免疫檢查點程序性細胞死亡蛋白配體1翻譯后修飾的研究進展

吳學雨，胡楠，張競舟，洪義東，卞保祥，宋子琰，吳風雷

徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院，江蘇 連云港 222060

程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）是適應性和先天性免疫反應的抑制劑，PD-1 有兩種配體，即程序性細胞死亡蛋白配體1（PD-L1）和PD-L2。PD-L1 作為重要的免疫檢查點，在活化的T細胞、自然殺傷細胞和B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和單核細胞上均有表達。正常情況下，組織細胞表面的PD-1與其配體PD-L1 結(jié)合后，抑制T 細胞過度增殖活化來維持人體正常的免疫平衡，從而產(chǎn)生負調(diào)節(jié)作用；而過表達PD-1 與PD-L1 的結(jié)合可形成免疫抑制微環(huán)境，導致腫瘤逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷，發(fā)生免疫逃逸［1］。翻譯后修飾是指多肽或蛋白質(zhì)在翻譯后所經(jīng)歷的共同加工過程，PD-L1 的翻譯后修飾存在多種形式，例如糖基化、泛素化、磷酸化、甲基化、棕櫚?；鸵阴；?。翻譯后修飾可影響PD-L1的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，促進PD-L1 介導的腫瘤免疫逃逸，阻斷PD-L1 與PD-1 的結(jié)合，增強自身免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷功能，在PD-L1蛋白穩(wěn)定性、易位和蛋白—蛋白相互作用中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)將PD-L1翻譯后修飾研究進展綜述如下。

1 PD-L1的糖基化修飾

1.1 糖基化修飾的定義 糖基化修飾是指在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的初生肽的NXT（Asn-X-Ser/Thr）基序內(nèi)將寡糖連接到天冬酰胺殘基上的一種協(xié)同修飾和翻譯后修飾。蛋白質(zhì)上的寡糖通過分泌途徑進一步加工成為高甘露糖、雜化或復合型聚糖。根據(jù)聚糖結(jié)構(gòu)連接的氨基酸位點的不同，糖基化修飾可分N-糖基化和O-糖基化兩種。N-糖基化在蛋白質(zhì)折疊、降解、細胞定位和蛋白質(zhì)相互作用等許多生物化學和生物學事件中起關(guān)鍵作用。

1.2 PD-L1 糖基化修飾對腫瘤的治療價值 大多數(shù)免疫相關(guān)受體和配體，包括PD-1 和PD-L1，都存在廣泛的糖基化。在PD-L1 的胞外結(jié)構(gòu)域，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4 個N-糖基化位點N35、N192、N200 和N219［2］。研究表明，PD-L1 在非糖基化狀態(tài)下不穩(wěn)定，易降解，糖基化修飾后可提高其穩(wěn)定性表達［3］。在頭頸鱗狀細胞癌中，Let-7a/b可通過β-catenin/STT3信號通路抑制PD-L1糖基化，降低PD-L1的穩(wěn)定性［4］。在結(jié)腸癌中，β-catenin 抑制劑YA1797K 通過抑制β-catenin/STT3 信號通路抑制PD-L1 糖基化，降低PD-L1 的穩(wěn)定性，從而解除免疫逃逸，誘導結(jié)腸腫瘤干細胞凋亡［5］。這為KYA1797K 作為結(jié)腸癌免疫治療靶點提供了理論依據(jù)。

糖基化的異常調(diào)節(jié)導致蛋白質(zhì)錯誤的組裝或折疊，這些蛋白質(zhì)被多泛素化，然后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆向移位至細胞質(zhì)，隨即被細胞質(zhì)中蛋白酶體降解，這個過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解。HSU 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，N-糖基轉(zhuǎn)移酶STT3 在腫瘤干細胞中高表達，增加了PD-L1 糖基化，導致腫瘤干細胞中PD-L1 上調(diào)和腫瘤免疫逃逸。這表明PD-L1糖基化有助于腫瘤干細胞中PD-L1的富集。

PD-L1 糖基化在PD-1/PD-L1 介導的腫瘤免疫抑制過程中發(fā)揮重要作用。動物實驗表明，在BALBc 小鼠中，表達野生型PD-L1 的4T1 乳腺荷瘤小鼠的腫瘤生長速度比4NQ突變PD-L1荷瘤小鼠更快，但在SCID 小鼠中未觀察到顯著差異［7］。這表明PD-L1 糖基化對其體內(nèi)免疫抑制功能很重要，其致瘤性的差異歸因于免疫監(jiān)視。在三陰性乳腺癌細胞中，2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）可干擾蛋白N-糖基化，逆轉(zhuǎn)聚合酶抑制劑誘導的PD-L1 糖基化和免疫抑制［8］；在同基因的三陰性乳腺癌小鼠模型中，2-DG靶向PD-L1 糖基化聯(lián)合EGFR 抑制腫瘤大小，增強由4-1BB 介導的抗腫瘤免疫［9］。體外實驗顯示，多酚化合物白藜蘆醇通過促進PD-L1的異常糖基化和二聚化，在體外增加抗腫瘤免疫，導致PD-L1 失調(diào)、糖基化異常而發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解［9］。

以上研究表明，PD-L1 糖基化對PD-L1 介導的免疫抑制至關(guān)重要，抗PD-L1 糖基化可阻斷PD-L1/PD-1 的相互作用，直接靶向PD-L1 糖基化可能是增強免疫檢查點治療的有效策略。

2 PD-L1的磷酸化修飾

2.1 磷酸化修飾的定義 蛋白磷酸化修飾是指在蛋白激酶的催化下，將GTP 或ATPγ 位上磷酸基轉(zhuǎn)移到目的蛋白的氨基酸殘基上的過程。在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中，蛋白磷酸化具有重要作用。

2.2 PD-L1磷酸化修飾對腫瘤的治療價值 PD-L1翻譯后的磷酸化修飾通常由蛋白質(zhì)激酶介導，目前已知的蛋白激酶有3 種，即糖原合酶激酶3β（GSK3β）、腺苷酸活化蛋白質(zhì)激酶（AMPK）、杰納斯激酶1（JAK1），在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、生理功能和亞細胞定位發(fā)揮重要作用。

GSK3β 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Wnt信號通路的關(guān)鍵成分，在腫瘤發(fā)生中起重要作用。GSK3β 對PD-L1 的穩(wěn)定性具有重要作用，可選擇性地與非糖基化PD-L1 的C 端結(jié)合，誘導其磷酸化，促使其降解；GSK3β失活可使PD-L1穩(wěn)定，進而增強腫瘤的免疫抑制。非糖基化PD-L1是一種半衰期約為4 h 的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。LI 等［10］發(fā)現(xiàn)，非糖基化PD-L1在被GSK3β 磷酸化后，被泛素/蛋白酶體系統(tǒng)降解。GSK3β 對PD-L1 的磷酸化導致PD-L1 與E3 連接酶β-TRCP結(jié)合，導致PD-L1在細胞質(zhì)中降解。

研究顯示，二甲雙胍可以激活AMPK 磷酸化PD-L1的第195位絲氨酸（Ser195）殘基，PD-L1的Ser在空間結(jié)構(gòu)上與其糖基化修飾位點接近，Ser195 磷酸化可引起PD-L1 糖基化修飾的異常，蛋白構(gòu)象改變導致PD-L1 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的堆積以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解［11］。

JAK1是JAK 家族成員之一，參與體內(nèi)很多細胞信號轉(zhuǎn)導，其自身的過表達及基因突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CHAN等［12］報道，在IL-6刺激下，JAK1可結(jié)合并磷酸化非糖基化PD-L1，同時聚集糖基轉(zhuǎn)移酶STT3結(jié)合于PD-L1，促進PD-L1的糖基化修飾，增強PD-L1 在肝癌細胞中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，誘導腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。

3 PD-L1的泛素化修飾

3.1 泛素化修飾的定義 泛素化修飾是在泛素結(jié)合酶、泛素激活酶和泛素連接酶等酶的參與下，將泛素添加到目標蛋白上。泛素—蛋白酶體系統(tǒng)在促進蛋白質(zhì)的多泛素化、蛋白質(zhì)降解、控制各種細胞過程和疾病，包括免疫監(jiān)視和腫瘤發(fā)生中起重要作用。泛素化是一個可逆反應，其逆反應是去泛素化。去泛素化抑制劑WP1130、P5091 和B-AP15 分別具有增強抗腫瘤活性、抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的作用［13］。

3.2 PD-L1 泛素化修飾對腫瘤的治療價值 細胞周期蛋白（D-CDK4）是蛋白質(zhì)激酶家族中的一員，主要是與細胞周期蛋白的結(jié)合來促進細胞周期有序進行，是翻譯后負調(diào)控因子，影響PD-L1 的泛素化。D-CDK4 對PD-L1 表達發(fā)揮負調(diào)控作用，抑制CDK5/6 可提高PD-L1 表達，因此調(diào)控泛素化與抗PD-1/PD-L1 療法協(xié)同可增強腫瘤免疫。CKLF 樣MARVEL跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白6（CMTM6）是一種廣泛分布的蛋白質(zhì)，它可與PD-1 結(jié)合，減少PD-L1 在細胞周期中的泛素化和溶酶體的降解，促進PD-L1 在細胞膜上穩(wěn)定表達，提高腫瘤細胞抑制T 細胞的能力［13］。因此，PD-L1 多泛素化在不同細胞間隔或細胞周期階段的調(diào)節(jié)機制可以作為改善惡性腫瘤患者免疫治療效果的治療靶點。

EGF 信號通路通過抑制GSK3β 對PD-L1 的磷酸化，阻止E3 連接酶適配器蛋白（β-TRCP）引起PD-L1 泛素化與降解，從而減少PD-L1 泛素化［14］；而EGF 抑制劑可顯著增加PD-L1 泛素化，降低PD-L1水平［3］。研究顯示，二甲雙胍誘導PD-L1 磷酸化導致PD-L1 糖基化異常，從而促進PD-L1 泛素化，誘導蛋白酶體降解；在腫瘤微環(huán)境中，二甲雙胍可增加CD8+T 淋巴細胞的活化和對腫瘤細胞的殺傷能力，協(xié)同CTLA4抑制劑能夠明顯抑制腫瘤的生長［11］。

4 PD-L1的棕櫚?；揎?/h2>

4.1 棕櫚?；揎椀亩x 蛋白質(zhì)的棕櫚酰化是指16 碳脂肪酸棕櫚酸酯通過不穩(wěn)定的硫酯鍵共價結(jié)合到蛋白質(zhì)特異性半胱氨酸殘基（Cys）側(cè)鏈上，導致細胞質(zhì)蛋白的疏水性和對細胞質(zhì)膜表面的親和力增加。棕櫚?；且环N調(diào)節(jié)蛋白活性、穩(wěn)定性、相互作用、定位、信號轉(zhuǎn)導、凋亡和癌變的機制［15］。

4.2 PD-L1棕櫚酰化修飾對腫瘤的治療價值 PD-L1是一種表達于腫瘤和腫瘤浸潤免疫細胞表面的T細胞調(diào)節(jié)分子，PD-L1通過棕櫚酸與其272個半胱氨酸殘基的共價結(jié)合而被棕櫚酰化以獲得穩(wěn)定性。YANG 等［16］在乳腺癌的研究中提出，棕櫚?；煞€(wěn)定PD-L1，并促進其他腫瘤類型的腫瘤生長，并確定了PD-L1 棕櫚?；揎椀陌被嵛稽c為第272 位半胱氨酸（Cys272）；棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶DHHC9 催化Cys272 發(fā)生S-棕櫚?；揎椇螅琍D-L1 蛋白的半衰期得到顯著延長。YAO 等［17］研究表明，PD-L1 棕櫚?；梢种芇D-L1 的單泛素化，阻止其通過運輸所需的內(nèi)體分選復合體進入多泡體，阻礙了PD-L1 溶酶體降解，導致PD-L1 表達增加，從而抑制T 細胞的細胞毒性。新近研究發(fā)現(xiàn)，在EGFR 突變的耐藥非小細胞肺癌中，脂肪酸合成酶介導的EGFR 棕櫚?；赡軐е伦貦磅；黾雍蚉D-1 表達［18］。與等基因?qū)φ占毎啾?，在順鉑耐藥膀胱癌細胞中也發(fā)現(xiàn)了其高棕櫚?；?9］，激活該通路可抑制細胞毒性T淋巴細胞的活化，導致腫瘤細胞免疫逃逸。目前應用最廣泛的棕櫚?；种苿?-BP 是一種不可代謝的棕櫚酸類似物，具有多效性作用。然而，尚無高親和力、高特異性靶向棕櫚?；囊种扑幬?，目前對于棕櫚酰化修飾仍有許多值得去探索，例如催化PD-L1 棕櫚?；奶禺愋悦?，進一步分析棕櫚?；负腿プ貦磅；?。

5 PD-L1的甲基化修飾

5.1 甲基化修飾的定義 甲基化是甲基轉(zhuǎn)移酶在靶蛋白上產(chǎn)生的主要翻譯后修飾，可發(fā)生在組蛋白和非組蛋白調(diào)控域內(nèi)特定精氨酸或賴氨酸殘基上，從而使目標蛋白具有不同的特性。甲基化誘導的蛋白質(zhì)功能轉(zhuǎn)換變化是腫瘤的主要分子特征之一。無法觸發(fā)識別甲基化以及隨后的進一步激活或抑制，可最終導致異常靶基因的積累并導致腫瘤發(fā)展。

5.2 PD-L1 甲基化修飾對腫瘤的治療價值 研究表明，PD-L1 啟動子的DNA 甲基化狀態(tài)可以作為各種惡性腫瘤的預后生物標志物。在結(jié)直腸癌中，PD-L1 的高甲基化與較短的總生存期和無復發(fā)生存期相關(guān)，并且是總生存期的獨立預后因素［20］；在頭頸部鱗狀細胞癌中，DNA 甲基化和組蛋白修飾降低PD-L1的表達，PD-L1啟動子的低甲基化與其mRNA和蛋白表達呈負相關(guān)［21］；在膠質(zhì)母細胞瘤、大腸癌、前列腺癌中，PD-L1 甲基化均與其mRNA 呈負相關(guān)［22］；在前列腺癌中，PD-L1 甲基化是生化復發(fā)的預后因素［23］。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性乳腺癌和大腸癌PD-L1異常的啟動子甲基化可能是導致其上調(diào)表達的潛在機制［20］。因此，去甲基化抑制劑聯(lián)合抗PD-L1 抗體可能是更有效的腫瘤治療策略。

6 PD-L1的乙?；揎?/h2>

6.1 乙?；揎椀亩x 乙?；堑鞍踪|(zhì)殘基通過乙酰輔酶A 的乙酰轉(zhuǎn)移酶添加到乙?；系倪^程。對乙?；幸阴；娜コM行催化的脫乙?；赣薪M蛋白脫乙?；福℉DAC）和去乙酰化酶（SIRTs）兩種，HDAC 通過從組蛋白的N-乙酰賴氨酸氨基酸中去除乙?；鶃碚{(diào)節(jié)乙?；?4］。

6.2 PD-L1乙?；揎棇δ[瘤的治療價值 PD-L1通過p300在Lys263位點乙酰化，阻止其從質(zhì)膜進入細胞核，導致PD-L1的細胞核部分減少，從而發(fā)生腫瘤細胞免疫監(jiān)視的逃逸。HDAC 可以減少p300 介導的PD-L1 乙?；?，增加PD-L1 的核部分，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的免疫監(jiān)視。研究顯示，HDAC 抑制劑LBH589 能夠介導組蛋白3 乙?；S后在mRNA、蛋白質(zhì)和基因乙?；缴险{(diào)PD-L1表達。動物實驗 顯示，LBH589 可增 加C57BL/6 小鼠 的PD-L1 和PD-L2 表達。在黑色素瘤細胞中，LBH589 能夠提高PD-L1 和PD-L2 啟動子區(qū)域的組蛋白乙?；潭龋?5］。動物實驗顯示，在淋巴瘤小鼠中，LBH589 與PD-1 阻斷抗體聯(lián)合應用可促進腫瘤消退，延緩腫瘤進展和提高生存率。

此外，HDAC3 抑制劑通過調(diào)節(jié)胰腺癌細胞中的信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）降低PD-L1 mRNA 和蛋白水平，表明HDAC3 抑制劑可以增強免疫治療。HDAC3抑制劑romidepsin通過增強組蛋白H3 和H4 的乙?；吞岣連RD4 表達上調(diào)PD-L1 表達，從而抑制結(jié)腸癌細胞的細胞免疫功能［26］。因此推測，HDAC 抑制劑靶向PD-L1 乙?；赡苡兄谠鰪娔[瘤免疫治療。進一步研究PD-L1乙?；绾螀⑴c調(diào)節(jié)其他翻譯后修飾的調(diào)節(jié)機制，可能有助于找到靶向PD-L1 乙?；荋DACs 抑制劑的新方法。

既往研究認為，阻斷T 淋巴細胞外PD-L1 和PD-1 的結(jié)合即可恢復T 淋巴細胞功能，然而最新報道表明，在腫瘤抗原的刺激下，T淋巴細胞表面PD-1蛋白表達也會隨之上調(diào)，PD-1 對T 淋巴細胞的抑制作用增強，將導致T 淋巴細胞“耗竭”或耐藥。單純在細胞外阻斷PD-1 信號通路只能使T 淋巴細胞功能部分正?；?，如果在此基礎(chǔ)上對細胞內(nèi)的信號通路轉(zhuǎn)導進行干預，才有可能實現(xiàn)T 細胞功能的完全正?；Ｒ虼?，了解PD-L1/PD-1 的相互作用以及PD-L1 的多種翻譯后修飾類型之間的關(guān)聯(lián)具有重要意義。通過PD-L1翻譯后修飾來干預腫瘤細胞的免疫應答，對腫瘤細胞的的增殖、侵襲、凋亡及免疫等產(chǎn)生影響，有助于提高臨床抗PD-1/PD-L1 治療的效果。

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