循環(huán)Metrnl 與糖尿病心肌病的關(guān)系及相關(guān)分子機制

張 敏，丁瑞麟，江 鳳，彭 清，王小潔

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院1.心血管內(nèi)科，2.GCP，3.內(nèi)分泌科，四川 瀘州 646000）

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，2 型糖尿病已逐漸成為全球性、流行性疾病。據(jù)估計，到2030 年，全球糖尿病患者總?cè)藬?shù)預計將從2000 年的1.71 億上升至3.66 億，隨著糖尿病患者人數(shù)的增加，相關(guān)并發(fā)癥也將隨之增加［1］。心血管疾病是2 型糖尿病的主要并發(fā)癥及死因之一，糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是由糖尿病引起的一種獨特的心臟病，其標志之一是心肌糖脂代謝受損［2］。但發(fā)病機制尚不明確，有研究報道心肌能量代謝紊亂與核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族（PPARs）、葡萄糖共轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）通路有關(guān)［3］。

Metrnl 是新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，多項研究證明，Metrnl 可調(diào)節(jié)血糖、改善胰島素敏感性及脂質(zhì)代謝［4-6］。目 前 尚 缺 乏 關(guān) 于Metrnl 與DCM 相 關(guān) 的 研究，為此，本文基于Metrnl 在代謝性疾病中的重要作用，探討其與DCM、PPARs 和GLUT4 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

健 康 雄 性C57BJ/6L 小 鼠，SPF 級4 周 齡，15只，約16 g/只，購自北京華阜康生物公司［SYXK（川）2018-119］；所有操作遵循西南醫(yī)科大學動物實驗操作規(guī)范，實驗期間小鼠可自由取食和飲水。小鼠普通飼料購自成都達碩公司；60%高脂飼料購自深圳市拓普生物公司（D12492）；鏈脲佐菌素購自深圳百泰克公司（BS185-100 mg）；小鼠Metrnl ELISA試劑盒購自廣州康凱信生物（AD2238Mo）；重組Metrnl 購自AtaGenix 公司（AP73998）；DHE 染色試劑盒購自凱基生物；PPAR-δ 抗體由Abcam 公司提供；PPAR-α、GLUT4 抗體、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自ASPEN 公司；cDNA 合成試劑盒、PCR 反應試劑盒購自ELK Biotechnology。

1.2 方法

1.2.1 DCM 模型建立及血清Metrnl 濃度測定 15只健康雄性（C57BJ/6L）小鼠隨機分為實驗組（DCM+Metrnl，n=5）、模型組（DCM，n=5）和對照 組（Control，n=5）。 將 小 鼠 置 于（22±2）°C、（55±10）%濕度、12 h 明暗循環(huán)條件下適應1 周，實驗組和模型組用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）法建立DCM 模型，STZ 給藥后1 周，連續(xù)2 次檢測空腹血糖（FBG）大于11.1 mmol/L 視為糖尿病造模成功［4］。造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)16 周。取小鼠尾靜脈測定血清Metrnl 濃度，該過程嚴格按照Metrnl 商業(yè)試劑盒說明進行。

1.2.2 重組Metrnl 處理及血脂濃度測定 實驗組予以重組Metrnl（5 μg/只）干預，模型組及對照組給予等體積溶劑，連續(xù)干預7d。取小鼠內(nèi)眥靜脈血，嚴格按照生化試劑盒說明檢測各組小鼠血脂濃度。

1.2.3 H ＆ E、Masson、DHE 染色觀察心肌組織病理變化及活性氧產(chǎn)生情況 稱取小鼠體質(zhì)量并將其處死，迅速取出心臟，反復清洗，稱取心臟重量，取心室組織行常規(guī)固定并制作冰凍切片，H ＆ E、Masson 染色，普通光學顯微鏡下觀察。按照DHE試劑盒說明進行細胞內(nèi)活性氧檢測，最后于熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生情況。

1.2.4 Westrn-blot 檢 測PPAR- α、PPAR- β/δ 及GLUT4 表達情況 取適量心肌組織，經(jīng)研磨后加入細胞裂解液提取蛋白，利用BCA 法測定總蛋白濃度。制膠、上樣，SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)模至PVDF膜，4 ℃條 件 下，加 入 一 抗（PPAR-α、PPAR-β/δ、GLUT4 抗體）過夜，次日加入二抗于室溫孵育30 min；孵育后洗膜、曝光、顯影。使用AlphaEaseFC軟件對目的條帶灰度值進行分析。

1.2.5 PCR 檢測CD36、SOD基因表達 從心肌組織分離總RNA，并合成cDNA（EQ002）。PCR 反應程序如下：在95 ℃預變性1 min 激活酶后，進行40次PCR 循環(huán)（95 ℃條件下變性15 s，58 ℃條件下退火20 s，72 ℃條件下延伸45 s），最后在60 ℃條件下延長，每20 秒升溫1 ℃，直至溫度上升至95 ℃。引物參數(shù)詳見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。經(jīng)檢驗，所有計量資料符合正態(tài)分布，用±s 表示，多組間比較用單因素方差分析比較，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠攝食量、體重、血糖及心臟/體重比值變化

高脂飲食喂養(yǎng)8 周后，實驗組和模型組體質(zhì)量較對照組顯著增加（tDCM+Metrnl=4.04，P＜0.05；tDCM=3.828，P＜0.05）。造 模 成 功 后，DCM+Metrnl 和DCM 組小鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿，活動量明顯減少。與對照組相比，DCM+Metrnl 和DCM 組血糖顯著升高（tDCM+Metrnl=10.862，P＜0.05；tDCM=7.698，P＜0.05）。DCM 組、DCM+Metrnl 組和對 照組的心體質(zhì)量比無顯著差異（F=3.743，P=0.078）（表2），DCM+Metrnl 組給予重組Metrnl 后血糖降低，但和給藥前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.002，P＞0.05）。

表2 各組小鼠體重、血糖及心臟/體重比值變化（±s）Tab 2 Changes of body weight，blood glucose and heart/body weight ratio in each group（±s）

表2 各組小鼠體重、血糖及心臟/體重比值變化（±s）Tab 2 Changes of body weight，blood glucose and heart/body weight ratio in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。心體質(zhì)量比Metrnl+DCM 中n=4，Control 和DCM 組n=3，心臟取材時損毀；余如表所示。

組別造模后心體質(zhì)量比干預后血糖（mmol/L）20.86±7.33 5.10±0.65 21.26±1.24實驗組對照組模型組n5 5 5造模后血糖（mmol/L）22.98±3.37*5.92±1.00 24.42±5.28*造模后體重（g）26.14±0.52*23.88±1.14 26.24±0.78*4.18±0.16 4.80±0.51 4.38±0.12

2.2 各組小鼠血清Metrnl 濃度變化

重組Metrnl 干預前，與對照組相比，模型組小鼠血液中Metrnl 濃度降低，實驗組小鼠血液中Metrnl 濃度升高，實驗組小鼠血液中Metrnl 濃度較模型組升高，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 各組干預后血清Metrnl 濃度比較Fig 1 Comparison of serum concentration of Metrnl in the three groups

2.3 各組小鼠血脂變化

與對照組相比，模型組血清總膽固醇（t=5.378，P=0.006）、甘油三酯（t=9.376，P＜0.001）、低密度脂蛋白膽固醇（t=13.738，P＜0.001）顯著升高，高密度脂蛋白膽固醇（t=4.786，P=0.009）顯著降低。與模型組比較，實驗組血清總膽固醇（t=-3.67，P=0.014）、甘油三酯（t=-6.827，P＜0.001）和低密度脂蛋白膽固醇（t=-7.969，P＜0.001）濃度降低，高密度脂蛋白膽固醇（t=3.565，P=0.016）濃度升高，差異均有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，實驗組的高密度脂蛋白膽固醇降低（t=-2.229，P=0.076），甘油三酯（t=2.028，P=0.098）、低密度脂蛋白膽固醇（t=2.446，P=0.058）和總膽固醇（t=2.577，P=0.05）均升高，但差異無統(tǒng)計學意義（表3）。

表3 各組小鼠血脂變化（mmol/L，±s）Tab 3 Blood lipid changes in each group（mmol/L，±s）

表3 各組小鼠血脂變化（mmol/L，±s）Tab 3 Blood lipid changes in each group（mmol/L，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別實驗組對照組模型組高密度脂蛋白膽固醇1.28±0.13△1.50±0.13 0.83±0.21*n4 3 3總膽固醇1.51±0.15△*1.20±0.17 1.94±0.16*甘油三脂2.20±0.32△1.18±0.08 4.075±0.41*低密度脂蛋白膽固醇1.66±0.35△1.14±0.10 3.70±0.31*

2.4 各組小鼠心肌組織病理改變及活性氧（ROS）產(chǎn)生情況

對照組心肌纖維排列整齊，細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞核均一；模型組心肌纖維排列紊亂、稀疏，心肌細胞肥大變性，細胞核大小不一，心肌間藍染的膠原纖維增加；實驗組心肌細胞肥大及膠原排列紊亂得到改善，心肌間藍染的膠原纖維較少。紅色熒光為細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生量。與對照組相比，實驗組與模型組心肌細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生量增加；與模型組相比，實驗組心肌細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生量較少（圖2）。

圖2 各組小鼠心肌組織病理改變及活性氧產(chǎn)生情況（×400）Fig 2 Pathological changes of myocardial tissue and production of reactive oxygen species in each group（×400）

2.5 各組小鼠PPAR-α、PPAR-β/δ、GLUT4 蛋白表達情況

與對照組相比，模型組PPAR-α（t=5.255，P=0.006）、PPAR-β/δ（t=3.915，P=0.017）、GLUT4（t=-9.374，P＜0.001）蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。實驗組PPAR-α（t=2.858，P=0.046）、PPAR- β/δ（t=2.796，P=0.049）和GLUT4（t=3.148，P=0.035）蛋白表達量均高于模型組（P＜0.05）（表4）。與對照組相比，實驗組PPAR-α（t=3.424，P=0.027）、PPAR-β/δ（t=1.72，P=0.161）、GLUT4（t=3.681，P＜0.021）蛋白表達降低。

表4 各組小鼠PPAR-α、PPAR-β/δ、GLUT4 蛋白表達相對量（±s）Tab 4 Relative expression levels of PPAR-α，PPAR-β/δ and GLUT4 in each group（±s）

表4 各組小鼠PPAR-α、PPAR-β/δ、GLUT4 蛋白表達相對量（±s）Tab 4 Relative expression levels of PPAR-α，PPAR-β/δ and GLUT4 in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別實驗組對照組模型組GLUT4 0.35±0.13△*0.69±0.10 0.09±0.06*n3 3 3 PPAR-α 0.28±0.06△*0.53±0.11 0.12±0.07*PPAR-β/δ 0.28±0.12△0.50±0.18 0.09±0.02*

2.6 各組小鼠CD36、SOD 基因表達情況

與對照組相比，模型組心肌細胞中CD36表達升高（t=20.496，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學意義；CD36表達在實驗組降低，但差異無統(tǒng)計學意義（t=0.357，P=0.739）；與模型組相比，實驗組心肌細胞中CD36表達降低（t=17.808，P＜0.001）。與對照組相比，模型組心肌細胞中SOD表達降低（t=16.48，P＜0.001），在實驗組升高（t=-16.076，P＜0.001）；實驗組心肌細胞中SOD表達高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（t=21.42，P＜0.001）（表5）。

表5 各組小鼠CD36、SOD 基因表達（±s）Tab 5 Expression of CD36 and SOD gene in each group（±s）

表5 各組小鼠CD36、SOD 基因表達（±s）Tab 5 Expression of CD36 and SOD gene in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別實驗組對照組模型組SOD 2.58±0.16△*1.00±0.04 0.05±0.35*n3 3 3 CD36 1.02±0.15△1.06±0.10 3.33±0.17*

3 討論

DCM 已成為全球性流行性疾病，目前尚缺乏特定治療方法。越來越多的研究關(guān)注新型靶向抗氧化途徑，以期為DCM 治療找到新的方法。

Metrnl 是新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，在人和嚙齒動物多器官組織中表達（包括皮下脂肪組織、骨骼肌、心肌、胃腸道等），具有促進白色脂肪組織褐變、增加機體能量消耗、胰島素增敏、拮抗炎癥等作用［5-8］。外界給藥（靜脈注射或口服）可降低肥胖小鼠的體重、血糖水平改善胰島素抵抗［5］；在非肥胖小鼠中，Metrnl 可 延 緩 糖 尿 病 的 發(fā) 生［9］；組 織 特 異 性 敲 除Metrnl 后，將加重由高脂飲食誘導的胰島素抵抗，補充Metrnl 則可完全改善胰島素抵抗［10］。因此，Metrnl 在代謝性疾病的治療中具有廣闊前景。目前，Metrnl 在血清中的濃度變化尚存在爭議。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病小鼠與正常小鼠血清中Metrnl 濃度無顯著差異。這與近期發(fā)表的薈萃分析［11］結(jié)果一致。重組Metrnl 給藥后，實驗組血清低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、甘油三脂濃度較模型組降低，血清HDL-C 濃度較DCM 組升高，提示Metrnl 能改善小鼠血脂代謝。此外，給藥重組Metrnl 后，實驗組組小鼠心肌細胞紊亂、稀疏和細胞肥大得到明顯改善，心肌間膠原纖維明顯減少。Metrnl 對DCM 具有有益作用。

健康的心臟由70%脂肪酸和30%葡萄糖提供能量［12］。高糖等條件下，心肌能量底物幾乎由葡萄糖及脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅?，心肌細胞?nèi)產(chǎn)生更多活性氧，最終導致心肌細胞凋亡及脂質(zhì)積累［12-14］。PPARs 為核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族，包括3 個亞型，分別為PPAR-α、PPAR-β/δ、PPAR-γ，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［15］。PPARs、GLUT4 是心肌攝取及利用脂質(zhì)及葡萄糖的重要信號通路。Metrnl可通過調(diào)節(jié)PPAR-γ、GLUT4 等改善脂肪細胞功能及骨骼肌攝取葡萄糖的能力，從而改善機體胰島素敏感性［10，16，17］。此外，Metrnl 還可調(diào)節(jié)PPAR-δ 改善骨骼肌炎癥，提高骨骼肌葡萄糖耐量［18］。本研究證明Metrnl 可上調(diào)GLUT4、PPAR-β/δ，同時下調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運因子CD36基因表達，對心肌糖脂代謝進行調(diào)控。且給藥后的心肌細胞排列紊亂、稀疏及細胞肥大得到改善，心肌細胞間膠原纖維減少。因此，Metrnl 可能對心肌能量代謝有積極作用。

研究報道，PPAR-α 高表達的心肌表型與糖尿病心肌病極為相似，且PPAR-α 在糖尿病心肌病心肌中表達上調(diào)［19］。PPAR-α 是心肌攝取利用脂肪酸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可能參與抑制心肌GLUT4 的表達，而GLUT4 是葡萄糖進入心肌細胞的主要運輸工具［19］。本研究中，DCM 組心肌細胞中PPAR-α 表達降低，給藥重組Metrnl 后，實驗組PPAR-α 表達水平較模型組升高，而其表達水平低于對照組。由于PPAR-α 在心肌中的表達是一把“雙刃劍”，其高表達或低表達對心肌均有不利影響。由此可見，Metrnl 在一定程度上可維持PPAR-α 的表達平衡。Ruperez 等［20］指 出，Metrnl 受PPAR-α 調(diào) 控（可 上 調(diào)Metrnl 表達），且在其調(diào)控下，Metrnl 可誘導脂肪酸氧化、選擇性激活M2 巨噬細胞的基因程序，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。與DCM 組相比，DCM+Metrnl 組心肌細胞PPAR-α 表達增加，但較對照組降低，表明Metrnl與PPAR-α 之間可能存在某種反饋調(diào)節(jié)機制，有待進一步研究驗證。

能量底物的改變，可導致心肌細胞中活性氧（ROS）增多，導致更多的細胞凋亡。有研究證明，在心肌中，PPAR-β/δ 對糖及脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用與PPAR-α 相反，可能成為改善心肌能量代謝的靶點［3］。 Metrnl 可 調(diào) 節(jié) 心 肌 能 量 底 物 調(diào) 控 蛋 白（PPAR-β/δ、GLUT4）及相關(guān)基因（CD36）的表達，同時上調(diào)抗氧化蛋白SOD（包括SOD2，主要位于線粒體內(nèi)膜，具有高效去除活性氧的能力）、CAT 抗氧化酶，抑制活性氧產(chǎn)生［7］。本研究進一步佐證了該結(jié)論，給藥重組Metrnl 后，心肌中GLUT4、PPAR-δ 表 達 上 調(diào)，細 胞 內(nèi)ROS 明 顯 減 少，SOD 蛋白基因表達增加。因此，Metrnl 可減輕心肌氧化應激損傷，對心肌具有雙重保護作用。

由于DCM 模型的特殊性以及受實驗條件等限制，本實驗樣本量相對較少，且尚未對小鼠心功能參數(shù)進行測定，未進一步評估Metrnl 對DCM 小鼠心功能的影響；此外未進行體外研究證實Metrnl 對PPAR-α、GLUT4、PPAR-β/δ 具有 靶向調(diào)控 作用，這需在今后的研究中進行探討。

總之，Metrnl 可以改善糖尿病心肌病小鼠的心肌病理改變及脂質(zhì)代謝。通過PPAR-β/δ、GLUT4通路降低心肌氧化應激損傷。Metrnl 與PPAR-α 之間是否存在反饋調(diào)節(jié)機制，需在今后的研究中加以驗證。

作者貢獻度說明：

張敏：參與課題設計、實驗動物飼養(yǎng)、相關(guān)指標檢測及論文寫作；丁瑞麟：參與課題設計指導，文章修改；江鳳：參與課題設計，文章審校；彭清：參與課題設計及文章審校；王小潔：參與文章修改。