高效液相色譜中溶劑效應(yīng)的探討及消除方法*

安 琪，孫 紅，武林芝，劉亮亮，陳素娥

(山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，山西生物樣品分析檢測(cè)中心，山西 晉中 030619)

高效液相色譜是藥物分析中最常用的定性和定量分析手段。在分析的過(guò)程中，色譜工作者通常進(jìn)行流動(dòng)相優(yōu)化和色譜柱篩選以獲得良好的峰形和較高的分離度，而常常忽略了溶解樣品所用溶劑(簡(jiǎn)稱溶樣溶劑)的重要性。如果溶樣溶劑選擇不合適容易造成“溶劑效應(yīng)”，即溶樣溶劑與流動(dòng)相比例存在差異時(shí)會(huì)導(dǎo)致色譜保留行為異常，如在反相高效液相色譜中，尤其是前者的洗脫強(qiáng)度較強(qiáng)時(shí)，極易引起目標(biāo)物保留時(shí)間漂移、色譜峰展寬、分叉甚至峰穿透等現(xiàn)象[1]。文獻(xiàn)報(bào)道避免溶劑效應(yīng)通用準(zhǔn)則是使用流動(dòng)相或是與流動(dòng)相組成匹配的溶劑作為溶樣溶劑[2-5]。但是在實(shí)際中，考慮到樣品的溶解性、化學(xué)穩(wěn)定性及實(shí)際操作的可行性，通用準(zhǔn)則實(shí)用性存在一定的局限性。

文章選取了筆者在檢測(cè)工作中遇到的三個(gè)具有代表性的案例，初步探討了溶樣溶劑對(duì)色譜行為的影響并分析其產(chǎn)生的原因，同時(shí)提出了判斷和消除溶劑效應(yīng)的方法，以期為高效液相色譜方法建立提供新的分析視角。

1 溶劑效應(yīng)對(duì)色譜峰峰形影響的案例

1.1 儀器和試藥

儀器：Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；LK/CSJ-30超聲波清洗機(jī)，成都老肯科技股份有限公司；XPE105電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Fresco 21高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司。

試劑：甲醇(色譜級(jí))、乙腈(色譜級(jí))和磷酸(色譜級(jí))，天津市大茂化學(xué)試劑廠；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

藥材：黨參藥材(批號(hào)2020102601，產(chǎn)地山西省平順縣)，山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院楊翠玲副教授鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.干燥根，藥材粉碎，待用。

對(duì)照品：5-羥甲基糠醛(批號(hào)為G1032933，純度為94.6%)，天津諾爾醫(yī)藥技術(shù)有限公司；紫丁香苷(批號(hào)1506569，純度為99.12%)，伊普賽諾科技(天津)有限公司；黨參苷Ⅰ(純度≥98%，批號(hào)CHB180123)，成都克洛瑪生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 案例一

色譜條件：色譜柱Waters XSelect HSS T3(4.6 mm× 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水，5%乙腈等度洗脫，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，流速1 mL/min，采用190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

1.2.2 案例二

色譜條件：色譜柱Waters XSelect HSS T3(4.6 mm× 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%～10%B；20～60 min，10%～25%B；60～61 min，25%～90%B；61～65 min，90%B)，柱溫 35 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

1.2.3 案例三

色譜條件：色譜柱Waters XSelect HSS T3(4.6 mm× 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%～10%B；20～45 min，10%～20%B；45～46 min，20%～90%B；46～50 min，90%B)，柱溫 30 ℃，流速1 mL/min，采用紫外(190～400 nm)全波長(zhǎng)掃描，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

1.3 樣品制備

1.3.1 案例一

樣品溶液的制備：精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，甲醇溶解，配制成1 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，采用不同濃度乙腈水溶液(100%、80%、50%、20%和5%)稀釋得5 μg/mL的樣品溶液。

1.3.1 案例二

樣品溶液的制備：取黨參藥材(過(guò)3號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，振搖混勻，稱定重量，進(jìn)行超聲提取30 min，超聲完成取出，待錐形瓶溫度接近室溫，稱重并補(bǔ)足差額重量，過(guò)濾，精密量取15 mL濾液，水浴蒸干，甲醇復(fù)溶至5 mL容量瓶得到樣品溶液。

1.3.1 案例三

樣品溶液的制備：精密稱取紫丁香苷和黨參苷Ⅰ對(duì)照品適量，甲醇溶解，配制成濃度分別為250 μg/mL、2 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，50%甲醇稀釋得到50 μg/mL紫丁香苷和黨參苷Ⅰ混合對(duì)照品溶液，即樣品溶液。

1.4 結(jié)果分析

1.4.1 案例一

從色譜圖(圖1)中可以看出，隨著溶樣溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)的降低(100%乙腈、80%乙腈、50%乙腈、20%乙腈和5%乙腈)，5-羥甲基糠醛的峰形逐漸改善，其中100%乙腈、80%乙腈、50%乙腈和20%乙腈作為溶樣溶劑色譜峰出現(xiàn)保留時(shí)間提前，峰展寬或峰前沿，均呈現(xiàn)不同程度的溶劑效應(yīng)，當(dāng)采用起始流動(dòng)相比例5%乙腈溶解樣品時(shí)，5-羥甲基糠醛峰形對(duì)稱。對(duì)比前沿峰和對(duì)照峰的紫外吸收?qǐng)D譜(190～400 nm)(圖2)，可知100%乙腈溶樣溶劑中5-羥甲基糠醛前沿峰(取色譜峰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)7.557 min和7.997 min)與5-羥甲基糠醛對(duì)照色譜峰(保留時(shí)間8.009 min)的紫外吸收?qǐng)D譜完全吻合，佐證前沿峰與5-羥甲基糠醛是同一物質(zhì)，提示強(qiáng)溶劑效應(yīng)導(dǎo)致了5-羥甲基糠醛出現(xiàn)峰扭曲變形，引起溶劑效應(yīng)，選擇使用流動(dòng)相溶解樣品可以避免溶劑效應(yīng)。

圖1 5-羥甲基糠醛在不同溶劑強(qiáng)度稀釋液下色譜圖

圖2 100%乙腈稀釋液中5-羥甲基糠醛前沿峰與對(duì)照色譜峰的紫外吸收?qǐng)D譜對(duì)比圖

1.4.2 案例二

這是黨參指紋圖譜研究案例，實(shí)驗(yàn)中考慮盡可能多目標(biāo)物提取及各目標(biāo)物的提取效率，采用甲醇作為提取溶劑，由于目標(biāo)物溶解性的原因，依舊采用甲醇作為復(fù)溶溶劑。當(dāng)進(jìn)樣體積為100 μL，呈現(xiàn)出較早洗脫的峰(40 min前)出現(xiàn)前沿，較晚洗脫的峰(40 min后)峰形影響程度小或者不受影響的現(xiàn)象(圖3)，進(jìn)樣體積降低至為5 μL，所有色譜峰均獲得良好峰形，可見(jiàn)溶劑效應(yīng)會(huì)受到進(jìn)樣體積的影響，在梯度洗脫模式下尤其保留弱的化合物，它的洗脫強(qiáng)度與初始比例流動(dòng)相越接近，越容易受溶劑效應(yīng)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用強(qiáng)溶劑溶解樣品可通過(guò)選擇小體積進(jìn)樣消除溶劑效應(yīng)。

1.4.3 案例三

這是紫丁香苷和黨參苷Ⅰ含量測(cè)定的案例，采用50%甲醇作為稀釋溶劑，從色譜圖(圖4)中可以看出，當(dāng)進(jìn)樣體積為100 μL，紫丁香苷和黨參苷Ⅰ保留時(shí)間提前，均出現(xiàn)峰裂分和峰前沿現(xiàn)象，當(dāng)進(jìn)樣體積降至10 μL，色譜峰峰形明顯改善，均獲得單一良好峰形。對(duì)比裂分峰、前沿峰與對(duì)照峰的紫外吸收?qǐng)D譜(190～400 nm)(圖5和圖6)，可知裂分峰(紫丁香苷保留時(shí)間15.440 min、黨參苷Ⅰ保留時(shí)間35.427 min)、前沿峰(紫丁香苷保留時(shí)間23.387 min、黨參苷Ⅰ保留時(shí)間39.200 min)和與對(duì)照峰(紫丁香苷保留時(shí)間24.324 min、黨參苷Ⅰ保留時(shí)間39.870 min)紫外吸收?qǐng)D譜完全吻合，推測(cè)與對(duì)照品為同一物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)采用起始流動(dòng)相接近溶液5%甲醇稀釋紫丁香苷和黨參苷Ⅰ，即使增大進(jìn)樣體積仍能獲得較好的單一峰形。由此可見(jiàn)，溶劑效應(yīng)會(huì)受到進(jìn)樣體積和溶劑強(qiáng)度的綜合影響。實(shí)驗(yàn)中為了兼顧所有測(cè)定目標(biāo)物的溶解度和靈敏度，方法建立的時(shí)候需要對(duì)進(jìn)樣體積和溶劑強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 50%甲醇作為稀釋溶劑不同進(jìn)樣體積下紫丁香苷和黨參苷Ⅰ色譜圖

圖5 紫丁香苷裂分峰、前沿峰與對(duì)照峰的紫外吸收?qǐng)D譜對(duì)比圖

圖6 黨參苷Ⅰ裂分峰、前沿峰與對(duì)照品的紫外吸收?qǐng)D譜對(duì)比圖

2 討 論

2.1 溶劑效應(yīng)的影響因素和消除方法

2.1.1 溶劑強(qiáng)度

在反相色譜系統(tǒng)中溶劑強(qiáng)度的順序?yàn)樗?最弱)<甲醇<乙腈。當(dāng)溶樣溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相強(qiáng)度，一部分樣品溶解于溶劑中會(huì)被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動(dòng)相，被流動(dòng)相洗脫出，在經(jīng)過(guò)檢測(cè)器，形成色譜峰的展寬或者分叉，同一目標(biāo)物給出了兩個(gè)色譜峰，其中進(jìn)柱前即擴(kuò)散進(jìn)入流動(dòng)相的那部分目標(biāo)物組成了后面的色譜峰，它的保留時(shí)間與目標(biāo)物的真實(shí)保留時(shí)間基本吻合，處于溶劑范圍的那部分目標(biāo)物保留時(shí)間提前，樣品在柱前的不充分?jǐn)U散導(dǎo)致了峰前沿，嚴(yán)重會(huì)出現(xiàn)峰穿透現(xiàn)象，降低柱效，影響分離度。相反，而當(dāng)溶樣溶劑強(qiáng)度小于流動(dòng)相強(qiáng)度，則保留時(shí)間延后，但延后幅度較小，即使發(fā)生裂分，前后兩峰均能保持良好峰形。

針對(duì)溶劑強(qiáng)度造成溶劑效應(yīng)的現(xiàn)象，結(jié)合上述案例可以嘗試采取以下的消除辦法：在不影響目標(biāo)物溶解性的情況下，盡量用流動(dòng)相或者與流動(dòng)相接近的溶劑作為樣品溶劑；為了滿足多目標(biāo)物的提取或溶解度，必須使用強(qiáng)洗脫溶劑時(shí)，比如天然產(chǎn)物分析，在不影響靈敏度的情況下降低進(jìn)樣體積；如果無(wú)法更改溶劑強(qiáng)度或者降低進(jìn)樣體積，可以采用梯度洗脫模式，降低起始流動(dòng)相比例避免溶劑效應(yīng)，因?yàn)槌跏急壤鲃?dòng)相無(wú)法洗脫目標(biāo)物，而且強(qiáng)洗脫溶劑也無(wú)法讓目標(biāo)物快速移動(dòng)，它們會(huì)富集在柱頭，等流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度提高到一定程度，化合物才會(huì)逐漸被洗脫；另外反相條件可以嘗試HILIC色譜柱，該色譜柱使用的溶劑系統(tǒng)的順序?yàn)橐译?最弱)<甲醇<水，與反相色譜系統(tǒng)中溶劑強(qiáng)度的順序剛好相反，反相強(qiáng)溶樣溶劑與HILIC色譜柱流動(dòng)相比例接近或稍弱，不會(huì)引起溶劑效應(yīng)。

2.1.2 進(jìn)樣體積

進(jìn)樣體積造成的溶劑效應(yīng)一般與溶劑種類(lèi)有關(guān)。流動(dòng)相作為溶劑時(shí)，增加進(jìn)樣體積后，目標(biāo)分析物色譜峰不會(huì)發(fā)生遷移，保留時(shí)間基本穩(wěn)定。使用強(qiáng)度大于流動(dòng)相強(qiáng)度的溶劑，增加進(jìn)樣體積后，目標(biāo)分析物色譜峰會(huì)向前遷移，直至裂分，峰高降低且峰展寬。對(duì)于粒徑為5 μm或更小粒徑的色譜柱，為了獲得最優(yōu)的峰形，推薦進(jìn)樣體積不大于10 μL。實(shí)際情況為了提高靈敏度比如痕量物質(zhì)的定量，經(jīng)常會(huì)優(yōu)化進(jìn)樣體積，采用20 μL、50 μL甚至100 μL。上述案例分析表明，進(jìn)樣體積較大時(shí)強(qiáng)溶劑影響更為明顯，因此實(shí)驗(yàn)中盡量選擇流動(dòng)相作為稀釋劑。若無(wú)法使用流動(dòng)相作稀釋劑，需要通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化溶劑效應(yīng)的進(jìn)樣體積臨界值，避免溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的峰型異常。

2.1.3 溶劑組成

溶劑pH值、離子強(qiáng)度和流動(dòng)相不兼容同樣會(huì)引起溶劑效應(yīng)，影響經(jīng)常表現(xiàn)為保留時(shí)間的漂移而不是多個(gè)峰或者峰分叉等峰形差現(xiàn)象。易于解離的化合物對(duì)流動(dòng)相的pH值較敏感，化合物處于解離狀態(tài)下極性發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致保留行為發(fā)生較大變化。原則上采用跟流動(dòng)相匹配的溶劑pH值、離子強(qiáng)度的溶樣溶劑，對(duì)于堿性化合物選擇堿性流動(dòng)相分離的方法，升高進(jìn)樣溶液pH，對(duì)于酸性化合物則相反，避免目標(biāo)物處于解離狀態(tài)。

2.1.4 其他因素

柱前管路對(duì)溶劑效應(yīng)也有一定的影響，內(nèi)徑越大、管路越長(zhǎng)，越利于目標(biāo)物向流動(dòng)相擴(kuò)散，而且使用更粗的管路比更長(zhǎng)的管路有效。雖然粗的管路會(huì)造成柱外展寬，降低柱效。也可以采用進(jìn)樣前預(yù)混合將目標(biāo)物擴(kuò)散至流動(dòng)相中，降低溶劑效應(yīng)對(duì)峰形的危害。

2.2 溶劑效應(yīng)的判斷方法

溶劑效應(yīng)中的峰裂分有兩個(gè)特點(diǎn)，裂分峰在正常色譜峰的前面，而且出峰越早的化合物裂分越明顯，出峰晚的化合物甚至不會(huì)受影響。當(dāng)出現(xiàn)色譜峰異常時(shí)，比如色譜峰前沿、峰裂分等現(xiàn)象，可采用UV全波長(zhǎng)掃描查看前沿峰、裂分峰紫外吸收情況進(jìn)行單一成分純度判斷，或者降低進(jìn)樣體積(甚至直接降低至0.1 μL)，觀察色譜峰峰型是否改善。若峰型有效改善基本就可以斷定為溶劑效應(yīng)。當(dāng)然，以下情況也會(huì)出現(xiàn)溶劑效應(yīng)類(lèi)似的現(xiàn)象：(1)進(jìn)樣過(guò)載會(huì)造成峰前伸，但是過(guò)載與樣品的紫外吸收性質(zhì)相關(guān)，跟樣品出峰順序無(wú)關(guān)。如果目標(biāo)物紫外吸收很弱，雖然峰面積很小，也可能會(huì)過(guò)載；(2)色譜柱污染塌陷會(huì)造成峰前伸，色譜柱損壞(如篩板堵塞)導(dǎo)致峰裂分，色譜柱故障會(huì)波及到所有色譜峰，所有色譜峰均會(huì)出現(xiàn)峰前伸或裂分且裂分峰在后面；(3)性質(zhì)相似結(jié)構(gòu)相近的組分沒(méi)有完全分離也會(huì)造成峰前沿，這是由于色譜峰沒(méi)有完全分離引起的，可以通過(guò)紫外吸收光譜、質(zhì)譜質(zhì)荷比等分析手段來(lái)判定是否為同一物質(zhì)。

3 結(jié) 論

在高效液相色譜定性定量過(guò)程中，選擇使用流動(dòng)相或者是與流動(dòng)相相接近的溶劑溶解樣品可以避免溶劑效應(yīng)，確保峰形良好，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。但是在實(shí)際分析中，我們需要確保樣品在溶劑中的溶解性和穩(wěn)定性，當(dāng)樣品難溶于流動(dòng)相，需要使用替換溶劑溶解樣品時(shí)，為了避免溶劑效應(yīng)，可以選擇在不影響靈敏度的情況下小體積進(jìn)樣；或者用強(qiáng)溶劑溶解樣品后再用流動(dòng)相稀釋樣品，然后加大進(jìn)樣體積來(lái)實(shí)現(xiàn)；或者可以更換HILIC色譜柱。如果上述方法不可行，比如對(duì)于某些保留弱的化合物可以采用梯度洗脫的方法，降低起始流動(dòng)相比例，降低強(qiáng)溶解溶劑的影響，雖然可能目標(biāo)化合物保留時(shí)間延后，但是能夠獲得理想峰形，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。