付維來,田康利,夏聰聰,劉浩樂,孫佳瀅,成大欣,劉恩岐,李艷奎,趙四海
(1. 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科,天津 300211;2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心,陜西西安 710061)
腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是指各種因素導(dǎo)致的腹主動脈局部擴(kuò)張,當(dāng)動脈直徑擴(kuò)張超過正常值50%時,可診斷為AAA[1-3]。AAA是嚴(yán)重影響人們健康的疾病之一,晚期動脈瘤破裂死亡率可達(dá)到80%。盡管隨著早期篩檢的進(jìn)行,AAA得到了一定預(yù)防,但其有效的藥物治療措施尚未建立,該疾病的管理仍面臨困難[2-4]。臨床上收集的動脈瘤組織樣本分析顯示,AAA 的特征除了表現(xiàn)為主動脈直徑變大外,鏡下可見平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMC)減少、彈力纖維層斷裂或消失、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)降解、炎癥反應(yīng)增加等[2,5]。由于目前大多數(shù)AAA 患者通過血管內(nèi)介入方法治療,使得臨床AAA 標(biāo)本很難收集。嚙齒類動物是研究腹主動脈瘤發(fā)病機(jī)制和防治策略的理想模型[6-8]。建立AAA 模型的常用方法有:豬胰彈性蛋白酶(porcine pancreatic elastase, PPE)灌注法、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)輸注法和氯化鈣涂抹法等,而前兩種方法又更為常用[9-10]。PPE 灌注法誘導(dǎo)的模型中,小鼠腹主動脈的一個節(jié)段經(jīng)PPE 灌注5 min 左右,通過機(jī)械擴(kuò)張和誘發(fā)局部炎癥,在接下來的數(shù)天到數(shù)周內(nèi)形成AAA。AngⅡ輸注法通過在高血脂狀態(tài)下給動物用微滲透泵持續(xù)輸注AngⅡ,造成系統(tǒng)性高血壓,從而誘發(fā)動脈瘤。AngⅡ誘導(dǎo)的模型多在載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除小鼠、低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor,LDLR)或其他脂代謝相關(guān)基因突變品系小鼠進(jìn)行,利用高脂血癥引起的炎癥狀態(tài)和高血壓等,促進(jìn)動物形成動脈瘤[8,10]。由此可見,兩種造模方法原理不甚相同,以往研究也發(fā)現(xiàn)兩種模型的動脈瘤誘發(fā)部位和組織學(xué)特征有一定差異[6,8-10]。本研究通過比較兩種模型發(fā)病特點(diǎn)和組織學(xué)特征,探討兩種模型的異同和其應(yīng)用范圍,以期為本領(lǐng)域研究人員在模型選擇上提供參考。
16 只雄性10~14 周齡C57BL/6J 小鼠,其 中10只作為PPE 灌注組,6 只作為正常對照;10 只雄性10~14 周齡ApoE 敲除小鼠(C57BL/6J 遺傳背景)。小鼠的飼養(yǎng)和繁殖均在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證:SYXK(陜)2020-005],動物實(shí)驗(yàn)均符合西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物倫理指南。
PPE(Cat:E1250)購自Sigma 公司,用PBS 配置成1.5U/mL 溶液備用。AngⅡ(Cat:4474-91-3)購自Cayman 公司。微滲透泵(型號:2004)購自ALZET公司。蘇木素-伊紅(HE)染液(Cat:G1005)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。Masson 三色染液(Cat:G1345)購自北京索萊寶科技有限公司。羊抗小鼠平滑肌細(xì)胞α-actin 抗體(Cat:NB300-978)購自Novus Biologicals 公司。大鼠抗小鼠CD68 抗體(Cat:137002)購自Biolegend 公司。生物素標(biāo)記的驢抗羊二抗(Cat:705-065-003)、羊抗大鼠二抗(Cat:112-065-062)和鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(Cat:016-030-084)均購自Jackson Immuno Research Laboratories 公司。AEC 顯色劑(Cat:SK-4200)購自Vector Laboratories 公司。血脂檢測試紙條購自Polymer Technology Systems公司。冷凍包埋劑OCT(Cat:4583)購自SAKURA 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純,彈力纖維染液為國產(chǎn)相關(guān)試劑配制。
手術(shù)顯微鏡(型號:YAN-4A,上海玉研)、手術(shù)顯微鏡照相機(jī)(型號:ProS5 Lite,麥克奧迪)、尾套式血壓測量儀(型號:BP-2000,Visitech Systems)、卡迪克干式生化分析儀(美國Polymer Technology Systems)、冰凍切片機(jī)(型號:CM1950, Leica)、生物顯微鏡(型號:80i, Nikon)、生物顯微鏡照相機(jī)(型號:DP72,Olympus)和圖像分析軟件(WinRoof 6.5, Mitani)。
1.4.1 PPE 誘導(dǎo)小鼠AAA 模型 小鼠稱重后,放入麻醉機(jī)的預(yù)麻醉盒中持續(xù)麻醉數(shù)分鐘,待小鼠麻醉后,將小鼠仰臥位固定,持續(xù)面罩吸入麻醉,麻醉劑均為異氟烷。用脫毛膏去除小鼠腹部被毛,碘酒消毒手術(shù)區(qū),沿腹中線切開長2~3 cm 切口,充分暴露腎下腹主動脈至髂動脈段,鈍性器械分離動脈周圍組織,分離并結(jié)扎側(cè)支血管以防止灌注時漏液,分離暴露腹主動脈段約1 cm。給分離的腹主動脈埋置8-0 絲線,在上下兩端活結(jié)結(jié)扎,接近下端結(jié)扎線用8-0 縫合針頭刺破血管,快速清理血液,用顯微鑷將PE-10 輸注管經(jīng)血管刺破口插入腹主動脈。結(jié)扎固定輸注管后,用持續(xù)灌注泵迅速推進(jìn)約30 μL PPE,灌注5 min 后,拔出輸注管,用11-0 絲線縫合血管開口,開放下肢血循環(huán)并關(guān)腹。術(shù)后將小鼠放置溫暖環(huán)境恢復(fù)數(shù)小時,待小鼠活動正常后放回飼養(yǎng)室,整個手術(shù)過程在手術(shù)顯微鏡下操作。
1.4.2 AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA模型 根據(jù)小鼠體質(zhì)量,計(jì)算AngⅡ配置濃度,最終輸注劑量為1 000 ng/(kg·min)。將配好的AngⅡ注入膠囊微滲透泵備用。小鼠麻醉后,將小鼠俯臥位固定,碘酒消毒頸背部手術(shù)區(qū)皮膚,剪開一個小切口,以剛好能送入微滲透泵為準(zhǔn),用平鑷輕輕擴(kuò)張分離皮下組織,以便埋植滲透泵。將注入AngⅡ的微滲透泵經(jīng)小切口輕輕送入皮下,縫合切口,術(shù)后小鼠恢復(fù)正常后放回飼養(yǎng)室,兩種模型誘導(dǎo)方法流程見圖1A 和圖1D。
對于PPE 模型,術(shù)前及術(shù)后14 d,體式顯微鏡拍照記錄小鼠腹主動脈直徑變化,直徑數(shù)據(jù)通過軟件測量獲得。鏡下分離腹主動脈,直徑增大50%以上判定為AAA 形成。PPE 灌注14 d 后安樂死小鼠,取病變段腹主動脈,包埋于OCT 中,冰凍組織切片分析。對于AngⅡ模型,微滲透泵埋植后觀察小鼠情況,記錄其死亡數(shù)量和死亡時間,28 d 后安樂死小鼠,分離全部主動脈,對于AAA 病變節(jié)段,包埋處理同上。
接受AngⅡ輸注的小鼠和正常對照小鼠,經(jīng)過訓(xùn)練后,小鼠安靜狀態(tài)下用尾套法進(jìn)行無創(chuàng)血壓測量。
接受AngⅡ輸注的ApoE-/-小鼠和正常對照小鼠,經(jīng)剪尾采血后,用試紙條檢測血脂水平。
常規(guī)方法進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,彈力纖維染色和Masson 染色,具體步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。免疫組織化學(xué)染色采用標(biāo)準(zhǔn)的生物素-鏈霉親和素過氧化物酶法。血管平滑肌細(xì)胞及彈力纖維染色顯示血管壁SMC 及彈力纖維層降解情況,SMC 的消耗和彈力纖維層降解從輕度到重度分為4 個級別(Ⅰ-Ⅳ)進(jìn)行評價。AAA Ⅰ級:彈力纖維層破壞和血管平滑肌細(xì)胞減少等損傷僅局限于1 層彈力纖維層;AAAⅡ級:損傷涉及兩層或全部,但僅限于1/4血管;AAA Ⅲ級:損傷涉及所有彈力纖維層,但僅限于1/2 以下血管;AAA Ⅳ級:損傷涉及所有彈力纖維層并延伸至3/4 以上血管。巨噬細(xì)胞染色陽性細(xì)胞數(shù)量顯示血管壁炎性反應(yīng)程度,可根據(jù)浸潤的面積和部分分為4 個級別(Ⅰ-Ⅳ),其標(biāo)準(zhǔn)同上。
采用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組比較數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),符合條件情況下采用兩組均數(shù)t 檢驗(yàn),否則采用非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
如圖1A-圖1C 所示,PPE 灌注后,機(jī)械擴(kuò)張力可以使得小鼠腹主動脈從本底0.52 mm 左右擴(kuò)張到0.80 mm 左右,術(shù)后14 d,血管直徑達(dá)到(1.23±0.11)mm,全部小鼠達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn),形成AAA。PPE模型如果手術(shù)順利,一般均可形成AAA。如圖1D-圖1E 所示,給予AngⅡ輸注4 周以后,部分小鼠形成動脈瘤。在本研究10 只ApoE-/-小鼠中,3 只在AngⅡ輸注3~4 周時死亡,解剖可見動脈瘤形成,腎上AAA 破裂出血。4 周結(jié)束取材時,主動脈可見不同程度擴(kuò)張,達(dá)到AAA 診斷標(biāo)準(zhǔn)的有3 只,總體成功率約為60%(6/10)。但 如 圖1E 所 示,Ang Ⅱ誘 導(dǎo) 的AAA 血管直徑個體差異較大(1.2 mm 至2.2 mm)。另外一個特點(diǎn)是AngⅡ輸注也可引起胸主動脈和主動脈弓部擴(kuò)張,甚至到達(dá)動脈瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)。
如圖2A 所示,AngⅡ輸注后可明顯升高小鼠血壓,但也存在一定的個體差異,其中有3 只(3/10)小鼠血壓升高未超過140 mmHg,這些小鼠最終也未形成動脈瘤,這提示AngⅡ輸注后血壓的檢測對判斷成瘤具有一定的意義。另外,AngⅡ輸注誘導(dǎo)動脈瘤的另一個重要因素就是高脂血癥狀態(tài),如圖2B 所示,ApoE 敲除小鼠平均血脂約是正常野生型小鼠的4 倍[(102±8)mg/dL vs.(418±114)mg/dL],高 脂 狀 態(tài)是提高成瘤率的一個重要因素。
圖2 AngⅡ輸注小鼠血壓和血膽固醇水平Fig.2 The blood pressure and blood cholesterol of AngⅡinfused ApoE-/-mice and wild type mice
A:PPE誘導(dǎo)的AAA流程圖;B:術(shù)前、PPE灌注及術(shù)后14 d動脈直徑變化;C:PPE灌注后0 d和14 d血管直徑比較(n=10);D:AngⅡ誘導(dǎo)動脈瘤示意圖;E:AngⅡ輸注4周后血管擴(kuò)張,部分小鼠形成動脈瘤;F:AngⅡ輸注4周成瘤小鼠血管直徑和正常血管直徑比較(n=3)。*P<0.05,**P<0.01。
如圖3 所示,正常血管HE 染色可見血管結(jié)構(gòu)清晰。PPE 模型小鼠病變段血管腔明顯擴(kuò)大,中膜平滑肌層著色變淺,甚至消失,另外,可見明顯的炎癥細(xì)胞彌散性浸潤,血管結(jié)構(gòu)不清晰,分層不明確。AngⅡ模型組血管腔也明顯擴(kuò)大,但中膜平滑肌層尚可見,損傷沒有PPE 模型嚴(yán)重,由于AngⅡ模型多在高血脂小鼠誘導(dǎo),有時可見到內(nèi)膜伴有動脈粥樣硬化病變。AngⅡ模型明顯的特征是可見因動脈夾層而出現(xiàn)的血管“假腔”,腔內(nèi)充滿血凝塊等(圖3)。正常血管彈力纖維染色一般可見小鼠腹主動脈有4 層左右的彈力纖維層,彈力纖維呈現(xiàn)規(guī)律性的彎曲。PPE 模型小鼠彈力纖維破壞較為嚴(yán)重,中膜彈力纖維多斷裂、退行性變、甚至消失或只留下殘跡,經(jīng)組織學(xué)評分,本研究10 只小鼠中,3 只評分為Ⅲ級,7 只評分為Ⅳ級,損傷涉及所有彈力纖維層。AngⅡ模型小鼠基本保留了全部彈力纖維層,可見彈力纖維局部斷裂,退行性變,彈性消失(從彎曲狀變?yōu)槠街保?,彈力纖維損傷評分一般在Ⅱ級。在本研究中,AngⅡ模型組也觀測到了動脈壁撕裂口,通向血管假腔(彈力纖維染色,紅色箭頭所示)。
圖3 正常血管和兩種模型病變腹主動脈段組織學(xué)觀察Fig.3 The histological comparison of normal aorta and two types of experimental AAA in mice
如圖4 所示,正常血管Masson 染色可見血管結(jié)構(gòu)清晰,平滑肌層呈紅色,管周膠原纖維呈藍(lán)色。AngⅡ模型組血管Masson 染色可見平滑肌層也呈紅色,但是有不同程度損傷,在血管撕裂口出現(xiàn)斷裂,局部平滑肌層變薄,正常形態(tài)發(fā)生改變。膠原纖維變淺,并有不同程度的溶解和消失。而在PPE 模型組,典型的平滑肌層環(huán)狀結(jié)構(gòu)消失,損傷嚴(yán)重,膠原纖維也多溶解,可能與炎癥細(xì)胞浸潤有關(guān)。
圖4 正常血管和兩種模型病變腹主動脈段Masson 染色Fig.4 Masson’s trichrome stain of normal aorta and two types of experimental AAA in mice
SMC 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,正常血管平滑肌層呈現(xiàn)典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)著色(圖5)。相比于正常動脈血管,AngⅡ模型組血管SMC 標(biāo)志物α-actin表達(dá)水平下降,SMC 染色變淺,損傷評分多為Ⅱ級。PPE 灌注小鼠腹主動脈瘤體組織SMC 免疫組化染色顯示大多樣本SMC 損耗殆盡或僅留部分殘跡,著色很淺,9 只損傷評分為Ⅳ級,1 只評分為Ⅲ級。和SMC結(jié)果類似,巨噬細(xì)胞(CD68標(biāo)記)浸潤在PPE 組也明顯嚴(yán)重,4 只損傷評分為Ⅲ級,6 只評分為Ⅳ級。AngⅡ模型組損傷評級維持在Ⅱ級,正常血管巨噬細(xì)胞染色偶見陽性著色細(xì)胞,分析可能為血管局部定居的炎癥細(xì)胞。
圖5 巨噬細(xì)胞浸潤和平滑肌損傷免疫組化染色的比較Fig.5 The macrophages and SMCs IHC stain of normal aorta and two types of experimental AAA in mice
如表1 所示,對兩種小鼠模型與人AAA 生物學(xué)特征進(jìn)行了比較。從疾病易發(fā)部位上,與人AAA 相比,PPE 模型可以精確定位到腎下腹主動脈,AngⅡ模型出現(xiàn)以腎上腹主動脈為主,胸主動脈和主動脈弓也可伴有動脈瘤發(fā)生。從組織學(xué)上比較,PPE 模型呈現(xiàn)出急性炎癥特征,彈力纖維和平滑肌細(xì)胞損傷表現(xiàn)得較為典型,而AngⅡ模型的炎癥表現(xiàn)相對較弱。由于人的AAA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,不同患者的始發(fā)因素可能不同,故出現(xiàn)一定的異質(zhì)性。兩種小鼠模型一般很少看到瘤體部位伴有腔內(nèi)血栓。AngⅡ模型造成血管壁撕裂,形成動脈夾層,可見典型的血管“假腔”形成,而人的AAA 并不一定合并動脈夾層。AngⅡ模型技術(shù)簡單,但耗材和試劑昂貴,造模成本較高,且成模率一般,模型異質(zhì)性較大。PPE 模型手術(shù)復(fù)雜,但成本較低,模型異質(zhì)性小,個體差異不大,整體費(fèi)用較低。
表1 人和小鼠腹主動脈瘤生物學(xué)特征的比較Tab. 1 Comparison of histological features between humans and mice
本研究通過兩種方法制備了小鼠AAA 的模型,并對其造模成功率、病理組織學(xué)特征和瘤體細(xì)胞成分進(jìn)行了分析和比較,以期為AAA 相關(guān)研究人員在模型選擇上提供支持。由于腔內(nèi)外科技術(shù)的興起,越來越多的動脈瘤患者采用該方法治療,人的動脈瘤組織樣本收集變得困難起來。通過動物模型模擬人類AAA,進(jìn)而研究其發(fā)病機(jī)制、潛在治療靶點(diǎn)和藥物安全評價逐漸成為本領(lǐng)域的主流研究范式[6,10-11]。
在AAA 相關(guān)研究中,PPE 誘導(dǎo)模型、AngⅡ誘導(dǎo)模型和氯化鈣誘導(dǎo)模型是應(yīng)用相對比較普遍的模型,尤其是前兩者[8,10]。AAA 的發(fā)生通常被認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,包括年齡、性別、吸煙、家族遺傳史、高血壓和動脈粥樣硬化等[1,12]。由于人類動脈瘤組織中可見明顯的炎癥特性,現(xiàn)行AAA 機(jī)制研究中,炎癥參與學(xué)說很受重視。在動脈瘤模型的制備中也考慮到這一點(diǎn),PPE 模型能夠成模的主要兩個因素,一是手術(shù)中的機(jī)械壓力對動脈壁擴(kuò)張,二是PPE 對血管壁的滲透引起急性炎癥反應(yīng),而急性炎癥反應(yīng)在腹主動脈引起的平滑肌細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞浸潤引起的胞外基質(zhì)分解、彈力纖維降解是其主要成模因素[8,10]。本研究中的PPE 模型小鼠成瘤率非常高,如果手術(shù)成功,一般均可成模。而在AngⅡ模型中,一般要求給高血脂狀態(tài)的小鼠輸注Ang Ⅱ,以提高成模率,所以ApoE 或LDLR 敲除小鼠常用于該模型的制備。高血脂狀態(tài)下,小鼠也處于一個相對炎癥反應(yīng)較高的水平,AngⅡ誘導(dǎo)系統(tǒng)性高血壓后,在主動脈局部可形成瘤樣擴(kuò)張,而且動脈瘤在腎上腹主動脈易發(fā)。本研究中也觀察到除了腎上動脈成瘤外,個別小鼠胸主動脈和動脈弓部也有不同程度擴(kuò)張。AngⅡ輸注導(dǎo)致的高血壓狀態(tài),往往在動脈局部形成動脈壁撕裂,形成主動脈夾層,血液灌入夾層后形成典型的血管“假腔”,從外觀上看,血管呈現(xiàn)囊狀擴(kuò)張。AngⅡ雖然也可以在野生型小鼠成瘤,但其成功率很低,不具備造模價值。AngⅡ輸注在ApoE 或LDLR 敲除小鼠一般的成瘤率在50%~70%之間,本研究中有60%小鼠成瘤(6/10)。該模型在成瘤過程中或成瘤后,易由于血壓高等造成瘤體破裂,動物死亡,這往往不可控??傮w來講,PPE 模型成瘤率相對較高,術(shù)后動物死亡率在手術(shù)熟練以后可降至較低水平,而AngⅡ模型成瘤率相對低一些,造模過程中,血壓急劇升高導(dǎo)致一定的不可控死亡率[13]。
在組織學(xué)特性比較上,PPE 誘導(dǎo)的AAA 在后期成模中,炎癥起到主要作用。PPE 灌注后通常分為兩個階段:第一階段0~7 d,特征性表現(xiàn)為中度主動脈擴(kuò)張和急性炎癥,涉及的細(xì)胞有內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和中性粒細(xì)胞;第二階段8~14 d,在第14 天左右形成動脈瘤,可以觀察到彈力纖維層斷裂、炎癥細(xì)胞入侵增加,以及T細(xì)胞和單核細(xì)胞的募集增加和局部基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加。14 d以后,瘤體發(fā)展逐漸趨于穩(wěn)定,進(jìn)入平臺期。本研究結(jié)果也顯示,PPE 模型很好地呈現(xiàn)了炎癥在AAA 進(jìn)展中的作用,該模型的瘤體在組織學(xué)上彈力纖維降解、炎癥細(xì)胞浸潤和平滑肌細(xì)胞凋亡消失都很典型,是研究炎癥和動脈瘤關(guān)系的理想模型。而AngⅡ模型則主要呈現(xiàn)的是在系統(tǒng)性高血壓和高脂血癥(炎癥狀態(tài))等誘因下,AAA 的進(jìn)展和成模情況。在組織學(xué)上,AngⅡ模型的彈力纖維降解、炎癥細(xì)胞浸潤和平滑肌細(xì)胞凋亡等表現(xiàn)不如PPE模型典型。人類動脈瘤的發(fā)生本質(zhì)上是機(jī)體系統(tǒng)性功能紊亂引起的局部發(fā)病,雖然AngⅡ模型在成瘤部位上和人類不盡相同,但也模擬了系統(tǒng)性的脂代謝紊亂和高血壓情況下動脈瘤發(fā)生的過程。AngⅡ模型在研究脂代謝紊亂和高血壓相關(guān)的動脈瘤,尤其是合并主動脈夾層的動脈瘤中,具有重要應(yīng)用價值。
PPE 模型制備過程中需要分離腹主動脈、穿刺血管、阻斷血流和局部動脈節(jié)段灌注,整個手術(shù)操作過程相對復(fù)雜,手術(shù)用時長。但PPE 方法成模效率高,不需要特殊耗材,成本相對較低。也有研究者提出了一種基于血管外膜彈性蛋白酶浸泡/涂抹PPE法誘導(dǎo)建立AAA,盡管此模型在技術(shù)簡便性方面顯示出優(yōu)勢,但造模后期存在自我修復(fù)現(xiàn)象,且血管直徑擴(kuò)張穩(wěn)定性不如腔內(nèi)輸注[14]。AngⅡ模型由于多在ApoE 或LDLR 敲除小鼠進(jìn)行,且需要微滲透壓泵輸注AngⅡ,造模成本相對較高,但其手術(shù)過程相對簡單,易于掌握。總之,兩種AAA 模型各有特色,可互為補(bǔ)充,研究人員可根據(jù)研究目的,在模型選擇上作出決定。
西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2022年3期