沼澤紅假單胞菌發(fā)酵提高黃芪甲苷含量的條件優(yōu)化

李保珍，劉琪，王鑫，賈璐，郭羽，樊金華

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801）

黃芪（Astragalus）是豆科多年生草本植物的干燥根，為我國傳統(tǒng)中藥材，含有黃芪多糖類、黃芪皂苷類、黃酮類和氨基酸等多種有效成分［1］，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿和斂瘡生肌等功效［2］。其中，黃芪甲苷是黃芪皂苷的主要活性成分，有明顯的抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、改善心臟收縮和舒張等功能［3-4］，也是《中國藥典》中黃芪質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測的標(biāo)志物［5］。但由于黃芪甲苷在黃芪中含量非常低，市場對黃芪的需求量在逐年增加，傳統(tǒng)使用方法已經(jīng)不能滿足社會的需求［6］。

中藥發(fā)酵最早記載于在我國漢代的中藥專著《神農(nóng)本草經(jīng)》，是傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法。以傳統(tǒng)中藥材為發(fā)酵原料，微生物以其自身特有的酶系使由纖維素、半纖維素等構(gòu)成的中藥材細(xì)胞壁發(fā)生裂解，促進(jìn)其有效成分的釋放，提高活性成分含量、提高藥效、降低成本和擴(kuò)大應(yīng)用范圍，已成為現(xiàn)代中藥研究的熱點［7］。陳麗艷等［8］研究報道，運用雙向發(fā)酵技術(shù)，黃芪經(jīng)側(cè)耳菌（Pleuro?tus ostreatus）發(fā)酵后多糖含量明顯增加，表明利用發(fā)酵技術(shù)可以使黃芪活性成分得到較大程度的釋放。郭羽等［9］利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevi?siae）發(fā)酵中藥黃芪，結(jié)果表明發(fā)酵對黃芪中多糖含量有一定影響，其產(chǎn)率與傳統(tǒng)法相比有一定提高；郭云霞等［10］通過甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（Bacil?lus methylotrophic）N-14 發(fā)酵黃芪后總多糖的含量提高了57.31%。刁歡等［11］研究顯示，經(jīng)黑曲霉（Aspergillus niger）固態(tài)發(fā)酵黃芪，黃芪中黃酮含量提高了2.29 倍。馬玉俊等［12］利用堅強芽胞桿菌-CX10（Bacillus firmus）發(fā)酵黃芪，黃芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到69.3%。迄今為止，在眾多發(fā)酵黃芪菌種報道中，沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomo?nas palustris）發(fā)酵黃芪的研究還未見報道。

沼澤紅假單胞菌是一種紫色非硫細(xì)菌，屬于變形菌門、紅螺菌科、紅假單胞菌屬。沼澤紅假單胞菌新陳代謝方式多樣，可以通過自然界存在的4種代謝模式進(jìn)行生長，包括光合自養(yǎng)、光合異養(yǎng)、化學(xué)自養(yǎng)和化學(xué)異養(yǎng)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、環(huán)保和醫(yī)藥等領(lǐng)域［13］。本文利用實驗室保藏的一株沼澤紅假單胞菌N 菌株發(fā)酵黃芪，探究發(fā)酵對黃芪中黃芪甲苷含量的影響，研究結(jié)果將為今后利用微生物發(fā)酵黃芪提供菌種資源以及中藥黃芪高效利用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palus?tris）N 菌株［14］，來自山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院光合細(xì)菌研究室。

1.1.2 試劑與儀器

黃芪購自榆林市廣濟(jì)堂中藥開發(fā)有限責(zé)任公司（產(chǎn)地內(nèi)蒙古）；黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司（批號：7604）；香草醛購自索萊寶（批號：114K011）；其它試劑均為分析純；BioTek 酶 標(biāo) 儀（BioTek Instruments，Inc）；HPX-9052MBE 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；湘立TGL16M 離心機（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；雷磁PHS-25 型數(shù)顯pH 計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；LFP-800T 高速多功能粉碎機（萊芙）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪

采用RCVBN 培養(yǎng)基［15］進(jìn)行黃芪液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。黃芪粉碎至40 目后按照1∶10 的料液比制備液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min 后在無菌條件下10%菌種接種量接菌，在溫度為30 ℃，光照強度為1500 lux 條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 黃芪甲苷的提取與測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：參照呂鳳嬌等［16］所述方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，利用酶標(biāo)儀在波長540 nm 處測定吸光度值。以黃芪甲苷溶液濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得吸光度值A(chǔ) 與黃芪甲苷溶液濃度C之間的線性回歸方程式為Y=0.010 9X+0.000 14，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 6。

（2）黃芪甲苷的提?。簠⒄蘸蠲廊绲龋?7］所述方法，取黃芪發(fā)酵液20 mL，置于振蕩器上振蕩60 min，轉(zhuǎn) 速為300 r·min-1，然 后 以4000 r·min-1離 心10 min，取上清液。將上清液置于分液漏斗中，加入20 mL 的正丁醇，進(jìn)行萃取。NaOH（濃度1%）洗滌3次后，蒸餾水洗至中性，收集正丁醇溶液，置于70 ℃揮干，用甲醇定溶于5 mL 容量瓶中備用。

（3）黃芪甲苷含量測定：參照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制所述方法進(jìn)行吸光度值測定，代入回歸方程計算其含量。

1.2.3 單因素試驗考察

在發(fā)酵溫度30 ℃，培養(yǎng)基初始pH 值7.0 和菌種接種量10%的條件下，分別發(fā)酵3、4、5、6 d，考察發(fā)酵時間對黃芪甲苷含量的影響。

在發(fā)酵溫度為30 ℃，菌種接種量為10%和發(fā)酵時間為5 d 的條件下，將培養(yǎng)基初始pH 值分別設(shè)計為6.2、6.6、7.0、7.4，考察培養(yǎng)基初始pH 值對黃芪甲苷含量的影響。

在發(fā)酵時間為5 d，培養(yǎng)基初始pH 值為7.0，菌種接種量為10%的條件下，將發(fā)酵溫度分別設(shè)計為25、30、35、40 ℃，考察發(fā)酵溫度對黃芪甲苷含量的影響。

在發(fā)酵溫度30 ℃，培養(yǎng)基初始pH 值7.0 和發(fā)酵時間為5 d 的條件下，將菌種接種量分別設(shè)計為6%、8%、10%、12%，考察菌種接種量對黃芪甲苷含量的影響。

1.2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、培養(yǎng)基初始pH 值、發(fā)酵溫度和菌種接種量4個因子，每個因子在3 水平下，以黃芪甲苷的含量為考察指標(biāo)對沼澤紅假單胞菌發(fā)酵對黃芪甲苷含量的影響進(jìn)行正交試驗并作方差分析。因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal design

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法

試驗數(shù)據(jù)以Excel 2019 軟件整理數(shù)據(jù)和Origin 8.5 作圖，同時采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA 進(jìn)行差異顯著性分析，每組試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對黃芪甲苷含量的影響

由圖1可知，發(fā)酵時間為3～5 d 時，黃芪甲苷含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，至5 d 時達(dá)到最大值。但是發(fā)酵5 d 以后，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，黃芪甲苷含量卻顯著下降。發(fā)酵時間是影響微生物發(fā)酵結(jié)果的重要因素，發(fā)酵時間短，產(chǎn)生相應(yīng)酶量相對較少，影響黃芪甲苷釋放；然而發(fā)酵時間過長，培養(yǎng)基所能提供的養(yǎng)分不足，有可能會使產(chǎn)酶的性能下降，影響黃芪甲苷產(chǎn)量［11］。同時，隨著發(fā)酵時間延長，培養(yǎng)基中適宜于利用的碳源基本耗盡，此時沼澤紅假單胞菌將含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)、難降解的黃芪甲苷等作為碳源，以維持其正常的生長代謝［13］，這也是發(fā)酵后期黃芪甲苷含量降低的可能原因之一。因此，發(fā)酵時間應(yīng)控制在5 d 左右。

圖1 發(fā)酵時間對黃芪甲苷含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the content of astragaloside IV

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH 值對黃芪甲苷含量的影響

由圖2可知，培養(yǎng)基初始pH 值對黃芪甲苷含量有一定的影響，隨著培養(yǎng)基初始pH 值的升高，黃芪甲苷含量也逐漸增大，培養(yǎng)基初始pH 值達(dá)到7.0 時含量最大。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH 值再繼續(xù)升高，黃芪甲苷含量小幅下降。沼澤紅假單胞菌最適的生長pH為6.8～7.2，因此在發(fā)酵時培養(yǎng)基初始pH 值維持在中性更有利于黃芪甲苷的釋放。

圖2 培養(yǎng)基初始pH 值對黃芪甲苷含量的影響Fig.2 Effect of fermentation pH on the content of astragaloside IV

2.1.3 發(fā)酵溫度對黃芪甲苷含量的影響

由圖3可知，發(fā)酵溫度對黃芪甲苷含量的影響較小，當(dāng)溫度為30 ℃時黃芪甲苷含量為最大，溫度繼續(xù)升高黃芪甲苷含量略有下降。微生物代謝產(chǎn)物的生成，都需要各種酶來催化。溫度是影響酶活性的重要因素，溫度升高，酶活反應(yīng)速度加快。但是，酶也易因溫度過高而失去活性，影響物質(zhì)的產(chǎn)量。此外，這種趨勢產(chǎn)生的原因可能也與30 ℃為沼澤紅假單胞菌的最適生長溫度，過高或過低的溫度都不利于其生長，進(jìn)而影響黃芪甲苷的釋放。

圖3 發(fā)酵溫度對黃芪甲苷含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the content of astragaloside IV

2.1.4 菌種接種量對黃芪甲苷含量的影響

由圖4可知，菌種接種量對黃芪甲苷的含量影響較小，在菌種接種量為6%～12%之間時，增加接種量對黃芪甲苷含量無顯著影響。因此，在本著資源節(jié)約，充分利用的原則，選擇菌種接種量時應(yīng)控制在6%左右。

圖4 接種量對黃芪甲苷含量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the content of astragaloside IV

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了四因素、三水平的正交試驗，采用L9（34）方案設(shè)計，以得出沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪的最佳發(fā)酵條件。由表2 和表3可知，4個因子對黃芪發(fā)酵液中的黃芪甲苷含量均產(chǎn)生了極顯著性的影響（P＜0.01），但各因子的影響程度不相同。根據(jù)F 值水平將各因子對黃芪甲苷含量的影響強弱排序為：菌種接種量＞培養(yǎng)基初始pH 值＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度；最佳發(fā)酵條件是A2B1C2D3，即發(fā)酵時間為5 d、培養(yǎng)基初始pH 值為6.6、發(fā)酵溫度為30 ℃和菌種接種量為10%。在此發(fā)酵條件下得到黃芪甲苷含量達(dá)到了22.88 μg·mL-1，比未發(fā)酵黃芪中黃芪甲苷含量提升63.9%。

表2 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵對黃芪甲苷含量影響的正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test for the influence of Rhodopseudomonas palustris fermentation on the content of astragaloside IV

表3 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵對黃芪甲苷含量影響的方差分析Table 3 Variance analysis of the influence of Rhodopseudomonas palustris fermentation on the content of astragaloside IV

3 討論

中藥發(fā)酵技術(shù)就是在適當(dāng)?shù)慕臃N量、溫度、時間和濕度等條件下對中藥進(jìn)行發(fā)酵，加快中藥有效成分的溶出，提高中藥有效成分的提取率［11］。本文利用沼澤紅假單胞菌對黃芪進(jìn)行發(fā)酵，較非發(fā)酵黃芪中黃芪甲苷含量提升了63.9%，這一結(jié)果與許多研究報道相一致。王士中［18］運用糙皮側(cè)耳菌（Pleurotus ostreatus）對黃芪進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)檢測發(fā)酵后黃芪甲苷含量增加，推測是由于糙皮側(cè)耳菌豐富的酶系對黃芪中木質(zhì)纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及果膠等物質(zhì)進(jìn)行分解利用，活性成分充分釋放，使黃芪甲苷含量增加。侯美如等［5］采用產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefa?ciens）SSY1 菌株固態(tài)發(fā)酵黃芪，結(jié)果顯示黃芪甲苷含量升高37.95%。孫豪棟［19］以突變的傘枝犁頭霉（Absidia corymbifera）作為菌種進(jìn)行黃芪發(fā)酵，使黃芪甲苷產(chǎn)率從28.3%增加到42.86%。

然而，郁帥陸等［20］運用靈芝（Ganoderma lu?cidum）液體種子液對黃芪固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷含量降低，推測可能因高溫滅菌，使連接苷元和多糖的多糖苷鍵部分?jǐn)嗔?，并生成非極性皂苷元，而不能經(jīng)極性較大的甲醇提取到，使檢測結(jié)果降低。林莎莎等［3］利用短雙歧桿菌（Bifi?dobacterium breve）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacteri?um infantis）發(fā)酵黃芪后黃芪甲苷含量降低而皂苷Ⅱ的含量升高；陳麗艷等［21］用側(cè)耳菌（Pleurotus os?treatus）發(fā)酵黃芪后黃芪甲苷的含量降低了91%，并有新的物質(zhì)產(chǎn)生。

微生物發(fā)酵是一系列的酶促反應(yīng)，制約其轉(zhuǎn)化的因素很多。因此，微生物發(fā)酵黃芪會受到發(fā)酵菌種、發(fā)酵成分及發(fā)酵條件等因素的影響，對其有效成分的影響也不盡相同，也具有不同的轉(zhuǎn)化機制。有報道指出，沼澤紅假單胞菌可以木質(zhì)素為碳源［13］進(jìn)行生長并對其進(jìn)行分解利用，從而提高黃芪有效成分的釋放，這可能是沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪導(dǎo)致黃芪甲苷含量增加的原因之一。

中藥發(fā)酵技術(shù)改善了黃芪的藥效作用，為更好的利用黃芪開創(chuàng)了一條新的道路。但是，優(yōu)良菌種的選育仍然是中藥發(fā)酵技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。黃芪甲苷是黃芪中重要的藥效成分之一，對其優(yōu)良發(fā)酵菌種的研究還比較欠缺。本文的研究結(jié)果，不僅豐富了發(fā)酵黃芪的菌種資源，而且為中藥黃芪進(jìn)一步開發(fā)利用提供了新的思路。

4 結(jié)論

發(fā)酵時間、培養(yǎng)基初始pH 值、發(fā)酵溫度和菌種接種量對黃芪甲苷含量均產(chǎn)生了極顯著性的影響（P＜0.01），F(xiàn) 值水平顯示各因子影響強弱結(jié)果為：菌種接種量＞培養(yǎng)基初始pH 值＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度；最佳發(fā)酵條件是發(fā)酵時間為5 d、培養(yǎng)基初始pH 值為6.6、發(fā)酵溫度為30 ℃和菌種接種量為10%，黃芪甲苷含量可達(dá)到22.88 μg·mL-1，比未發(fā)酵黃芪中黃芪甲苷含量提升了63.9%。