降植烷通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠巨噬細(xì)胞自噬

朱文華，韓 燕，寧 啟 蘭，張 富 軍，孟列素，呂 社 民

（1. 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)分子轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，陜西西安 710061；3. 環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，陜西西安 710061）

佐劑是疫苗的重要組成部分，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)劑和抗原傳遞載體的作用。它可以提高抗原的免疫原性，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，對于疫苗、藥物的研發(fā)具有重要意義[1]。已發(fā)現(xiàn)部分油脂如不完全弗氏佐劑、角鯊烯、礦物油及其組分具有佐劑性質(zhì)[2-3]，但由于其相對較高的細(xì)胞毒性、降解效率低等缺點，目前主要應(yīng)用于動物體內(nèi)。近年來，MF59 和AS03 這兩種含角鯊烯的油性佐劑成功應(yīng)用于人用流感病毒疫苗，尤其在H1N1 流感暴發(fā)時發(fā)揮了重要作用，使油性佐劑重新受到了免疫學(xué)家的關(guān)注[4-5]。大多數(shù)的油性佐劑都可在動物體內(nèi)誘發(fā)自身免疫病[3]，如不完全弗氏佐劑、角鯊烯、礦物油、降植烷（pristane）等在大鼠中具有致關(guān)節(jié)炎的能力，但原因不明[6-9]。雖然目前尚缺少致關(guān)節(jié)炎油劑與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）病因關(guān)系的流行病學(xué)調(diào)查，但這些油性佐劑的廣泛存在及其作為佐劑、關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)劑和免疫調(diào)節(jié)劑的有效作用，都提示其可能與RA 的發(fā)病密切相關(guān)。因此，揭示油性佐劑免疫增強(qiáng)作用的機(jī)制，不僅有助于了解其佐劑作用，而且有助于闡明關(guān)節(jié)炎等自身免疫病的發(fā)病機(jī)制。

自噬是細(xì)胞在外源、內(nèi)源刺激下維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式，也具有免疫調(diào)控作用。本課題組在降植烷誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)降植烷能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，通過自噬-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1（signal transducer and activator of transcription 1,STAT1）-Toll 樣受體3（toll-like receptor, TLR3）調(diào)控軸介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生發(fā)展[10-11]，然而，自噬誘導(dǎo)的具體機(jī)制仍不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)能量代謝途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等因素參與了自噬的誘導(dǎo)[12]。其中能量代謝的傳感分子腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可激活或抑制細(xì)胞自噬[13]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的真核起始因子2α（eIF2α）、肌醇依賴酶1α（IRE1α）等通路也同自噬的發(fā)生密切相關(guān)[14]。但仍然未知油性佐劑是否能影響這些通路從而調(diào)控自噬的發(fā)生。因此，本研究在降植烷刺激的大鼠巨噬細(xì)胞系中，探討能量代謝感應(yīng)器AMPK、mTOR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的調(diào)控情況及其在自噬誘導(dǎo)中的作用，以明確油性佐劑誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)的確切分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和降植烷刺激的模型構(gòu)建

大鼠巨噬細(xì)胞系NR8383 購自中科院上海細(xì)胞庫，用含150 mL/L 胎牛血清（HyClone）的F-12K 培養(yǎng)基（Sigma-Aldrich）培養(yǎng)。

降植烷刺激的巨噬細(xì)胞模型構(gòu)建：將細(xì)胞以2.5×105/mL 接種于6 孔板中，過夜使細(xì)胞貼壁，將降植烷（ACROS）與完全培養(yǎng)基以1∶1 的比例混合，并通過注射器反復(fù)抽吸以制備乳濁液，然后用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度（1 mmol/L），用新制的油乳劑代替培養(yǎng)基刺激細(xì)胞構(gòu)建模型。根據(jù)實驗需求于0、0.5、1、3、6 h各時間點收集細(xì)胞并抽提蛋白質(zhì)進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2 Western blotting 檢測降植烷刺激模型中能量代謝感應(yīng)器及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白表達(dá)

按照1.1 項構(gòu)建降植烷刺激的模型，分別于刺激后0、0.5、1、3 h 收集細(xì)胞，用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Roche）的RIPA 溶液（Beyotime）抽提總蛋白，采用BCA 試劑盒（Thermo Scientific）測定每個樣品的蛋白濃度。以每個樣本20 μg 總蛋白，按照Bio-Rad電泳系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。一抗分別包括兔抗p-AMPK 抗體（1∶1 000，CST，#2535），兔抗AMPK抗體（1∶1 000，CST，#2532），兔 抗p-mTOR 抗 體（1∶1 000，CST，#2971），兔 抗mTOR 抗體（1∶1 000，CST，#2972），兔抗p-IRE1α 抗體（1 μg/mL，Novus），兔抗-IRE1α 抗體（1 μg/mL，Abcam），兔抗p-eIF2α 抗體（1∶1 000，CST，#3398），兔抗eIF2α 抗體（1∶1 000，CST，#5324）和兔抗-β-肌動蛋白（β-actin）抗體（1∶1 000，CST，#4970），二抗為HRP 耦聯(lián)的羊抗兔IgG（0.4 μg/mL, Abcam）。

經(jīng)免疫印跡顯色試劑盒Supersignal?West Pico Kit（Thermo Scientific）曝光顯色后，采用化學(xué)發(fā)光成像儀（Syngene）照相并進(jìn)行條帶灰度掃描。采用凝膠成像分析軟件Syngene 獲得Western blotting 條帶的灰度值，將第一泳道（對照組）的灰度值設(shè)為1，其他泳道的相對表達(dá)值通過灰度值倍數(shù)計算獲得。

1.3 Western blotting 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞干預(yù)時自噬蛋白的表達(dá)

在降植烷乳液刺激細(xì)胞模型中，分別給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)劑二硫蘇糖醇（DTT，Sigma）（1、5 mmol/L）或抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA，Santa Cruz Biotech）（1、10、20 mmol/L）干預(yù)，作用6 h，收集細(xì)胞并按照1.2 項中Western blotting 方法檢測細(xì)胞mTOR 和自噬分子微管相關(guān)蛋白1-輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3）的表達(dá)。一抗分別包括兔抗mTOR 抗體（1∶1 000，CST，#2972）、兔抗LC3 抗體（1∶1 000，CST，#4108）和兔抗-β-actin 抗體（1∶1 000，CST，#4970）。

1.4 轉(zhuǎn)錄因子TFEB 表達(dá)與活化檢測

降植烷刺激的巨噬細(xì)胞模型經(jīng)降植烷乳液作用6 h，收集細(xì)胞并用Beyotime 核質(zhì)蛋白提取試劑盒分離胞質(zhì)蛋白和核蛋白，按照1.2 項中Western blotting方法檢測TFEB 在胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)，以反映TFEB 的入核情況；以Western blotting 檢測管家蛋白β-actin和層粘連蛋白A（Lamin A）的表達(dá)，以鑒定胞質(zhì)蛋白和核蛋白的純度。一抗分別包括兔抗TFEB 抗體（1∶1 000，CST，#8478）、兔抗-β-actin 抗體（1∶1 000，CST，#4970）、兔抗-Lamin A 抗體（5 μg/mL，BIOSS）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

細(xì)胞實驗重復(fù)3 次，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 進(jìn)行差異分析。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間均數(shù)比較使用One way-ANOVA 方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 降植烷刺激細(xì)胞模型中能量代謝感應(yīng)器及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白的表達(dá)情況

Western blotting 檢測降植烷刺激細(xì)胞的早期階段（0、0.5、1、3 h）時，能量代謝感應(yīng)器AMPK、mTOR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路eIF2α 和IRE1α 的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，降植烷刺激時，mTOR 表達(dá)顯示出下調(diào)趨勢，尤其在刺激后1、3 h 顯著下調(diào)（P＜0.05），這提示mTOR 是通過總量下調(diào)而非改變磷酸化比率發(fā)揮作用（圖1A、圖1B）。與之不同的是，AMPK 無論總量還是磷酸化水平都沒有明顯改變，提示其可能不受降植烷刺激的影響（圖1A）；降植烷刺激細(xì)胞0.5 h 時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路eIF2α 的磷酸化水平顯著增強(qiáng)（P＜0.05），在之后的1、3 h 迅速回落，IRE1α 的總量和磷酸化水平則無明顯改變（圖1A、圖1C）。這提示eIF2α 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路在降植烷刺激后瞬時激活，且這一過程早于mTOR 通路的改變，其可能通過抑制細(xì)胞mTOR 的水平而實現(xiàn)自噬增強(qiáng)。

圖1 降植烷刺激NR8383 細(xì)胞系不同時間點的能量代謝感應(yīng)器及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白檢測Fig. 1 Detection of energy metabolism sensors and ER stress pathways in NR8383 cell line stimulated by pristane at different time points

2.2 干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路對降植烷誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬的影響

NR8383 細(xì)胞單純給予1 mmol/L 降植烷刺激（模型細(xì)胞）時，mTOR 總量減少（P＜0.01），同時LC3-Ⅱ表達(dá)增高（即自噬增強(qiáng)，P＜0.001）；當(dāng)聯(lián)合降植烷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路抑制劑4-PBA 刺激時，細(xì)胞mTOR 表達(dá)回升而LC3-Ⅱ表達(dá)減弱，尤其在20 mmol/L 4-PBA 干預(yù)組，mTOR 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）而LC3-Ⅱ表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖2）。由此可見，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會抑制mTOR的減少，從而阻礙細(xì)胞的自噬增強(qiáng)現(xiàn)象。

與空白對照組（pristane、4-PBA 未刺激組）比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

NR8383 細(xì)胞單純給予1 mmol/L 降植烷刺激時，mTOR 總量減少（P＜0.01）同時LC3-Ⅱ表達(dá)增高（P＜0.05）；當(dāng)聯(lián)合降植烷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑DTT 刺激細(xì)胞時，LC3-Ⅱ表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，尤其在5 mmol/L DTT 干預(yù)組中LC3-Ⅱ表達(dá)較單純降植烷組顯著升高（P＜0.001，圖3）。在DTT 干預(yù)組并未出現(xiàn)mTOR 表達(dá)進(jìn)一步降低，這可能是因為降植烷刺激下mTOR 本身已維持較低表達(dá)。以上提示促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平，降植烷通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激降低細(xì)胞mTOR 水平，從而實現(xiàn)自噬增強(qiáng)。

圖3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑DTT 對降植烷刺激的NR8383 細(xì)胞系中mTOR 和自噬水平的影響Fig.3 Effect of ER stress inducer DTT on mTOR and autophagy in pristane stimulated NR8383 cell line

2.3 降植烷刺激的巨噬細(xì)胞中TFEB 的表達(dá)與活化情況

Western blotting 檢測降植烷刺激NR8383 細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白和核蛋白中的TFEB 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，胞質(zhì)蛋白表達(dá)β-actin 而不表達(dá)Lamin A，而核蛋白表達(dá)Lamin A 且未檢測到β-actin，提示核、質(zhì)蛋白分離較好、純度較高；在降植烷刺激下，TFEB 在胞質(zhì)蛋白和核蛋白中表達(dá)都明顯增強(qiáng)，尤其在核蛋白中；降植烷刺激組的TFEB 蛋白表達(dá)較對照組顯著升高（P＜0.01，圖4），提示降植烷刺激時TFEB 的表達(dá)升高且活化水平增強(qiáng)，可能參與了自噬相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，這一發(fā)現(xiàn)是對降植烷自噬增強(qiáng)機(jī)制的重要補(bǔ)充。

圖4 Western blotting 檢測降植烷刺激NR8383 細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子TFEB 的表達(dá)與活化Fig. 4 Translocation of transcriptional factor TFEB in pristane stimulated NR8383 cell line detcted by Western blotting

3 討 論

自噬通過清除、降解胞質(zhì)組分維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，是真核細(xì)胞處理內(nèi)部成分的過程。近年來已發(fā)現(xiàn)，自噬廣泛參與機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)控，其對天然免疫和獲得性免疫都有重要調(diào)控作用，具有效應(yīng)者和調(diào)控者雙重身份。目前已有眾多研究證實自噬參與RA的發(fā)病和發(fā)生發(fā)展過程。本課題組團(tuán)隊率先在RA患者滑膜組織中發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)的自噬現(xiàn)象，自噬抵抗了滑膜細(xì)胞的凋亡[15]；之后自噬在滑膜組織中的雙重作用被進(jìn)一步全面揭示，研究發(fā)現(xiàn)，自噬可促進(jìn)滑膜細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，并抑制蛋白酶體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[16]。除滑膜細(xì)胞以外，本課題組亦通過關(guān)節(jié)炎的動物模型研究了自噬在免疫細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)降植烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的自噬水平升高，增強(qiáng)的自噬通過STAT1-IRF1 通路介導(dǎo)了TLR3 的表達(dá)升高，在體干預(yù)時自噬或TLR3 都能顯著抑制疾病的嚴(yán)重程度[11]，這確證了自噬-TLR3 調(diào)控軸在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的重要作用，也通過自噬的誘導(dǎo)回答了油性佐劑的免疫增強(qiáng)機(jī)制，為理解油性佐劑的佐劑性和致關(guān)節(jié)炎性提供了理論和實驗基礎(chǔ)。然而，降植烷誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬增強(qiáng)的確切機(jī)制仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，降植烷可引起大鼠淋巴細(xì)胞膜流動性的改變[17]，推測其可能影響包括代謝轉(zhuǎn)運在內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。而能量代謝的傳感分子AMPK 和mTOR可與UNC-51樣激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)競爭性結(jié)合，激活或抑制細(xì)胞的自噬水平[13]。因此，本研究在降植烷刺激大鼠巨噬細(xì)胞的早期檢測了AMPK 和mTOR 通路的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，mTOR而非AMPK 受到了降植烷的調(diào)控，即mTOR 總量的降低實現(xiàn)了巨噬細(xì)胞自噬的增強(qiáng)。另外，也有報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)自噬發(fā)生[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)富含多種酶類，是外源物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)被催化的主要場所。降植烷在細(xì)胞內(nèi)將經(jīng)歷末端羥基化或末端氧化，然后通過經(jīng)典的β-氧化過程被徹底代謝。因此，推測巨噬細(xì)胞過度攝取降植烷可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng) 激。eIF2α 和IRE1α 通 路 是 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 應(yīng) 激 的 重 要 通路，已有研究報道它們可參與自噬調(diào)節(jié)[18-20]。本研究在降植烷刺激的細(xì)胞模型中也檢測了eIF2α 和IRE1α通路蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示eIF2α 在降植烷刺激后瞬時激活，且這個過程早于mTOR 的表達(dá)下調(diào)，提示降植烷誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而降低了mTOR 的表達(dá)，最終誘導(dǎo)自噬。這一猜測也進(jìn)一步通過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑和激動劑干預(yù)實驗得到了證實，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控mTOR 表達(dá)的機(jī)制仍有待深入解析。

此外，研究發(fā)現(xiàn)mTOR 除競爭性結(jié)合ULK1 干預(yù)自噬外，還可作用于轉(zhuǎn)錄因子TFEB，mTOR 失活使其活化并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，從而控制自噬體和溶酶體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[21]。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)，降植烷刺激的大鼠脾臟組織及巨噬細(xì)胞中自噬基因（如Becn1、LC3 等）的表達(dá)受到調(diào)控[11]。因此，本研究檢測了降植烷刺激的巨噬細(xì)胞模型中TFEB 的易位入核情況，發(fā)現(xiàn)其在刺激時表達(dá)增強(qiáng)，且活化增強(qiáng)。結(jié)果提示mTOR 有可能通過影響TFEB 的表達(dá)與活化調(diào)控了自噬的增強(qiáng)，但這仍需要進(jìn)一步實驗驗證。

綜上，本研究證實了降植烷為代表的油性佐劑通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制mTOR 的水平、活化轉(zhuǎn)錄因子TFEB，實現(xiàn)了巨噬細(xì)胞自噬增強(qiáng)。本研究明晰了油性佐劑的自噬增強(qiáng)機(jī)制，并對其致關(guān)節(jié)炎性和佐劑性的作用機(jī)制有了更全面的認(rèn)識。