微生物組技術(shù)分析犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群特征

張玉珠，鄭慧華，劉祥雨，2，楊濘毓，2，杜崇濤*，謝光洪*

（1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.謝博士動物醫(yī)院，吉林 長春 130062）

作為臨床上的常見疾病，犬子宮蓄膿是指犬子宮腔內(nèi)有大量的膿液并伴有子宮內(nèi)膜炎和子宮內(nèi)膜異常增生，是未絕育母犬常見的子宮疾?。?］。子宮蓄膿是一種潛在的威脅生命的疾病，若治療不及時，可能會有致命的后果。臨床上對犬子宮蓄膿最常見的治療方法是卵巢子宮切除術(shù)。盡管該方法可降低患犬的死亡率，但有研究表明絕育（即卵巢子宮切除）對犬的健康存在潛在威脅，甚至激發(fā)某些疾病，如癌癥［2-3］、骨科疾病［4-5］和肥胖［6］等。犬子宮蓄膿可能是機(jī)體內(nèi)激素和細(xì)菌共同作用造成的［7］，但迄今為止，其發(fā)病機(jī)制和規(guī)律尚不清晰。

在人類生殖道系統(tǒng)的研究中，子宮作為重要的生殖器官，臨床上伴發(fā)各種疾病如慢性子宮內(nèi)膜炎，子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等，嚴(yán)重影響女性的生殖和身心健康。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)子宮類疾病發(fā)生時，其子宮內(nèi)部存在豐富的微生物組，如子宮內(nèi)膜炎患者的子宮內(nèi)主要菌群有酸桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門［8］。而與人類生活息息相關(guān)的伴侶動物犬在子宮蓄膿時是否有子宮內(nèi)菌群的參與，這一研究在國際上是空白的。因此，本研究首次通過16S rRNA 測序技術(shù)分析犬子宮蓄膿病例的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織的菌群特征，為該病的預(yù)防和治療提供了微生物學(xué)新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

19 份子宮膿液和9 份子宮內(nèi)膜均來自長春市謝博士動物醫(yī)院的確診病例，通過卵巢子宮切除術(shù)將切除的組織立馬在無菌操作臺，將子宮表面用碘伏擦拭干凈，用手術(shù)刀片切開子宮，在相同位置取適量的膿液放于1.5 mL 無菌Ep 管中，編碼為PB001-PB011，PBB001-PBB008，即為PB 組；用無菌手術(shù)刀在采取膿液的相同位置刮取適量子宮內(nèi)膜組織放于1.5 mL 無菌Ep 管中，編碼為PP001-PP009，即為PP 組；并迅速放入-80℃冰箱保存。

1.2 總DNA 提取與檢測

采用TIANGEN 試劑盒對犬子宮蓄膿病例的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織樣本提取細(xì)菌總DNA，具體的操作步驟嚴(yán)格按照TIANGEN 試劑盒說明書，之后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測了DNA的濃度和純度。

1.3 PCR 擴(kuò)增與高通量測序

樣本DNA 通過檢測合格之后，用無菌用水將適量DNA 樣本稀釋至1 μg·μL-1并放置于離心管中，作為擴(kuò)增模板。以515F 和806R為引物選取細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增：（熱循環(huán)包括98 ℃預(yù)變性1 min；30個循環(huán)（98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；72 ℃終延伸5 min），然后在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。將PCR 產(chǎn)物以等密度比例進(jìn)行混合，然后用Qiagen 凝膠提取試劑盒（Qiagen，Germany）進(jìn)行純化，混合PCR 產(chǎn)物。使用建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)檢驗合格之后，使用NovaSeq PE250 進(jìn)行上機(jī)測序，以上均由諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對測序所得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾后，會得到有效數(shù)據(jù)，從而使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。然后在有效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），使用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計 算Shannon、Simpson、Chao 1、ACE、Coverage 數(shù)據(jù)進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)分析樣本犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膿汁菌群和子宮內(nèi)膜菌群的豐富度和多樣性。使用Beta 多樣性來分析不同樣本間的差異程度。用LEfSe 分析尋找兩組間顯著差異性物種。

1.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS18.0 軟件統(tǒng)計和分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群OTUs 分析

為研究犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織菌群情況，通過16S rRNA 基因測序方法對19例患犬的子宮內(nèi)膿液（PB 組）和9 例患犬子宮內(nèi)膜組織（PP 組）的細(xì)菌進(jìn)行測序，從而比較分析兩者菌群特征。PB 組和PP 組共有28 份樣本，經(jīng)Illumina NovaSeq 測序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到2 243 247 條優(yōu)化序列，再進(jìn)行嵌合體過濾，得到1 697 886 條有效數(shù)據(jù)。為了研究各樣本的物種組成，以97%的一致性進(jìn)行了OTUs 聚類分析（圖1），發(fā)現(xiàn)PB 組OTU 數(shù)量有5738個，PP 組OTU 數(shù)量有3788個，2 組一共有7741個OTU 數(shù)量，其中1785個OTUs 是2 組共有的，PB 組特有的OTU 數(shù) 量為3953個，PP 組 特 有 的OTU 數(shù) 量為2003個。

圖1 PB 組和PP 組組間韋恩圖Fig.1 Venn diagram in different groups

2.2 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群Alpha 多樣性比較

PB 組和PP 組2 組樣本在97%一致性閾值下的Alpha Diversity 多樣性分析表明，指數(shù)Shannon、Simpson、Chao1、Ace 在2 組之間均無顯著性差異（P＞0.05），指數(shù)Coverage（即樣本菌群覆蓋率）均大于99%，說明樣本中沒有被測出來的概率極低。稀釋曲線（A）的繪制，可以直觀反應(yīng)測序樣本數(shù)量的合理性（圖2）。Rank Abundance 曲線（B）的繪制，直觀反應(yīng)了樣本中物種的豐富度和均勻度。2者表明，本試驗測序取樣數(shù)量合理。

圖2 犬的子宮蓄膿樣本稀釋曲線（A）和等級聚類曲線（B）Fig.2 Rarefaction Curve（A）and Rank Abundance（B）of canine pyometra samples

2.3 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群的物種相對豐富度

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取PB 組19 份樣本和PP 組9 份樣本（圖3A）以及PB 組和PP 組（圖3B）在門水平上細(xì)菌豐富度排名前10 的物種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PB 組優(yōu)勢物種有變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteriota）和脫硫菌門（Desulfobac?terota），豐富度依次為0.611、0.229、0.042、0.010和0.003；PP 組優(yōu)勢物種有變形菌門（Proteobacte?ria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroide?tes）、脫 硫 菌 門（Desulfobacterota）和A放 線 菌 門（ctinobacteriota），豐 富 度 依次為0.696、0.074、0.026、0.014 和0.012。其 中，PB 組 變 形 菌 門（Proteobacteria）顯著低于PP 組，而厚壁菌門（Fir?micutes）顯著高于PP 組（P＜0.05）。

圖3 PB 組和PP 組在門水平上相對豐度比較Fig.3 Comparison of phylum horizontal relative abundance of PB group and PP group

2.4 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群Beta 多樣性比較

主 坐 標(biāo) 分 析（principal co-ordinate analysis，PCoA）是在空間中，不同組樣本間在二維平面上呈現(xiàn)出來的相似的距離。而樣本間的距離是通過在二維平面坐標(biāo)軸上所進(jìn)行的不同角度的投影，從而找出最可以反應(yīng)出原始距離分布的前2個坐標(biāo)軸的值，常用于微生物的Beta 多樣性分析。結(jié)果表明，如果在二維平面上兩組樣本的距離越接近，表明兩組樣本的物種組成結(jié)構(gòu)是越相似的，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的各樣本就會在二維平面上傾向于聚集在一起，而群落差異很大的各樣本就會遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。由圖4可知，PB 組與PP 組樣本菌群群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異。

2.5 犬子宮蓄膿宮內(nèi)菌群LDA 差異貢獻(xiàn)分析

LDA Effect Size 分析是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高緯度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識的分析工具。LDA 值分布柱狀圖中展示了LDA Score（線性判別分析影響值）大于4 的顯著差異物種，如圖5A所示，LDA Score大于4 的biomarker 共有30個，包括：脫硫菌屬（De?sulfuromonadia）、志賀氏桿菌屬（Escherichia_Shi?gella）、大腸埃希菌屬（Escherichia_coli）、潘多拉菌屬（Pandoraea）、支原體目（Mycoplasmatales）、支原體科（Mycoplasmataceae）、綠膿桿菌屬（Pseudo?monas_aeruginosa）、嗜 血 桿 菌 屬（Haemophilus）等。進(jìn)化分支圖圓圈由內(nèi)向外代表了由門至屬的分類級別，小圓圈的直徑大小代表了相對豐富度，紅色節(jié)點表示犬子宮蓄膿宮內(nèi)膿汁組中起到重要作用的微生物，主要有支原體科（Mycoplasmatace?ae）、支 原 體 目（Mycoplasmatales）、希 萬 氏 菌 科（Shewanellaceae）、交替單胞菌目（Alteromonad?ales），綠色節(jié)點表示犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膜組中起重要作用的微生物，黃色節(jié)點表示無顯著差異的物種。

圖5 PB 組與PP 組LDA 值分布柱狀圖（A）和進(jìn)化分布圖（B）Fig.5 LDA bar（A）and evolutionary（B）of PB group and PP group

3 討論

近幾十年，與伴侶動物犬繁殖有關(guān)的子宮類疾病逐漸增多，這給犬的健康造成了嚴(yán)重的威脅，同時給飼養(yǎng)犬的寵主帶來了極大的身心和經(jīng)濟(jì)損失［9］。母犬是最容易診斷出嚴(yán)重的子宮病理變化的物種，而且診斷的患病率明顯更高，這表明可能存在一些特定的機(jī)制可以導(dǎo)致犬的子宮內(nèi)膜功能紊亂［9］。犬子宮蓄膿常發(fā)生于中老年母犬［9-10］，但更年輕化的犬中也偶有發(fā)生［11］。激素和細(xì)菌因素對子宮蓄膿的發(fā)展起著重要作用。大腸桿菌是犬子宮蓄膿中最易分離出來的細(xì)菌，主要粘附在孕激素刺激的子宮內(nèi)膜受體上，可導(dǎo)致感染［12］。目前，盡管學(xué)者對犬子宮蓄膿進(jìn)行了廣泛研究，但該疾病的發(fā)病機(jī)制仍是不清楚的。

子宮作為哺乳動物的生殖器官，臨床上伴發(fā)各種疾病如慢性子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等，且患者的子宮內(nèi)存在豐富的微生物組。目前關(guān)于犬生殖道微生物群的信息很少，所有可用的數(shù)據(jù)都是通過培養(yǎng)技術(shù)獲得的。有研究已證實，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)未能檢測到90%的優(yōu)勢菌群，低估了多樣性［13］。迄今，16S rRNA 高通量測序技術(shù)已被廣泛用于腸道［14］、口腔［15］、乳房［16］、胰腺［17］、陰道［18］病變部位等的菌群組成結(jié)構(gòu)研究。而子宮中的微生物群在化膿性子宮發(fā)育中的作用是怎么樣的，可以用新的測序方法進(jìn)行更詳細(xì)的研究。在以往的研究中，對人的子宮內(nèi)菌群研究較少，有關(guān)犬子宮蓄膿的子宮內(nèi)菌群的特征分析在尚未報道。本研究通過16S rRNA 基因測序技術(shù)對犬子宮蓄膿的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織的菌群進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)患犬的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織均存在菌群且無明顯差異，在門水平上主要是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteriota）和脫硫菌門（Desulfobacterota）；發(fā)現(xiàn)患犬子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織的Alpha 多樣性無明顯差別（P＞0.05）。但通過Beta 多樣性分析發(fā)現(xiàn)兩組樣本的菌群群落結(jié)構(gòu)存在差異。其中，患犬子宮內(nèi)膿液中的變形菌門（Proteobacte?ria）豐富度明顯低于子宮內(nèi)膜組織，而厚壁菌門（Firmicutes）明顯高于子宮內(nèi)膜組織，另外放線菌門（Actinobacteriota）和 脫 硫 菌 門（Desulfobacte?rota）在2 者內(nèi)的豐富度也存在差異。為進(jìn)一步篩選出2 組間顯著差異的特異性細(xì)菌，進(jìn)行了LDA差異貢獻(xiàn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 組有30個物種存在顯著性差異，其中患犬子宮內(nèi)膿液中的志賀氏桿菌屬（Escherichia_Shigella）、大腸埃希菌屬（Esche?richia_coli）顯著高于患犬子宮內(nèi)膜組織，而綠膿桿菌 屬（Pseudomonas_aeruginosa）、嗜 血 桿 菌 屬（Haemophilus）顯著低于患犬子宮內(nèi)膜組織。因此，本研究通過對犬子宮蓄膿子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織菌群的對比分析，以期為小動物臨床子宮疾病微生物學(xué)防治提供參考。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)子宮蓄膿患犬的子宮內(nèi)膿液和子宮內(nèi)膜組織均存在特異的微生物菌群和差異性物種，為小動物臨床子宮疾病的微生物學(xué)防治提供了新思路，而目前犬子宮蓄膿的發(fā)病機(jī)理尚不清晰，還需進(jìn)一步的研究。