線粒體自噬相關(guān)信號(hào)通路和蛋白在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

羅苑，段小花，楊麗萍，陳普

1 云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明 650500；2 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腦卒中分為出血性和缺血性兩類，其中近80%的腦卒中為缺血性卒中。溶栓治療是目前挽救急性腦缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞最有效的治療策略，可通過(guò)再灌注恢復(fù)血液供應(yīng)，挽救缺血組織。但缺血后再灌注常引發(fā)多種分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如氧化應(yīng)激、鈣離子超載、凋亡基因激活等，加重神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致受損線粒體堆積，最終造成腦缺血再灌注損傷（CIRI）［1］。線粒體是細(xì)胞存亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，一方面通過(guò)產(chǎn)生腺苷三磷酸（ATP）來(lái)控制細(xì)胞生存，另一方面通過(guò)釋放細(xì)胞色素C（Cyt C）等促凋亡因子來(lái)控制細(xì)胞死亡［2］。CIRI 期間產(chǎn)生大量活性氧和鈣離子，造成線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔過(guò)度開(kāi)放，引起線粒體通透性改變，膜結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生線粒體膜電位的降低甚至內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失、線粒體內(nèi)鈣離子超載等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體功能障礙；而線粒體功能障礙又反過(guò)來(lái)加重腦細(xì)胞能量供應(yīng)障礙、氧化應(yīng)激損傷、線粒體鈣超載。這些病理變化相互影響，互為因果，共同引起Cyt C和凋亡誘導(dǎo)因子等多種凋亡因子釋放，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞壞死和凋亡［3-4］。因此，線粒體功能障礙是CIRI 中的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)線粒體功能障礙也會(huì)誘導(dǎo)線粒體自噬，通過(guò)消除受損或去極化線粒體來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。線粒體自噬是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡通過(guò)信號(hào)誘導(dǎo)生成，并不斷延伸至包裹待降解的線粒體和部分胞質(zhì)，形成完整的自噬體，進(jìn)而與溶酶體融合形成自噬溶酶體，隨后由溶酶體釋放水解酶，降解其所包裹的內(nèi)容物，以供細(xì)胞循環(huán)利用，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新［5］。研究顯示，在CIRI中，多種信號(hào)通路和線粒體自噬受體蛋白通過(guò)介導(dǎo)線粒體自噬發(fā)揮重要作用，因此調(diào)節(jié)線粒體自噬可能是減輕CIRI、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的有前景的治療策略。現(xiàn)就CIRI 中與線粒體自噬相關(guān)的信號(hào)通路及關(guān)鍵蛋白綜述如下。

1 線粒體自噬相關(guān)信號(hào)通路對(duì)CIRI的調(diào)控作用

1.1 PINK1/Parkin/p62 通路 PINK1/Parkin/p62通路參與了膜電位降低引起的線粒體自噬，是自噬最經(jīng)典的機(jī)制通路。研究顯示，在CIRI 的神經(jīng)元中，Parkin 感受線粒體跨膜電位的丟失，并靶向降解受損線粒體［6］。LAN 等［7］報(bào)道，大鼠腦缺血再灌注后，嚴(yán)重的細(xì)胞損傷導(dǎo)致PINK1 顯著聚集于線粒體外膜，進(jìn)而導(dǎo)致Parkin 和p62 線粒體易位增加，特別是在再灌注后24 h。WU 等［8］報(bào)道，體外氧糖剝奪/復(fù)氧模型可激活PINK1/Parkin/p62 通路介導(dǎo)的線粒體自噬，抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，Parkin 在缺血性中風(fēng)腦組織中下調(diào)，而Parkin基因敲除小鼠在缺血24 h內(nèi)具有很高的病死率，表明Parkin 在腦缺血再灌注后神經(jīng)元的存活中具有決定性作用［9］。且PINK1/Parkin/p62 通路介導(dǎo)的線粒體自噬主要發(fā)生在神經(jīng)元中，同時(shí)也存在于神經(jīng)血管單元，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的重要組成部分，可共同維持神經(jīng)元生存和功能的穩(wěn)態(tài)。

我國(guó)自主研發(fā)的消旋正丁基苯酞，在腦血管疾病治療領(lǐng)域已被作為神經(jīng)保護(hù)劑廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，其改善大鼠CIRI 的作用可能與抑制PINK1/Parkin/p62 通路介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)［10］。在中醫(yī)方面，現(xiàn)代藥理研究表明，多種益氣活血類中藥的有效成分均可不同程度地調(diào)節(jié)線粒體自噬。其中從藤黃中提取出的氧雜蒽酮化合物［11］、復(fù)方腦肽節(jié)苷脂［12］可誘導(dǎo)Parkin 易位至受損線粒體，被PINK1 磷酸化并上調(diào)線粒體自噬來(lái)抑制CIRI，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。中醫(yī)外治法方面，有研究表明，電針可以通過(guò)PINK1/Parkin/p62 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑，減少受損線粒體的積累，改善腦缺血再灌注后神經(jīng)元的損傷［13］。

1.2 MAPK/ERK/CREB 通路 MAPK 絲裂原活化蛋白激酶家族是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，體外氧糖剝奪/復(fù)氧和體內(nèi)CIRI 過(guò)程中的自噬受MAPK/ERK1/2通路調(diào)控［14］。既往研究顯示，MAPK/ERK/CREB 通路是神經(jīng)炎癥和心衰中線粒體吞噬激活的主要調(diào)節(jié)因子［15］。ZHANG等［16］發(fā) 現(xiàn)，阻 斷MAPK/ERK/CREB 通 路 可 擾 亂NR4A1 修飾的線粒體自噬，并減少M(fèi)fn2 表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)元線粒體凋亡。這表明CIRI 的發(fā)生與增加NR4A1、阻斷MAPK/ERK/CREB通路導(dǎo)致的保護(hù)性線粒體自噬下降密切相關(guān)。

1.3 PI3K/Akt/mTOR通路 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、代謝和血管生成等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而自噬可能是該通路中促細(xì)胞生存的一部分。研究發(fā)現(xiàn)，在新生兒腦缺血中，自噬或PI3K/Akt/mTOR 通路被阻斷時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生壞死［17］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（mTOR）是自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在營(yíng)養(yǎng)條件改變時(shí)控制細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種能量代謝途徑；抑制mTOR可降低ATP5O 和TFAM 蛋白水平，影響線粒體質(zhì)量、mtDNA 含量和細(xì)胞ATP 水平［18］。這表明自噬是發(fā)育和病理?xiàng)l件下線粒體更替的主要機(jī)制。雷帕霉素是mTOR 抑制劑，能與mTOR 特異性結(jié)合誘導(dǎo)自噬發(fā)生，具有神經(jīng)保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，雷帕霉素可改善CIRI 大鼠的認(rèn)知功能障礙，減輕神經(jīng)元損傷和線粒體功能障礙；其機(jī)制是通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR 通路增強(qiáng)線粒體自噬，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［19-20］。

2 線粒體自噬相關(guān)蛋白對(duì)CIRI的調(diào)控作用

2.1 自噬受體蛋白 目前已經(jīng)鑒定出哺乳動(dòng)物細(xì)胞里BNIP3、Nix 和FUNDC1 三個(gè)自噬受體蛋白，可以直接與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）相互作用。2.1.1 BNIP3 BNIP3 是一種線粒體膜外蛋白，最早被發(fā)現(xiàn)具有促凋亡作用；近年研究表明，BNIP3可以與自噬標(biāo)記物L(fēng)C3 直接相互作用，介導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，缺乏BNIP3 的幼鼠線粒體自噬減少，導(dǎo)致腦缺血再灌注7 d 后梗死面積明顯變?。?1］。另有研究表明，BNIP3 誘導(dǎo)缺血再灌注后過(guò)度的線粒體自噬，可引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，最終加重腦損傷。這可能是因?yàn)锽NIP3蛋白在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行修飾，產(chǎn)生促存活和促凋亡兩種相反的功能，使得BNIP3 的功能受到爭(zhēng)議。因此，如何阻止促凋亡蛋白如BNIP3等超過(guò)“死亡信號(hào)”閾值的線粒體自噬平衡，值得我們深入研究。

對(duì)中藥方劑的研究顯示，小續(xù)命湯具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)的功效，在腦缺血缺氧再灌注后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)內(nèi)，通過(guò)抑制缺血再灌注后24 h 時(shí)線粒體自噬的過(guò)度激活，以及促進(jìn)缺血再灌注后期線粒體自噬，來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)線粒體自噬的穩(wěn)態(tài)平衡，對(duì)保護(hù)腦組織發(fā)揮重要作用，并且這一過(guò)程由BNIP3 參與調(diào)節(jié)［9］。

2.1.2 Nix Nix定位于線粒體外膜，與紅細(xì)胞成熟過(guò)程中線粒體的自噬清除關(guān)系密切。Nix 是BNIP3的同源體，表達(dá)于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，定位于線粒體外膜，通過(guò)LC3 直接與吞噬小體結(jié)合［5］。腦組織由于腦血流中斷造成的缺血缺氧是CIRI 的首發(fā)事件。在缺氧條件下，細(xì)胞通過(guò)上調(diào)BNIP3 和Nix 表達(dá)來(lái)激活線粒體自噬，從而改善缺血再灌注造成的腦損傷［22］。YUAN 等［23］報(bào)道，BNIP3 和Nix 參與了腦缺血再灌注誘導(dǎo)的線粒體自噬，并證明其介導(dǎo)的線粒體自噬有獨(dú)立于Parkin的作用。

2.1.3 FUNDC1 FUNDC1蛋白是另一種線粒體自噬受體，受到磷酸化調(diào)節(jié)，通常表現(xiàn)為自噬的抑制狀態(tài)，因?yàn)镾rc 蛋白激酶能夠磷酸化FUNDC1 第18 位的酪氨酸，從而使FUNDC1和LC3的相互作用減弱。然而，在腦缺血缺氧條件下，Src 蛋白激酶的活性被抑制，此時(shí)FUNDC1 去磷酸化，使得FUNDC1 和LC3的相互作用增強(qiáng)，開(kāi)始介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生［24］。在腦缺血低氧的情況下，這兩者的結(jié)合能力進(jìn)一步加強(qiáng)，且遠(yuǎn)強(qiáng)于Nix 與LC3 的結(jié)合能力，提示在隨后的再灌注損傷中FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬可能發(fā)揮更加重要的作用。

2.2 LC3 結(jié)合自噬底物p62 LC3 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬結(jié)構(gòu)的優(yōu)良標(biāo)記Atg8 家族的主要同源物，是一個(gè)典型的自噬體標(biāo)記物。Atg8 分為兩個(gè)主要亞家族，即MAP1LC3/LC3 和GABARAP，其中GABARAP 亞家族成員參與自噬體形成的后期，且PINK1/Parkin信號(hào)通路依賴的線粒體自噬必須需要GABARAP 亞家族。p62 作為L(zhǎng)C3 和泛素化底物之間的連接物，是一種自噬底物，為多功能的泛素結(jié)合蛋白，它通過(guò)與LC3相互作用，被整合到完整的自噬小體中，并在自噬溶酶體中降解，因此可作為自噬降解的指標(biāo)［25］。有研究觀察到，雷帕霉素通過(guò)增強(qiáng)線粒體自噬來(lái)改善大鼠CIRI，這可以通過(guò)線粒體中LC3Ⅱ和Beclin-1 表達(dá)增加以及p62 易位到線粒體來(lái)證明［26］。

2.3 電壓依賴的陰離子通道1（VDAC1） VDAC1位于線粒體外膜，是Parkin 聚泛素化的底物。VDAC1 可以促進(jìn)線粒體自噬并保護(hù)腦出血模型中的神經(jīng)元損傷。研究顯示，LC3 與VDAC1 的重疊率可以反映神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體自噬的水平［27］。但是，VDAC1 并不能完全代償泛素化丟失引起的線粒體自噬失常。因此，VDAC1 是否為線粒體自噬必需蛋白仍有待進(jìn)一步研究。

2.4 Beclin-1 Beclin-1是自噬調(diào)節(jié)蛋白，其通過(guò)招募Vps34、Ambra 蛋白形成自噬小體來(lái)激活PI3K/Akt/mTOR 參與線粒體自噬過(guò)程。有研究表明，在CIRI 中Beclin-1 水平上調(diào)可能激活線粒體自噬，其通過(guò)與BNIP3/Nix 和PINK1 相互結(jié)合，在線粒體自噬中發(fā)揮作用［28］。白藜蘆醇（Res）是一種非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、虎杖等天然植物中。在CIRI 大鼠中，Res 可通過(guò)增加Beclin-1 水平促進(jìn)LC3Ⅱ募集，并通過(guò)減少LAMP1 降低線粒體基質(zhì)蛋白HSP60 水平，從而促進(jìn)線粒體自噬，消除受損的線粒體，增加ATP來(lái)源［29］。

2.5 線粒體融合與分裂蛋白 線粒體分裂與線粒體融合這兩個(gè)過(guò)程共同構(gòu)成了線粒體動(dòng)力學(xué)。在神經(jīng)元中，受損線粒體可通過(guò)與健康線粒體融合來(lái)修復(fù)，也可以通過(guò)線粒體分裂，分離受損線粒體后由線粒體自噬來(lái)消除，以保持動(dòng)態(tài)平衡，達(dá)到線粒體的穩(wěn)態(tài)。在缺血和CIRI 時(shí)線粒體會(huì)過(guò)度分裂或碎裂。動(dòng)態(tài)相關(guān)蛋白1（Drp1）是線粒體裂變的主要介質(zhì)，可以加速線粒體分裂，產(chǎn)生大量片段化的線粒體。線粒體融合主要受三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）酶Opa1、Mfn1、Mfn2 的影響，主要維持線粒體嵴的正常形態(tài)。DUAN 等［30］在小鼠腦缺血損傷中發(fā)現(xiàn)，Drp1 活化后可以通過(guò)Clec16a抑制Parkin 的線粒體轉(zhuǎn)位，對(duì)線粒體自噬通路有重要調(diào)節(jié)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，NR4A1通過(guò)破壞Mfn2介導(dǎo)的自噬作用，導(dǎo)致小鼠腦缺血再灌注后的線粒體損傷［16］。在腦缺血損傷早期，塞絡(luò)通膠囊可通過(guò)抑制缺血再灌注后Drp1 的升高來(lái)減輕線粒體分裂異常，促進(jìn)線粒體融合基因Opa1 的表達(dá)進(jìn)而恢復(fù)線粒體的形態(tài)，減輕CIRI［31］。因而，線粒體融合分裂相關(guān)蛋白與線粒體自噬有著不可分割性。

綜上所述，線粒體自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞途徑，適當(dāng)?shù)木€粒體自噬有助于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，而線粒體自噬不足或過(guò)度是有害的，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，加重腦損傷。因此，調(diào)控腦缺血再灌注后線粒體自噬的信號(hào)通路及關(guān)鍵指標(biāo)是保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、治療CIRI 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在CIRI 過(guò)程中，多種信號(hào)通路以及關(guān)鍵蛋白參與了線粒體自噬的發(fā)生和調(diào)控?；诰€粒體自噬在CIRI 中的關(guān)鍵作用，我們可以從調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生機(jī)制、腦缺血再灌注階段自噬關(guān)鍵指標(biāo)以及多種信號(hào)途徑的病理轉(zhuǎn)歸方面入手，深入研究線粒體自噬在腦缺血再灌注后的動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)線粒體自噬進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌邢蛘{(diào)節(jié)，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，從而阻斷CIRI的惡性循環(huán)。