四環(huán)素降解菌的篩選及降解特性研究

康宗利，劉爽，楊建，王新宇，靳雨松，楊玉紅

（沈陽農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866）

四環(huán)素是使用最廣泛的抗生素之一［1］，不僅大量用于人和動物的疾病治療，也作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖中廣泛應用［2-3］。四環(huán)素類抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用會引起藥物殘留，殘留的四環(huán)素在環(huán)境中降解、遷移，最終會造成水資源和環(huán)境的污染，對人類健康帶來影響［4］。清除土壤和水體中四環(huán)素類抗生素污染，減少其對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成的危害，已成為目前迫切需要解決的問題之一［5］。生物修復技術的出現(xiàn)，為治理環(huán)境污染帶來了希望［6］。微生物修復技術具有條件簡單、容易控制、成本較低、專一性較強、降解徹底、無二次污染等特點，因此成為了現(xiàn)階段處理抗生素污染的最理想的方法［7］。從90年代開始，微生物降解作為處理環(huán)境污染的一種新技術、新方向，在國內(nèi)得到很好的發(fā)展，同時也取得了一些成果［8］。司美茹等［9］在油田的土壤中篩選出一株高效降解原油的菌株，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)降解率可達到72.6%。李明石等［10］在長期受多菌靈農(nóng)藥污染的土壤中，以不同環(huán)境為介質富集篩選，獲得1 株耐冷多菌靈高效降解菌，獲得的降解菌可在100 mg·L-1的多菌靈中生長。陶美［11］從活性污泥中篩選分離得到了1 株對四環(huán)素具有降解能力的克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。趙晨光［12］從新鮮豬糞及堆肥堆體中篩選出4 株四環(huán)素類抗生素降解菌：鶉雞腸球菌、糞腸球菌、庫特氏菌、屎腸球菌。從目前的研究成果可以看出，已報道的四環(huán)素降解菌種類較少，函需補充新的菌種資源。因此，開展四環(huán)素類抗生素污染的微生物修復技術研究，篩選不同類型的四環(huán)素類抗生素的高效降解菌株，擴大抗生素降解微生物菌種庫是非常必要的。本試驗將從長期受四環(huán)素類抗生素污染的土壤中，篩選分離出能夠以四環(huán)素為唯一碳源的降解菌株，并對其生長和降解特性做全面的研究，為處理環(huán)境中四環(huán)素類抗生素污染的生物方法提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗土樣

采自本溪市某制藥廠附近污染場地，采用多點隨機采樣法取表層土（0～20 cm），采用四分法分別取1000 g 左右的污染土，用無菌袋盛裝帶回試驗室，自然風干，去除土壤中水分，攤開壓碎，剔除雜物，過20 目尼龍篩。

1.2 試驗方法

1.2.1 四環(huán)素抗性菌株的篩選培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基：KH2PO4NaCl 0.2 g、（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.1 g、K2HPO40.5 g、MnSO4·H2O 0.01 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、水1000 mL、pH 7.0。

富集培養(yǎng)基：配制四環(huán)素終濃度為20、40、60、80、100 mg·L-1的培養(yǎng)基。

篩選培養(yǎng)基：在滅菌無機鹽培養(yǎng)基和LB 中加入四素類抗生素、使其抗生素濃度為20、40、80、100 mg·L-1的培養(yǎng)基。

1.2.2 四環(huán)素母液配制

在100 mL 滅菌的水中加入四環(huán)素藥品1 g 溶解，得到濃度10 g·L-1的母液。

1.2.3 菌種的富集培養(yǎng)

稱取10 g 土壤，添加到250 mL 的錐形瓶中，加入無菌水100 mL，制成土壤懸液，搖床轉速100 r·min-1震蕩培養(yǎng)1～2 d。

1.2.4 四環(huán)素降解菌的篩選馴化

取5mL 富集培養(yǎng)后的菌懸液接種到100 mL四環(huán)素為20 mg·L-1的LB 培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)5 d，馴化，再取馴化后的菌液5 mL 于100 mL 四環(huán)素濃度為40 mg·L-1的LB 培養(yǎng)基中進行5 d 的馴化培養(yǎng)，以此類推直至四環(huán)素類抗生素濃度為80 mg·L-1。

1.2.5 四環(huán)素降解菌的分離純化

取1 mL 四環(huán)素濃度80 mg·L-1的菌群培養(yǎng)液，加入到9 mL 的無菌水中，采用系列稀釋倒平板法，培養(yǎng)、觀察、純化，最后用平板劃線法在篩選培養(yǎng)基上進行分離，挑取平板上的純菌落保存。

1.2.6 降解菌的復篩

分離純化的單菌落起初是有可能不完全具備四環(huán)素的降解能力的，仍然需要進行檢測菌株對四環(huán)的降解能力，再進一步的進行篩選從而選取最佳的高效的降解菌株，便于進行下一步的研究。在四環(huán)素濃度為60 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)，每天取樣1次測OD365，并計算其降解率，其降解率按下式計算。

1.2.7 降解菌的四環(huán)素耐受能力檢測

將菌懸液于離心后，用無菌水稀釋104倍，得到最低濃度菌液。吸取降解菌菌懸液各300 μL 涂布 到 四 環(huán) 素 濃 度為20、50、100、150、200、250 mg·L-1的固體LB 培養(yǎng)板上，觀察培養(yǎng)過程中的菌落情況。

1.2.8 抗性菌株對四環(huán)素降解的動力學曲線比較

將四環(huán)素抗性菌株分別接種于10 mL 80 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后的第1 天開始取樣，每天同時間同地點取4 mL 的培養(yǎng)液，測其OD365，計算降解率，其縱坐標為抗性菌株的降解率，取樣時間為橫坐標，繪制四環(huán)素的動力曲線，確定抗性菌株對四環(huán)素的最佳降解時間，同時設置空白對照組。

1.2.9 降解菌的形態(tài)觀察

通過復篩得到具有最佳降解能力的四環(huán)素菌株，觀察菌落形態(tài)，并參照《微生物實驗技術》進行革蘭氏染色，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)等。

1.2.10 降解菌株的分子鑒定

細菌基因組DNA 的提?。翰捎肧DS-CTAB改良法。

細菌基因組PCR 反應條件如表1。

表1 PCR 擴增反應體系Table 1 PCR amplification reaction system

PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后，送樣測序，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。所得測序結果進行Blast 比對分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.11 菌株干重標準曲線制作

取活化后的菌懸液離心、洗滌3次后，在紫外分光光度計測定其吸光度，配制得到OD600為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 的菌株懸液，取每種OD 值分別對應的菌株懸液各100 mL，4000 r·min-1離心沉淀后放入烘箱，60 ℃、24 h 烘干后稱重，測得OD 值與對應的菌體干重建立坐標，繪制標準曲線。

1.2.12 菌株在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長曲線的測定

在四環(huán)素濃度為80 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基中，接種腸桿菌種子液，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉速180 r·min-1，觀察其生長情況。每天取5 mL 的培養(yǎng)液，以無菌水為參比，在OD600下測定吸光度。

1.2.13 不同條件對陰溝腸桿菌去除四環(huán)素作用的影響

以基礎培養(yǎng)基為對照，對影響發(fā)酵的各個條件進行優(yōu)化，優(yōu)化每個成分時，將其設成幾個濃度，其他成分不變，接種后搖床培養(yǎng)，取未加入陰溝腸桿菌的培養(yǎng)基為空白對照，每24 h 取4 mL 的培養(yǎng)液分別在OD365和OD600測定四環(huán)素濃度及細菌生長量。

基 礎 培 養(yǎng) 基：（NH4）2SO42.0 g、K2HPO40.5 g、KH2PO4NaCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.1 g、MnSO·H2O 0.01 g、FeSO4·7H2O 0.01g、四環(huán) 素80 mg，水1000 mL。 不 同 因 素、水 平 見下表。

1.2.14 掃描電鏡觀察

參考黎昀昀［13］的方法，樣品經(jīng)洗滌、固定、脫水、置換、干燥，于電子顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 四環(huán)素抗性菌株的初步分離篩選

經(jīng)過幾周的富集培養(yǎng)、篩選和馴化，可以明顯觀察到富集液中菌株的生長（圖1）。4種菌對四環(huán)素表現(xiàn)出很好的抗性，在四環(huán)素濃度為80 mg·L-1的培養(yǎng)基上生長良好。

圖1 4 株四環(huán)素抗性菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 4 tetracycline resistant strains

2.2 菌株的復篩結果

對初篩得到的4個菌株進行復篩（圖2），可以看出Ly-1507 和Ly-2507 菌株對四環(huán)素的去除效果 好 于Ly-3507 和Ly-4507；菌 株Ly-1507、Ly-2507 在以四環(huán)素做唯一碳源時去除率分別從最開始 的29.60%、27.35% 到 第7 天 的73.59%、67.47%，降解效果明顯。Ly-3507、Ly-4507 的去除率只有53.26、48.64%。說明菌株Ly-1507 和Ly-2507 具有更好的四環(huán)素去除能力。

圖2 4 株菌株對四環(huán)素的去除結果Fig.2 Removal results of tetracycline by 4 strains

2.3 菌株的四環(huán)素耐受能力測定結果

所篩菌株在四環(huán)素濃度分別為20、50、100、150、200，250 mg·L-1的LB 培養(yǎng)基平板上檢測菌株完全被抑制的濃度經(jīng)2 d 培養(yǎng)觀察，結果如表2所示，菌株Ly-1507 在四環(huán)素20、50、100、150 mg·L-1濃度下菌落生長快速旺盛，在四環(huán)素濃度為250 mg·L-1時才被抑制生長，出現(xiàn)較為明顯的菌落數(shù)量削減。說明菌株Ly-1507 具有更強的四環(huán)素耐受能力，因此本文選擇菌株Ly-1507 進行后續(xù)研究。

表2 不同條件的因素和水平Tab.2 Factors and levels of different conditions

表3 菌株對不同濃度四環(huán)素的耐受結果Table 3 Tolerance results of strains to tetracycline at different concentrations

2.4 菌株Ly-1507 對四環(huán)素降解的動力學曲線比較

如圖3所示，在試驗中發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長，四環(huán)素抗性菌株對四環(huán)素的去除率出現(xiàn)先增大后平穩(wěn)的趨勢。當達到第7 天時，菌株Ly-1507對四環(huán)素的降解率為75.85%，7 d 后增長的趨勢相對平緩，因此，菌株Ly-1507 的最佳降解時間是為7 d。

圖3 抗性菌株對四環(huán)素降解的動力學曲線Fig.3 Kinetic curve of tetracycline degradation by resistant strains

2.5 菌株Ly-1507 分子鑒定

2.5.1 菌株Ly-1507 的電泳檢測結果

以菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR 擴增后，進行電泳，結果如圖5所示，可以看出提取的菌株DNA 的特異性條帶，得到1 條1400 bp 左右的基因片段，說明核苷酸序列約為1400 bp。

圖4 Ly-1507 菌株電泳圖Fig.4 Electrophoretic map of Ly-1507 strain

2.5.2 構建系統(tǒng)發(fā)育樹和種屬分析

經(jīng)測定所獲得的目的片斷長1400 bp，序列如圖5。

圖5 Ly-1507 目的片斷基因序列Fig.5 Ly-1507 objective fragment gene sequence

測序后序列在Genbank 中，進行BLAST 程序比對，采用MEGA 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。由圖6可以看出，菌株Ly-1507 與陰溝腸桿菌（登錄號：KX233847.1）相似度達98%，鑒定菌株Ly-1507為陰溝腸桿菌，命名為陰溝腸桿菌（Entero?bacter cloacae）Ly-1057。

圖6 菌株Ly-1507 系統(tǒng)進化樹Fig.6 phylogenetic tree of strain Ly-1507

2.6 菌株對四環(huán)素吸附性能的測定

2.6.1 菌株干重的標準曲線

以吸光度為縱坐標，菌株干重為橫坐標繪制菌株干重標準曲線如圖所示，菌株Ly-1057 的回歸方程為y=8.893 9x+0.009 2，相關系數(shù)R2=0.999 3；

2.6.2 菌株Ly-1057 在四環(huán)素培養(yǎng)基中生長曲線的測定

當四環(huán)素作為唯一的碳源時，陰溝腸桿菌Ly-1057 隨時間的生長情況如圖8所示。當接種后的第1 天內(nèi)腸桿菌Ly-1057 生長速率較緩慢，造成這一原因可能是菌株對新的生長環(huán)境需要一定的時間去適應。在完成適應周期后，2～7 d 便開始大量代謝繁殖且菌株干重增長較為迅速，處于對數(shù)期，當?shù)? 天菌體進入穩(wěn)定期，生物量趨于平緩；8 d后，生物量基本保持不變，進入衰亡期?？梢哉J為前7 d 是四環(huán)素的最佳降解時間和菌株生長的最佳時間。

圖7 菌株Ly-1057 生物量的標準曲線Fig.7 Standard curve of dry weight of myceliu

圖8 菌株Ly-1057 的生長曲線Fig.8 Growth curve of strain Ly-1057

2.6.3 不同pH 條件對菌株Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響

pH 值是微生物降解四環(huán)素的重要環(huán)節(jié)之一，在參與降解酶的活性和菌株的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用。pH 也會影響細胞膜蛋白及胞外水解酶的活性，從而影響營養(yǎng)物質的正常吸收和運轉［14］。由圖9可知，當pH 值為4～7 時，菌株對四環(huán)素的去除率和生物量均隨著pH 值的增加而上升，且當培養(yǎng)基初始的pH 值為7.0 時對四環(huán)素的去除效果較好，在7 d 時達到了最大值75.53%。當pH 值為8.0 時、生物量和四環(huán)素去除率均出現(xiàn)下降趨勢。這表明酸性和堿性條件都會影響菌株的穩(wěn)定性或者影響菌株降解酶的活性。

圖9 不同的pH 條件對菌株Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響Fig.9 Effects of different pH conditions on tetracycline removal by Strain Ly-1057

2.6.4 不同接種量對菌株Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響

由圖10可知，隨著接種量的逐漸增加，菌株干重也呈現(xiàn)增加的趨勢，菌種的去除率也隨之增加。3%的接種量時，四環(huán)素的去除效果最好，去除率為75.32%，生物量為1.297 g·L-1。陰溝腸桿菌Ly-1057 對四環(huán)素的去除率和生物量的增長呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當接種量為4%，菌株對四環(huán)素的去除率為70.07%，生物量為1.26 g·L-1。隨著接種量的增加反而生物量也是有所下降，這種情況的出現(xiàn)可能是由于培養(yǎng)基中的碳源、氮源或其它因素導致的，接種量取決于四環(huán)素的種類和菌體的性質，菌體的自身的能力強，接種量就較少，最佳接種濃度為3%。

圖10 不同接種量對菌株Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響Fig.10 Effects of different inoculum amount on tetracycline removal by STRAIN Ly-1057

2.6.5 不同底物濃度對菌株Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響

由圖11可知，不同的初始底物濃度對四環(huán)素菌株生長的影響，當無機鹽培養(yǎng)基中底物濃度為80 mg·L-1時，四環(huán)素降解率達到最大，7 d 后的去除率為68.63%，在80 mg·L-1的底物濃度下生物量為1.56 g·L-1。生物量與去除率存在一定的相關性。當四環(huán)素濃度為40～60 mg·L-1時，菌株生物量由1.15 上升到了1.23，只上升到0.08。造成這一現(xiàn)象的原因可能是以四環(huán)素作為唯一的碳源，沒有其它的碳源四環(huán)素對陰溝腸桿菌具有毒性，其碳源不能滿足菌株快速繁殖的需求［15］。40～100 mg·L-1的生長量并不是隨著底物濃度的增加而増加的。四環(huán)素濃度對菌株的去除能力有一定的影響，但是在100 mg·L-1和120 mg·L-1的四環(huán)素初始濃度下，菌株的降解能力以及微生物的活性被明顯抑制?？梢姼邼舛鹊乃沫h(huán)素會導致菌株對四環(huán)素去除能力下降，菌株的降解特性是存在于一定的濃度限度內(nèi)的，因此故選用四環(huán)素濃度達80 mg·L-1為最佳的底物濃度。

圖11 不同底物濃度對菌株Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響Fig.11 Effect of different substrate concentrations on the removal of tetracycline by strain Ly-1057

2.6.6 不同可溶性淀粉濃度對Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響

由圖12可知，當不添加可溶性淀粉作為碳源時，四環(huán)素的去除率為58.58%，當可溶性淀粉為10、20、30、40 mg·L-1的外加碳源時，去除率分別為60.38%、64.36%、74.58%、62.03%，可以看出腸桿菌在加入20 mg·L-1可溶性淀粉后菌株生長最優(yōu)，菌絲干重達1.61 g·L-1。產(chǎn)生降解酶的數(shù)量多，其原因可能是加入少量碳源能夠促進降解酶的產(chǎn)生數(shù)量和菌株增長，因而降解率增加［15］。這一降解結果與許曉玲的四環(huán)素降解菌的選育、鑒定及其降解特性的結果一致。

圖12 不同可溶性淀粉濃度對Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響Fig.12 Effects of different soluble starch concentrations on the removal of tetracycline by Ly-1057

2.6.7 不同濃度酵母浸粉對Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響

從圖13可以看出在不同濃度酵母浸粉條件下，四環(huán)素降解菌的降解效率有明顯差異；在外加酵母浸粉濃度為20 mg·L-1時，腸桿菌的生長情況和對四環(huán)素的降解效率最優(yōu)，對四環(huán)素的去除率達到75.09%，菌株增長量為1.43 g·L-1。這表明適量的酵母浸粉作為外加氮源有助于提高Ly-1057 對四環(huán)素的去除率。添加酵母提取物后降解率的顯著提高可能是由于微生物產(chǎn)生某些有利于四環(huán)素降解的酶的存在［16］。

圖13 不同酵母浸粉濃度對Ly-1057 去除四環(huán)素作用的影響Fig.13 Effects of different yeast extract concentrations on the removal of tetracycline by Ly-1057

2.6.8 掃描電鏡結果

選擇吸附效率最高的菌株陰溝腸桿菌Ly-1057 進行掃描電鏡觀察（圖14）。由掃描電鏡結果可看出，正常菌株菌體外形清晰，呈桿狀，排列不規(guī)則，可清晰看到菌體的皺紋，表面粗糙，有大小不一的凹陷，這可以增大了四環(huán)素與菌體的接觸面積，為四環(huán)素與菌體的結合提供更多的位點。在四環(huán)素濃度為80 mg·L-1的條件下，腸桿菌Ly-1057 細胞表面結構明顯褶皺，細胞內(nèi)陷產(chǎn)生形變，說明陰溝腸桿菌Ly-1057 吸附了一定量的四環(huán)素，且四環(huán)素對菌體表面結構產(chǎn)生了破壞作用。

圖14 陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）Ly-1057 掃描電鏡結果Fig.14 Sem results of Enterobacter Cloacae Ly-1057

3 討論

抗生素是一類潛在的環(huán)境污染物，其殘留會造成嚴重的生態(tài)污染，其中四環(huán)素在環(huán)境中的殘留問題一直是近幾年研究的熱點。研究表明，每年有大量四環(huán)素以尿液或糞便的形式釋放到水生環(huán)境中，增加了其微生物種群的抗生素耐藥性，并產(chǎn)生毒性更高的副產(chǎn)物［16］。由于傳統(tǒng)的廢水處理方法不能有效地消除四環(huán)素，先進的氧化工藝（AOPs）已被應用，這些AOPs 包括光化學、電化學和光催化技術，然而，這些工藝流程的高成本限制了它們的使用［17］。生物處理作為廢水處理領域的核心技術，操作簡單、廢水質量好、環(huán)境干擾低、成本低、礦化率高、對微生物適應性強，因而成為最適宜的處理方法。

好氧顆粒狀污泥技術是一種新開發(fā)的生物廢水處理方法，但通過這種工藝去除四環(huán)素的效果有限［18］。因此，篩選降解四環(huán)素的特異菌株，可為四環(huán)素污染的土壤和水體的生物修復及環(huán)境治理技術的研發(fā)提供理論依據(jù)。Migliore 等利用糙皮側耳菌在實驗室條件下實現(xiàn)了四環(huán)素類抗生素OTC 的降解，并通過質譜分析發(fā)現(xiàn)該菌通過菌絲吸收OTC 后再進行降解，推測OTC 中的酰胺基轉化為乙?；蔀?-乙?；?2-去酰胺土霉素（ADOTC），該種產(chǎn)物比OTC 的抗菌性低，具有較高的親油性，毒性相對較低［19］。真菌Pleurotus os?treatusmycelium 被證實能夠將土壤中的土霉素轉化為低毒或無毒產(chǎn)物，去酰胺土霉素可能為其主要降解產(chǎn)物［20］。除此之外，白腐真菌Trametes ver?sicolor表達的漆酶同樣也可以降解四環(huán)素，并消除其生態(tài)毒性［21］。本研究從長期受四環(huán)污染的土壤中分離篩選到1 株降解四環(huán)素的菌株，結合菌落形態(tài)和分子鑒定，將菌株Ly-1507 鑒定為陰溝腸桿菌，命名為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）Ly-1057。陰溝腸桿菌應用于污染土壤的四環(huán)素的去除還尚未有報道，陶美、趙晨光等人報道文獻克雷伯氏菌和大腸桿菌、變形桿菌對四環(huán)素具有較強的清除能力［11-12］，陰溝腸桿菌與克雷伯氏菌和大腸桿菌都屬于同一菌屬。

培養(yǎng)條件對菌株的生長和對四環(huán)素的降解能力有至關重要的影響［22］。適當?shù)奶嫉词枪泊x所必需的主要能量材料，可以促進共代謝細菌對四環(huán)素的降解。本文研究了外加碳源-可溶性淀粉和外加氮源-酵母浸粉菌株的生長和四環(huán)素的降解情況。初始pH為7.0 和80 mg·L-1四環(huán)素下，添加碳、氮源后的第7 天，可溶性淀粉和酵母浸粉均為20 mg·L-1時，菌株對四環(huán)素去除效果最佳，進一步確定了菌株Ly-1057 表現(xiàn)出良好的四環(huán)素降解能力的最佳降解條件。

4 結論

本文篩選出了1 株降解四環(huán)素的菌株—陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），并對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為其應用于污染土壤的四環(huán)素去除提供了堅實的理論基礎。