黃芪甲苷對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠腎組織galectin-3/ERK1/2信號通路的影響

★ 宋高峰 翁文慈 王文靜 彭玲（.深圳市中醫(yī)院腎病科 廣東 深圳 58033；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院 廣東 深圳 58033）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。DKD的發(fā)病機(jī)制甚為復(fù)雜，涉及血流動力學(xué)異常、線粒體功能失調(diào)、脂代謝紊亂、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）形成增加、氧化應(yīng)激等多種因素，目前尚缺乏特效的治療藥物。

半乳糖凝集素-3（galectin-3）是半乳糖結(jié)合素家族的的重要成員之一，主要由巨噬細(xì)胞分泌，其在細(xì)胞黏附、增殖、活化和凋亡等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，參與了炎癥及纖維化等病理過程，可能成為癌癥、免疫炎性及代謝性疾病治療的新型靶標(biāo)［2］。研究表明，galectin-3與DKD關(guān)系密切。galectin-3與DKD患者尿蛋白及血肌酐存在顯著相關(guān)性，隨著病情的加重，galectin-3在血清中的表達(dá)逐漸升高，其表達(dá)量與尿蛋白呈正相關(guān)，與血肌酐呈負(fù)相關(guān)［3］。galectin-3可能參與了DKD的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機(jī)制目前尚不明確。

黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是黃芪藥理活性的主要成分之一，近年來AS-Ⅳ的腎臟保護(hù)作用越來越受到重視。AS-Ⅳ可通過抗氧化［4］、減輕炎癥反應(yīng)［5］等多種作用機(jī)制發(fā)揮保護(hù)腎功能、減輕蛋白尿，治療DKD的作用。然而AS-Ⅳ對DKD的保護(hù)作用是否與調(diào)控galectin-3有關(guān)尚未見報道。本研究基于galectin-3/ERK1/2信號通路進(jìn)一步研究AS-Ⅳ對小鼠DKD的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5～6 周齡雄性 C57BL /6J小鼠，體重為 16～18 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要藥物與試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma-Aldrich公司）；AS-Ⅳ（成都康邦生物科技有限公司）；galectin-3一抗（美國abcam公司）；p-ERK1/2一抗（美國Cell Signaling Technology公司）；尿白蛋白ELISA試劑盒（美國Bethyl公司）；β-actin抗體（美國Sigma-Aldrich公司）；二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 主要儀器

垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、全自動凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad Laboratories公司）；熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本NIKON公司）；血糖儀及試紙（瑞士Roche公司）。

1.4 造模與分組

C57BL/6J小鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，取10只為正常組，其余20只為模型組。造模前禁食不禁水12 h，糖尿病模型組小鼠給予一次性腹腔注射STZ（溶解于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.6，200 mg/kg），正常對照組注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液，于72 h后小鼠尾靜脈取血測血糖，隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L，則確認(rèn)模型成功。剔除血糖未達(dá)標(biāo)的小鼠。取造模成功的小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法，分為模型組（STZ組，n=6），AS-Ⅳ治療組（STZ+AS-Ⅳ組，n=6）。另外從正常小鼠選組6只作為對照組（Control組）。Control 組和STZ組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，STZ + AS-Ⅳ組給予添加AS-Ⅳ的飼料喂養(yǎng)（按5 g∶1 kg比例將AS-Ⅳ和飼料混勻，塑形封裝后經(jīng)鈷60照射），共計觀察8周。

1.5 標(biāo)本采集及保存

在給藥8周后，于實驗動物處死前1 d將各組大鼠分別放置于代謝籠中，收集24 h尿液并記錄尿量，采集小鼠8周時血清及腎臟組織標(biāo)本。步驟如下：水合氯醛麻醉后，摘除眼球快速留取血液標(biāo)本1 mL，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取血清裝入1.5 mL EP管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ⊙Y(jié)束后立即斷頸處死，沿腹正中線剖開腹腔，取出腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后左腎縱向切為兩半，取一半置于10%中性甲醛固定做病理檢查。另一半及右腎組織分離皮髓質(zhì)后裝入1.5 mL EP管中，液氮快速冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于Western blotting檢測。

1.6 標(biāo)本檢測

血肌酐及尿素氮由深圳市中醫(yī)院檢驗科檢測，尿白蛋白使用ELISA方法測定，各組小鼠禁食6 h后用羅氏血糖儀測定空腹血糖，各指標(biāo)檢測均按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行操作。免疫組化染色鑒定galectin-3及p-ERK1/2在腎組織中的表達(dá)定位，Western blot方法檢測腎皮質(zhì)組織中g(shù)alectin-3、p-ERK1/2的蛋白含量。

1.7 腎組織病理學(xué)檢查

腎組織石蠟切片行PAS染色后，每組隨機(jī)選取3個樣本，使用熒光顯微鏡下測量30個腎小球血管襻面積，用成像系統(tǒng)拍照，將拍好的照片導(dǎo)入計算機(jī)中，用NIS-Elements圖像處理軟件（Nikon Corporation，Tokyo，Japan）進(jìn)行圖片統(tǒng)計分析。

1.8 免疫組化檢測腎組織galectin-3及p-ERK1/2表達(dá)

（1）石蠟切片進(jìn)行脫蠟；（2）抗原用檸檬酸緩沖液修復(fù)；（3）3%雙氧水（H2O2）滅活內(nèi)源性過氧化物酶；（4）galectin-3（1∶100），p-ERK1/2（1∶200）4 ℃孵育過夜；（5）37 ℃復(fù)溫，PBS 洗滌，二抗（1∶1 000）37 ℃孵育 30 min；（6）PBS 洗滌，DAB顯色；（7）蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.9 Western blot檢測腎組織galectin-3，p-ERK1/2蛋白的表達(dá)

（1）取冷凍保存的小鼠腎皮質(zhì)組織，稱重，加入適量蛋白裂解液，冰上勻漿，在4 ℃下12 000 r/min條件下離心10 min后取上清液提取總蛋白，以BCA方法對上清進(jìn)行蛋白定量；（2）制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳至溴酚藍(lán)跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；（3）TBS 洗膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h；（4）根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜；（5）次日用TBS液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗室溫下孵育1 h；（6）TBS液洗4次，每次10 min，之后在Bio-Rad全能成像儀上觀察、分析條帶；（7）β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白灰度值／內(nèi)參灰度值反映蛋白的相對表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)和方差齊時，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS-Ⅳ對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠24 h尿白蛋白的影響

與Control組比較，STZ組小鼠24 h尿白蛋白明顯升高（P＜0.001）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠24 h尿白蛋白明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠24 h尿白蛋白比較

2.2 AS-Ⅳ對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖的影響

與Control組比較，STZ組小鼠血肌酐升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠血肌酐明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Control組比較，STZ組小鼠血尿素氮明顯升高（P＜0.01）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠血尿素氮未見明顯下降。與Control組比較，STZ組小鼠血糖明顯升高（P＜0.001）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組小鼠血糖無明顯差異。見表1。

表1 各組小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖比較（±s，n=6）

表1 各組小鼠血肌酐、血尿素氮及血糖比較（±s，n=6）

注：與Control組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與STZ組比較，#P＜0.05。

組別 血肌酐/（μmol·L-1）血尿素氮/（mmol·L-1）血糖/（mmol·L-1）Control組 12.67±1.37 12.80±1.04 7.25±0.93 STZ 組 15.50±4.09 17.03±2.91** 30.63±4.10***STZ+AS- Ⅳ組 11.17±2.23# 17.25±3.79 32.89±5.97

2.3 AS-Ⅳ對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠腎組織galectin-3/ERK1/2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果所示，與Control組比較，STZ組腎皮質(zhì)組織中g(shù)alectin-3蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.001）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組腎皮質(zhì)組織中g(shù)alectin-3蛋白表達(dá)被抑制（P＜0.001）。與Control組比較，STZ組腎皮質(zhì)組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組腎皮質(zhì)組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)被抑制（P＜0.001）。見圖2。免疫組化染色結(jié)果顯示galectin-3主要表達(dá)于腎小球中，腎小管中未見表達(dá)。見圖3。p-ERK1/2主要表達(dá)在腎小球中，腎小管亦有少量表達(dá)。見圖4。

圖2 各組小鼠腎皮質(zhì)中g(shù)alectin-3與p-ERK1/2蛋白Western blot結(jié)果

圖3 各組小鼠腎皮質(zhì)galectin-3免疫組化染色結(jié)果

圖4 各組小鼠腎皮質(zhì)p-ERK1/2免疫組化染色結(jié)果

2.4 AS-Ⅳ對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠腎組織病理學(xué)形態(tài)的影響

對腎臟組織切片分別進(jìn)行PAS染色可見Control組腎內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰完整，形狀規(guī)則，腎小球系膜基質(zhì)未見增生；STZ組中可見系膜基質(zhì)增多，系膜擴(kuò)張，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與STZ組比較，STZ+AS-Ⅳ組系膜基質(zhì)沉積程度明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5-6。

圖5 各組小鼠腎組織切片PAS染色

圖6 各組小鼠腎小球系膜基質(zhì)面積比較

3 討論

腎小球肥大是DKD早期的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)，是引起腎臟結(jié)構(gòu)不可逆改變的始動因素，是最終引起終末期腎病的初始病理表現(xiàn)。在這一變化中，腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）聚集起了重要的作用。作為AGEs的受體之一，galectin-3與糖尿病及其并發(fā)癥關(guān)系密切，galectin-3通過其介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)及AGEs受體作用等多種生物學(xué)效應(yīng)參與了DKD的發(fā)生、發(fā)展，可能成為該病治療的潛在新靶點。研究表明，galectin-3在2型DKD中的表達(dá)較正常人明顯增多，且與蛋白尿呈正相關(guān)，與腎功能呈負(fù)相關(guān)，galectin-3與2型DKD的進(jìn)展呈獨立相關(guān)性［3］。與其他腎臟疾病比較，DKD患者腎組織內(nèi)galectin-3的表達(dá)明顯升高［6］。Galectin-3在 DKD高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，高表達(dá)的galectin-3可促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖［7］。與既往研究一致，本研究顯示1型糖尿病小鼠腎小球存在系膜細(xì)胞增殖及系膜基質(zhì)增生，腎皮質(zhì)組織中g(shù)alectin-3蛋白含量顯著增加，這提示糖尿病系膜基質(zhì)增生可能與galectin-3的高表達(dá)有關(guān)。

ERK1/2信號通路在DKD的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。ERK1/2信號通路的活化可導(dǎo)致DKD早期ECM增生［8］。高糖刺激下腎小球系膜細(xì)胞ERK1/2信號通路被激活，可促進(jìn)ECM的合成并抑制其降解［9］。高糖環(huán)境下多種細(xì)胞因子均可激活ERK1/2信號通路，galectin-3可能是激活ERK1/2信號通路的重要細(xì)胞因子之一。既往研究表明: galectin-3的下調(diào)導(dǎo)致MEK/ERK信號通路活性降低，并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［10］。Galectin-3可通過激活MEK/ERK信號通路促進(jìn)體外高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞的增殖，沉默galectin-3后，MEK/ERK信號通路受到抑制［11］。本研究結(jié)果顯示1型糖尿病小鼠腎組織中ERK1/2信號通路存在顯著活化，galectin-3可能通過提高ERK1/2磷酸化水平，激活ERK1/2，從而調(diào)控DKD腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增生，進(jìn)而影響DKD的發(fā)生、發(fā)展。

AS-IV是黃芪的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、清除氧自由基、降血糖及抗衰老等多種藥理作用［12］。越來越多的研究表明，AS-IV對DKD腎臟具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用與抑制MEK1/2-ERK1/2-RSK2信號通路［13］、減輕炎癥反應(yīng)［5］、抑制足細(xì)胞凋亡［14］、調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量調(diào)控［15］等多種機(jī)制有關(guān)。在本研究中首次發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ對galectin-3、ERK1/2均有顯著抑制作用，這提示AS-Ⅳ對DKD腎臟的保護(hù)機(jī)制可能與抑制galectin-3/ ERK1/2信號通路有關(guān)。

綜上所述，AS-Ⅳ對STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠腎臟有明顯的保護(hù)作用，可減少蛋白尿，減輕腎組織損傷，其作用機(jī)制可能與抑制galectin-3/ERK1/2信號通路，進(jìn)而抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增生有關(guān)。該研究為AS-IV防治DKD提供了新的證據(jù)及可能靶點。