基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探討香葉木素治療高尿酸血癥腎病的分子機(jī)制

雷歡，鄧琴，劉子源，張維，徐凌云

武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430023

高尿酸血癥腎病（HN）是高尿酸血癥的常見并發(fā)癥，主要病因?yàn)槟蛩嵘蛇^多或尿酸排泄障礙導(dǎo)致的腎臟急、慢性損傷。目前臨床治療HN 主要采用減少尿酸生成、促進(jìn)尿酸排泄的化學(xué)藥物，如別嘌醇、苯溴馬隆等，但這類藥物長期使用會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的肝腎毒性［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有作用范圍廣、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，在機(jī)體多種疾病中均具有顯著療效［2］。近年來，關(guān)于中醫(yī)藥在HN 中的作用已成為研究熱點(diǎn)。有研究顯示，菊花在治療腎臟疾病中具有較好的療效［3］。香葉木素是中藥菊花中的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用［4］。我們的前期研究結(jié)果表明，香葉木素在體外競爭性抑制黃嘌呤氧化酶活性，是潛在的降尿酸藥物［5］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)、分子生物學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科知識(shí)，對(duì)傳統(tǒng)中藥成分的潛在靶點(diǎn)、藥理作用等進(jìn)行系統(tǒng)研究，為研究中醫(yī)藥在疾病中的作用提供新方法；分子對(duì)接是通過計(jì)算機(jī)技術(shù)探索受體與藥物分子之間的相互作用方式并預(yù)測其結(jié)合模式和親和力的一種理論模擬方法。2021年9 月—12 月，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，探討香葉木素治療HN 的靶點(diǎn)及通路，為闡明香葉木素治療HN的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 香葉木素類的成藥性評(píng)價(jià)及作用靶點(diǎn)獲取 香葉木素結(jié)構(gòu)信息來自NCBI Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲得香葉木素的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）等數(shù)據(jù)，篩選標(biāo)準(zhǔn)包括口服生物利用度（OB）、藥物相似性（DL）、血腦屏障（BBB）。通過TargetNet數(shù)據(jù)庫（http：//targetnet. scbdd. com）中的“Lipinski 五規(guī)則”對(duì)香葉木素的成藥性進(jìn)行評(píng)分。通過ChEMBL（https：//www. ebi. ac. uk/chembl/）檢索香葉木素作用靶點(diǎn)，基于SwissTargetPrediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測香葉木素潛在作用靶點(diǎn)基因。刪除重復(fù)靶點(diǎn)基因，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot. org/）將剩余靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白轉(zhuǎn)換成種屬為智人的基因，得到香葉木素最終的作用靶點(diǎn)基因。

1.2 HN 疾病靶點(diǎn)檢索 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www. genecards. org/）、DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www. disgenet. org/）中，以“Hyperuricemia nephropathy”為關(guān)鍵詞進(jìn)行人類基因檢索，獲取HN的疾病靶點(diǎn)基因；去除兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲取的重復(fù)靶點(diǎn)，從而獲得最終的疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 香葉木素與HN 共有靶點(diǎn)基因的篩選 將“1.1”和“1.2”中獲取的香葉木素靶點(diǎn)基因與HN 疾病靶點(diǎn)基因?qū)隫enny2.1 在線作圖工具繪制韋恩圖，獲得香葉木素與HN的共有靶點(diǎn)基因。

1.4 香葉木素與HN作用核心靶點(diǎn)基因的篩選 將香葉木素與HN 的共有靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），設(shè)定物種為“homo sapiens（智人）”，構(gòu)建共有靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，進(jìn)行可視化分析。在可視化網(wǎng)絡(luò)圖中，以節(jié)點(diǎn)表示共有靶點(diǎn)基因，節(jié)點(diǎn)顏色越深、形狀越大表示對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因的度值越大，此靶點(diǎn)基因越重要；以邊表示共有靶點(diǎn)基因之間的關(guān)聯(lián)，邊線條越粗表示靶點(diǎn)基因間的結(jié)合分?jǐn)?shù)越大，靶點(diǎn)基因與靶點(diǎn)基因之間的相關(guān)性越顯著。以度值、介數(shù)中心性、接近中心性排名前10 位的靶點(diǎn)為參考指標(biāo)，選取三者的共有靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。介數(shù)中心性代表經(jīng)過某一節(jié)點(diǎn)的最短路徑的數(shù)量，介數(shù)中心性越大，該節(jié)點(diǎn)影響力越大；接近中心性代表某一節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他所有節(jié)點(diǎn)最短路徑距離平均值的倒數(shù)，接近中心性越大，表示信息從一個(gè)節(jié)點(diǎn)傳遞到其他節(jié)點(diǎn)的速度越快。

1.5 核心靶點(diǎn)基因的功能分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)香葉木素與HN 的共有靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體論（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05 作為顯著功能和通路的臨界值，按照P值從小到大進(jìn)行排序。

1.6 核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 從ProteinDatabase數(shù)據(jù)庫（https：//www. rcsb. org/）下載核心靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，選擇解析度小于3?并具有配體的蛋白復(fù)合物作為蛋白受體，以保證對(duì)接的精度。將原始配體從蛋白中分離并重新對(duì)接到蛋白的活性位點(diǎn)，若對(duì)接后的配體小分子與原配體小分子的均方根偏差（RMSD）小于2?，則表明對(duì)接參數(shù)設(shè)計(jì)合理，對(duì)接結(jié)果具有較高的可靠性。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對(duì)蛋白受體進(jìn)行去除水分子、分離原始配體、添加氫原子等處理，將其保存為“pdbqt”格式文件。從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem. ncbi. nlm. nih.gov/）下載香葉木素的2D 結(jié)構(gòu)，保存為“mol2”格式，使用AutoDock Tools 1.5.6 軟件進(jìn)行加氫、檢測分子的中心節(jié)點(diǎn)及可旋轉(zhuǎn)鍵后，保存為“pdbqt”格式文件，作為配體。采用AutoDock Vina1.1.2軟件將蛋白受體和香葉木素配體進(jìn)行分子對(duì)接，通過結(jié)合能來評(píng)估配體和受體的結(jié)合能力，結(jié)合能小于0表示配體與受體能夠自發(fā)結(jié)合，且其值越小表示兩者的結(jié)合活性越高。采用PyMOL2.3 軟件對(duì)結(jié)合能從小到大排名前4位的結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 香葉木素與HN 共同靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得的香葉木素ADME 結(jié)果為MW=300.28 Da，口服生物利用度（OB）=31.14%，藥物相似性（DL）=0.27，香葉木素的MW＜500 Da，DL＞0.18，OB＞30%；從TargetNet 數(shù)據(jù)庫獲得的香葉木素Lipinski 五規(guī)則評(píng)分為100%；表明香葉木素具有很好的成藥性。經(jīng)篩選共獲得香葉木素潛在靶點(diǎn)基因150 個(gè)、HN 相關(guān)靶點(diǎn)基因443 個(gè)，經(jīng)過韋恩圖分析，獲得香葉木素與HN 共有靶點(diǎn)基因22 個(gè)。見OSID 碼圖1。

2.2 香葉木素與HN 作用核心靶點(diǎn)基因的篩選結(jié)果 香葉木素與HN 共有靶點(diǎn)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)見OSID 碼圖2。該網(wǎng)絡(luò)中共有22 個(gè)節(jié)點(diǎn)、85 條邊，網(wǎng)絡(luò)中未出現(xiàn)孤立節(jié)點(diǎn)，且各節(jié)點(diǎn)之間連通性良好，表明香葉木素通過調(diào)控多靶點(diǎn)協(xié)同治療HN。拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)中度值、介數(shù)中心性、接近中心性各自排名前10位的靶點(diǎn)中，相同靶點(diǎn)分別為腫瘤蛋白p53（TP53）、雌激素受體α（ESR1）、BCL2樣1（BCL2L1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）、半胱氨酸蛋白酶8（CASP8）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體亞家族G成員2（ABCG2），這些靶點(diǎn)是香葉木素治療HN 的核心靶點(diǎn)。此外，XDH 即黃嘌呤氧化酶，僅在度值中排名前10 位，但其作為尿酸生成的關(guān)鍵酶，也被視為香葉木素治療HN 的核心靶點(diǎn)。因此，累計(jì)篩選出香葉木素治療HN的核心靶點(diǎn)8個(gè)。

2.3 GO 功能注釋分析結(jié)果 GO 功能注釋分析共得到條目82 個(gè)，包括生物過程、細(xì)胞組成、分子功能等。其中生物過程包括51 個(gè)條目，涉及凋亡的調(diào)控、細(xì)胞增殖、蛋白的磷酸化、尿酸代謝等，P值排名前15 位的條目分別為對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)雌二醇的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、肽基絲氨酸磷酸化、對(duì)藥物的反應(yīng)、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡過程的調(diào)控、p53 介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的正調(diào)控、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換、細(xì)胞增殖、尿酸代謝過程、線粒體膜通透性的調(diào)節(jié)。細(xì)胞組成包括13 個(gè)條目，分別為蛋白復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、小窩、核質(zhì)、細(xì)胞周期依賴性、蛋白激酶全酶復(fù)合物、線粒體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、膜筏、內(nèi)體、細(xì)胞核、胞外體、有絲分裂紡錘體。分子功能包括18 個(gè)條目，P值排名前15 位的條目分別為同蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、細(xì)胞周期蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、組蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、RNA 聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域激酶活性、非鈉依賴性有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、無機(jī)陰離子交換活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性。

2.4 KEGG通路富集分析結(jié)果 KEGG通路富集共得到35條通路，以P＜0.05為篩選條件，排名前20位的通路信息見表1。香葉木素治療HN的主要通路包括人抑癌基因p53信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路等。

表1 香葉木素治療HN的KEGG富集分析結(jié)果（前20位）

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 各核心靶點(diǎn)蛋白的原始配體對(duì)接到蛋白活性位點(diǎn)后的RMSD 值均小于2?，表明對(duì)接結(jié)果具有較高的可靠性。香葉木素與核心靶 點(diǎn) 基 因TP53、XDH、ABCG2、ESR1、MAPK1、BCL2L1、CASP8 和PTGS2 編碼的蛋白的結(jié)合能分別為-8.4、-8.4、-8.1、-8.0、-7.9、-7.7、-6.9、-6.0 kcal/mol，均小于-5 kcal/mol，說明香葉木素與核心靶點(diǎn)蛋白間具有很好的結(jié)合活性（表2）。香葉木素與結(jié)合能排名前4 位蛋白的結(jié)合模式圖見OSID碼圖3。

表2 核心靶點(diǎn)基因編碼的蛋白分子對(duì)接信息

3 討論

HN 是高尿酸血癥的常見臨床并發(fā)癥，高水平的尿酸通過激活腎臟的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致HN。腎臟是尿酸排泄的主要器官，當(dāng)腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及排泄蛋白出現(xiàn)功能障礙時(shí)，沉積在腎臟的尿酸鹽晶體進(jìn)一步加重腎損傷。因此，降低腎臟的尿酸水平是治療HN 的主要策略。香葉木素是菊花在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，是黃嘌呤氧化酶的競爭性抑制劑，具有潛在的降尿酸活性［5］。為了探討香葉木素治療HN 的潛力，我們基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探討香葉木素治療HN的分子機(jī)制。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共挖掘出香葉木素潛在作用靶點(diǎn)基因150 個(gè)、HN 疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因443個(gè)，通過韋恩圖獲得成分—疾病共有靶點(diǎn)基因22個(gè)。拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果表明，香葉木素治療HN 的核心靶點(diǎn)包括TP53、ESR1、PTGS2、BCL2L1、CASP8、MAPK1、ABCG2和XDH。

XDH 即黃嘌呤脫氫酶，又稱為黃嘌呤氧化酶，是機(jī)體產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶。嘌呤類物質(zhì)在XDH 的作用下產(chǎn)生尿酸，過量尿酸在體內(nèi)形成尿酸鹽結(jié)晶，沉積在腎臟的尿酸鹽結(jié)晶誘導(dǎo)氧化與抗氧化失衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激性腎損傷。研究顯示，尿酸鹽結(jié)晶通過激活NLRP3 炎癥小體及NF-κB 通路引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致急、慢性腎損傷［6］。因此，抑制黃嘌呤氧化酶活性、減少尿酸生成是治療HN的首選方法。

TP53 是一種廣泛存在于組織細(xì)胞中的腫瘤抑制因子，過量尿酸導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激，活性氧的刺激導(dǎo)致腎細(xì)胞線粒體受損、DNA 損傷及TP53 基因表達(dá)［7］，活化的TP53 通過控制凋亡基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)腎細(xì)胞凋亡。一方面，TP53 可以直接促進(jìn)凋亡蛋白Bad、Bax、Bak 表達(dá)，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)，導(dǎo)致HN 腎臟細(xì)胞凋亡；另一方面，TP53 通過激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)下調(diào)Bcl-2 蛋白家族，誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡［8］。研究顯示，腎臟氧化應(yīng)激導(dǎo)致MAPK 活性增強(qiáng)進(jìn)而誘發(fā)HN，抑制MAPK 活化可顯著改善HN的腎損傷［9］。因此，調(diào)節(jié)腎臟的氧化應(yīng)激對(duì)HN的治療具有重要意義。

ESR 是一種孤兒受體，在腎臟等組織中廣泛表達(dá)。在急性腎損傷中ESR 活性顯著增強(qiáng)，同時(shí)伴隨著凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3 表達(dá)增強(qiáng)及腎臟炎癥反應(yīng)；當(dāng)ESR 活性被抑制時(shí)，腎細(xì)胞凋亡減少且炎癥反應(yīng)減輕［10］。以上結(jié)果表明，ESR 在HN 的治療中可能具有重要意義。

腎臟是機(jī)體尿酸排泄的主要器官，ABCG2 是調(diào)節(jié)腎臟尿酸排泄的主要蛋白之一，ABCG2 功能障礙導(dǎo)致腎臟尿酸水平升高進(jìn)而誘發(fā)HN，上調(diào)腎臟ABCG2 表達(dá)不僅能夠降低機(jī)體尿酸水平，同時(shí)能夠顯著改善HN 大鼠的腎功能［11］。此外研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2 是TP53 的 間 接 靶 點(diǎn)，抑 制TP53 可 導(dǎo) 致ABCG2 基因表達(dá)升高，進(jìn)而增強(qiáng)腎臟尿酸排泄［12］。因此，以ABCG2 為靶點(diǎn)進(jìn)行HN 的治療具有重要的研究價(jià)值。

本研究通過GO 功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，香葉木素與HN 共有靶點(diǎn)的生物學(xué)作用主要包括對(duì)凋亡過程的正負(fù)調(diào)控、對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控、線粒體功能、有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性及尿酸的代謝等。這些生物學(xué)作用既是香葉木素的潛在活性作用，同時(shí)也是HN 的主要病理生理學(xué)過程，提示香葉木素具有治療HN 的潛在價(jià)值。對(duì)共有靶點(diǎn)基因的KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，香葉木素治療HN 的可能通路為TP53 信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等。TP53 被過量尿酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游Bcl-2 家族及Caspase 家族相關(guān)蛋白的活性，控制腎臟細(xì)胞凋亡。與此同時(shí)，TP53 增強(qiáng)腎臟尿酸排泄蛋白ABCG2 的活性促進(jìn)尿酸排泄進(jìn)而改善腎功能［13］。此外，研究表明，尿酸通過激活PI3K/Akt/NF-κB 通路導(dǎo)致IL-1β、TNF-α、PTGS2 表達(dá)引發(fā)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)［14］，而抑制PI3K/Akt/NF-κB 通路不僅能夠降低腎臟尿酸重吸收蛋白GLUT9 表達(dá)，同時(shí)還能減輕過量尿酸誘發(fā)的腎臟炎癥反應(yīng)［15］。這表明香葉木素可能通過作用于以上多個(gè)通路發(fā)揮治療HN的作用。

本研究進(jìn)一步采用分子對(duì)接技術(shù)分別將香葉木素與核心靶點(diǎn)基因TP53、ABCG2、ESR1、PTGS2、BCL2L1、CASP8、MAPK1 和XDH 等基因編碼的蛋白進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果顯示，香葉木素與上述核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。這進(jìn)一步表明香葉木素可通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療HN 的作用，同時(shí)也初步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果。

綜上所述，在HN 中，多靶點(diǎn)，多通路間相互作用，相互關(guān)聯(lián)，共同影響HN 的發(fā)生和發(fā)展，而香葉木素可能通過調(diào)節(jié)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療HN 的作用。然而，盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破單一靶點(diǎn)的研究模式，揭示了中藥分子多靶點(diǎn)、多通路作用，為中醫(yī)藥的研究提供了極大的便利，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍存在諸多需要關(guān)注的問題：首先，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中篩選信息，目前，用于數(shù)據(jù)篩選的數(shù)據(jù)庫較多，尚無統(tǒng)一的規(guī)定，不同的研究人員在選擇數(shù)據(jù)庫時(shí)可能存在差異，因而篩選得到的數(shù)據(jù)具有差異性和不完整性；其次，中藥成分復(fù)雜，經(jīng)人體吸收后在多種代謝酶的作用下可能轉(zhuǎn)化為其他活性物質(zhì)且生物利用度及組織分布等無法準(zhǔn)確判斷，因此，具體藥效成分需結(jié)合藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)的方法進(jìn)行深入探究；此外，盡管通過數(shù)據(jù)庫及其他計(jì)算機(jī)技術(shù)如分子對(duì)接等揭示了藥物分子與疾病靶點(diǎn)存在聯(lián)系，但二者間的具體作用仍需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為藥物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。