圖譜數(shù)據(jù)逐條導(dǎo)入，生成對(duì)照?qǐng)D譜，經(jīng)過多點(diǎn)校正，色譜峰匹配，計(jì)算平均數(shù)相似度。13批烘干山楂飲片指紋圖譜相似度較高，均在0.95以上，可見山楂飲片的質(zhì)量在不同時(shí)間、地點(diǎn)采集的差異不大，見表4。13批硫熏山楂飲片中，第3批和第11批相似度低于0.9，其他各批均高于0.95，見表5。

表4 13批烘干山楂飲片指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

表5 13批硫熏山楂飲片指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.3 山楂烘干品和硫熏品特征指紋圖譜的比較 直觀觀察山楂烘干品和硫熏品特征圖譜，發(fā)現(xiàn)二者在峰形、峰數(shù)等方面，差異較小，見圖5。

將山楂烘干品和硫熏品特征圖譜同時(shí)導(dǎo)入指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，分析結(jié)果二者相似度可達(dá)0.992，表明山楂烘干品和硫熏品二者在指紋圖譜的色譜峰數(shù)據(jù)差異較小。將13批烘干山楂的特征圖譜以及硫熏山楂的HPLC指紋圖譜導(dǎo)入指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)分析，13批硫熏樣品中僅有3號(hào)和11號(hào)飲片與烘干樣品的相似度＜0.90，其他各批樣品相似度均＞0.90，見表6。

表6 13批硫熏山楂飲片與烘干山楂飲片特征圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 胰脂肪酶抑制活性測(cè)定

2.3.1 山楂飲片提取液制備 取山楂飲片約5.0 g，加水50 ml，加熱回流2次，每次30 min，濾過，合并濾液，濃縮至50 ml，得生藥質(zhì)量濃度為100 mg/ml的水提液。

2.3.2 山楂樣品制備 水提液10 000×g離心10 min，用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液［4］稀釋到質(zhì)量濃度為50 mg/ml后，再使用二甲基亞砜（DMSO）［5］逐級(jí)稀釋，得到質(zhì)量濃度為10 mg/ml的樣品。

2.3.3 胰脂肪酶溶液（PL）制備 精密稱取適量的胰脂肪酶粉末，使用磷酸鹽（PBS）緩沖液［6］配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的粗酶液，10 000×g離心5 min，再取上清液，現(xiàn)配現(xiàn)使用。

2.3.4 對(duì)硝基苯基丁酸酯（pNPB）溶液［7］（底物）配制 使用移液槍吸取18μl pNPB溶液于10 ml量瓶中，再用乙腈定容，獲得濃度為10 mmol/L的溶液，置于4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.5 胰脂肪酶抑制率測(cè)定方法 在1.5 ml離心管（EP管）［8］中加入抑制劑（或Tris-HCl）與酶于37℃下孵育10 min，加入150μl底物，混勻，孵育5 min。取150μl于96孔板中，于405 nm下測(cè)定吸光度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最終求得所得結(jié)果的平均值。各組加入量見表7。

表7 反應(yīng)體系各組所加試劑及用量 μl

胰脂肪酶抑制率（%）=［1-（B-b）/（A-a）］×100%［9-10］

其中，A為未添加抑制劑酶的活性，a是其空白對(duì)照（未加酶）；B是加入抑制劑的酶的活性，b是其陰性對(duì)照（未加酶）。

2.3.6 山楂樣品抑制胰脂肪酶活性測(cè)定 以質(zhì)量濃度為10 mg/ml的山楂水提液樣品作為胰脂肪酶抑制劑，測(cè)得山楂烘干品和硫熏品抑制率。結(jié)果烘干品的抑制率為35.31%～56.33%，硫熏品的抑制率為15.97%～30.61%，二者具有極顯著差異（P＜0.001）。見表8。

表8 山楂烘干品與硫熏品胰脂肪酶抑制率

2.4 硫熏山楂的二氧化硫殘留測(cè)定 照《中國藥典》二氧化硫殘留量測(cè)定法（通則2331）［9］第一法（酸堿滴定法）對(duì)13批硫熏山楂進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果經(jīng)硫熏后的山楂片二氧化硫殘留量為15.97～30.61μg/g，均符合《中國藥典》不得超過150μg/g的規(guī)定。結(jié)果見表9。

表9 山楂硫熏品二氧化硫殘留含量（n=2）

3 討論與小結(jié)

在中藥材進(jìn)行加工干燥時(shí)一些易腐爛變質(zhì)、不易干燥的中藥材一般都采用硫磺熏蒸干燥法。硫磺不完全燃燒產(chǎn)生二氧化硫，能使中藥色澤鮮艷，并能達(dá)到防蟲、殺菌、防霉、增白等效果，本課題組在山楂的產(chǎn)地調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，為追求山楂飲片外形的美觀，山楂鮮果切制后常使用硫磺熏蒸5～10 min，然后再進(jìn)行干燥，也可以減少流通、貯藏中發(fā)生霉變、蟲蛀等，而且短時(shí)間熏蒸后，二氧化硫殘留符合《中國藥典》規(guī)定。

目前常用于硫磺熏蒸對(duì)中藥成分影響的分析方法有HPLC指紋圖譜法［4，8］、薄層色譜法［9］等。本文采用HPLC指紋圖譜的方法，對(duì)烘干山楂和硫熏山楂進(jìn)行了化學(xué)成分的對(duì)比，結(jié)果表明二者的成分變化比較小，其原因可能是山楂熏蒸的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于山藥等品種的熏制時(shí)間。同時(shí)也說明，HPLC指紋圖譜的方法無法對(duì)硫熏和非硫熏山楂進(jìn)行判別。

由胰腺分泌出的胰脂肪酶是食物脂肪水解過程中的主要酶類，能夠代謝50%～70%的甘油三脂，抑制胰脂肪酶活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，可以達(dá)到控制和治療肥胖和脂質(zhì)代謝紊亂的目的［10-12］。本課題組經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)，山楂水提取物具有較好的抑制胰脂肪酶活性的作用［13］，大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明［14］山楂具有較好的預(yù)防營養(yǎng)過剩造成的肥胖的作用。因此采用體外抑制胰脂肪酶活性的方法，對(duì)山楂烘干品和硫熏品進(jìn)行了對(duì)比分析。采用SPSS軟件對(duì)兩種處理方式山楂飲片的胰脂肪酶抑制率進(jìn)行對(duì)比分析，烘干品的抑制率為（46.07±5.89）%，硫熏品為（25.42±4.99）%。烘干和硫熏山楂樣品進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，烘干法制備的山楂樣品胰脂肪酶抑制活性顯著高于硫熏品。

綜合HPLC指紋圖譜和體外抑制胰脂肪酶活性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，硫熏山楂雖然熏制時(shí)間僅5～10 min，其化學(xué)成分也未發(fā)生顯著變化，二氧化硫殘留量符合《中國藥典》規(guī)定，但其藥理活性卻顯著降低，表明硫磺熏蒸對(duì)中藥的藥效產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響，建議在山楂的加工干燥過程中盡量不采用硫磺熏蒸的加工方法。