增強(qiáng)子對基因表達(dá)的調(diào)控：從新技術(shù)到新機(jī)制

武成一，陳 斐，洪丹妮，朱 明，童夢莎，黃佳良

(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)協(xié)同創(chuàng)新中心,福建 廈門 361102)

人類基因組中僅約2%的序列是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)編碼的基因，人們對于剩余大量的非編碼序列的生物學(xué)功能依然了解甚少.增強(qiáng)子調(diào)控元件是一段特定的非編碼DNA序列，它們通過與轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)合，對細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)進(jìn)行順式調(diào)控[1].第一個(gè)被確定的增強(qiáng)子是猴空泡病毒SV40基因組中一段長72 bp的序列，它可以將宮頸癌HeLa細(xì)胞中報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄提高數(shù)百倍[1].增強(qiáng)子通常具有特定的染色質(zhì)特征，例如DNA序列保守性、染色質(zhì)可及性、H3K27ac和H3K4me1等組蛋白修飾、可與啟動子形成染色質(zhì)三維環(huán)狀結(jié)構(gòu)等[2].隨著“DNA元件百科全書”(ENCODE)和“表觀基因組學(xué)路線圖”(Roadmap Epigenomics)等計(jì)劃的實(shí)施，研究人員找到大量(在每類細(xì)胞中超過10萬個(gè))增強(qiáng)子調(diào)控元件[3-4].然而，如何有效地注釋這些增強(qiáng)子的生物學(xué)功能依然面臨巨大挑戰(zhàn).

增強(qiáng)子增加了細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性，在發(fā)育和疾病發(fā)生過程中扮演重要角色[5].目前，利用高通量技術(shù)方法研究增強(qiáng)子的主要工作包括以下幾方面：1)增強(qiáng)子的預(yù)測，利用DNA序列保守性、H3K27ac和H3K4me1等組蛋白修飾、染色質(zhì)可及性和TF結(jié)合圖譜等多組學(xué)圖譜，預(yù)測具有細(xì)胞特異性的潛在增強(qiáng)子.例如哺乳動物胚胎著床前染色質(zhì)可及性等動態(tài)圖譜可用于預(yù)測這一生物過程中潛在的增強(qiáng)子[6].2)靶標(biāo)基因的鑒定，基于染色質(zhì)線性距離[7]、與基因表達(dá)相關(guān)性[8]、染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)[9]和表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)[10]等特征和技術(shù)手段，尋找增強(qiáng)子潛在下游靶標(biāo)基因.3)增強(qiáng)子對基因表達(dá)的影響，利用聚簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9(CRISPR-Cas9)基因編輯等方法，檢測增強(qiáng)子對下游靶標(biāo)基因表達(dá)的影響.例如，F(xiàn)ulco等[11]發(fā)現(xiàn)利用增強(qiáng)子自身H3K27ac強(qiáng)度、增強(qiáng)子與潛在靶標(biāo)基因的距離、增強(qiáng)子與潛在靶標(biāo)基因的染色質(zhì)相互作用等因素進(jìn)行建模，可以準(zhǔn)確預(yù)測出增強(qiáng)子對基因表達(dá)的影響.4)增強(qiáng)子與發(fā)育和疾病的關(guān)系，例如VISTA數(shù)據(jù)庫(https:∥enhancer.lbl.gov/)收集了1 654個(gè)經(jīng)驗(yàn)證在小鼠發(fā)育與疾病模型中具有體內(nèi)活性的增強(qiáng)子[12]，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子的冗余性有利于穩(wěn)定哺乳動物發(fā)育過程中的表型[13]，且大多數(shù)與疾病相關(guān)的序列變異(即單核苷酸多態(tài)性)富集在增強(qiáng)子等調(diào)控元件中[14].

本文回顧近年來增強(qiáng)子調(diào)控基因表達(dá)研究中的部分最新進(jìn)展，介紹多組學(xué)、單細(xì)胞及基因編輯等可應(yīng)用于增強(qiáng)子研究的相關(guān)技術(shù)，闡述增強(qiáng)子對基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，最后對增強(qiáng)子在發(fā)育、進(jìn)化和疾病中的重要功能進(jìn)行概述.

1 增強(qiáng)子研究的新技術(shù)

1.1 多組學(xué)技術(shù)

1.1.1 染色質(zhì)開放區(qū)域檢測技術(shù)

染色質(zhì)可及性是指細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)中的DNA能夠與生物大分子進(jìn)行物理接觸的程度，其圖譜可用于識別基因組上的調(diào)控區(qū)域.染色質(zhì)可及性以及核小體的定位傳統(tǒng)上是通過核酸酶或限制性內(nèi)切酶的消化等方法來檢測的，這里簡要描述幾種常用測序(seq)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理.1)DNase-seq[15]，通過一種可以優(yōu)先在開放染色質(zhì)中引入雙鏈斷裂的核酸內(nèi)切酶DNase Ⅰ，消化基因組后對DNA片段進(jìn)行測序.2)MNase-seq[16]，是一種測量核小體占位的技術(shù)，MNase同時(shí)具備核酸外切酶和內(nèi)切酶的活性，可以將堿基對逐個(gè)切下以切割和消化裸露的DNA區(qū)域，直至遇到核小體或DNA結(jié)合蛋白等阻滯物.3)ATAC-seq[17]，利用一種經(jīng)過工程學(xué)改造的超高活性DNA轉(zhuǎn)座酶(Tn5)，同時(shí)切割和標(biāo)記開放的或核小體缺失的染色質(zhì)區(qū)域，具有實(shí)驗(yàn)方案簡單和所需檢測樣品細(xì)胞少的優(yōu)勢，因此得到廣泛應(yīng)用.除了分析染色質(zhì)可及性圖譜之外，ATAC-seq也可用于檢測TF印跡和繪制核小體定位圖.

1.1.2 TF結(jié)合和組蛋白修飾檢測技術(shù)

染色質(zhì)可及性是高度動態(tài)變化的，通過染色質(zhì)結(jié)合因子和核小體之間的相互競爭來調(diào)節(jié).具有調(diào)控作用的DNA元件(如增強(qiáng)子、啟動子、絕緣子等)與TF協(xié)同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其中活性增強(qiáng)子附近的核小體通常含有特異組蛋白修飾.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)-seq用于在全基因組水平檢測染色質(zhì)結(jié)合因子如TF或組蛋白修飾在基因組上的位置[18].對于組蛋白修飾ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，染色質(zhì)可以從甲醛固定細(xì)胞或非固定細(xì)胞(天然染色質(zhì))中分離出來，并通過超聲波或MNase消化作用將組蛋白修飾區(qū)域片段化至100～500 bp.對于TF結(jié)合ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，染色質(zhì)需要通過甲醛固定交聯(lián)以保留蛋白質(zhì)與染色質(zhì)的相互作用.這些DNA片段被特異性抗體以及Protein A/G偶聯(lián)瓊脂糖珠或磁珠捕獲后進(jìn)行建庫和測序.近年來，研究人員已經(jīng)開發(fā)出更多高效衍生方法，其中核酸酶靶向切割和釋放(CUT&RUN)技術(shù)是一種以簡單、可靠且成本較低的對染色質(zhì)結(jié)合蛋白進(jìn)行高分辨率分析的技術(shù)[19].此技術(shù)利用Protein A/G-MNase融合蛋白結(jié)合目標(biāo)抗體，激活MNase對目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)周圍的染色質(zhì)進(jìn)行切割、捕獲.與傳統(tǒng)的ChIP-seq相比，該技術(shù)不需要甲醛交聯(lián)，具有更高的信噪比且所需的樣品量少，已應(yīng)用于單細(xì)胞水平的檢測.Skene等[20]還推出了靶向剪切及轉(zhuǎn)座酶(CUT&Tag)技術(shù)，與CUT&RUN相比，CUT&Tag使用了Tn5代替MNase.這兩種方法低成本、高效率、高可重復(fù)性和高通量的特點(diǎn)，使其逐漸成為常規(guī)表觀基因組分析的首選方法.

1.1.3 三維基因組技術(shù)

越來越多的證據(jù)表明，基因組的三維結(jié)構(gòu)在不同尺度呈現(xiàn)層次結(jié)構(gòu)，并在功能上與基因表達(dá)調(diào)控緊密關(guān)聯(lián)[21].染色體在細(xì)胞核中占據(jù)的位置稱為染色體區(qū)域，這些區(qū)域被劃分為染色體室，并進(jìn)一步劃分為拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域(TAD)，以及增強(qiáng)子-啟動子相互作用介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán).在三維基因組結(jié)構(gòu)研究中最有影響力的檢測技術(shù)是高通量染色體構(gòu)象捕獲(Hi-C)技術(shù)[22]，該技術(shù)可對整個(gè)基因組的DNA相互作用進(jìn)行分析，分辨率范圍為數(shù)個(gè)堿基到數(shù)兆個(gè)堿基.根據(jù)DNA被甲醛交聯(lián)在一起的概率，Hi-C技術(shù)可以測量兩個(gè)DNA片段在三維空間中物理結(jié)合的總體平均頻率.利用限制性內(nèi)切酶將交聯(lián)的DNA消化并剪切，之后將相互作用的片段連接在一起并用生物素標(biāo)記，從而對選擇性純化并形成嵌合DNA分子的基因組文庫進(jìn)行測序.Hi-C的衍生技術(shù)可以檢測由感興趣的蛋白質(zhì)所驅(qū)動或者所選定基因組位置的特異性DNA相互作用，包括ChIP-loop、ChIA-PET、HiChIP、PLAC-seq和Capture-Hi-C等[23].Hi-C及其衍生技術(shù)的分辨率很大程度上受限于限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的分布.Micro-C技術(shù)引入了雙重交聯(lián)，并用MNase消化取代了Hi-C技術(shù)中使用的限制性內(nèi)切酶，這不僅能產(chǎn)生非常均勻的切割片段從而提高局部分辨率，還可以保留核小體定位的信息[24].也有研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子和啟動子的功能連接性可以通過它們自身轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用來實(shí)現(xiàn)[25].RNA原位構(gòu)象測序(RIC-seq)技術(shù)可以用于對分子內(nèi)和分子間的RNA-RNA相互作用進(jìn)行全局分析，有助于生成人類細(xì)胞中RNA的三維相互作用圖譜[26].

目前利用Hi-C等技術(shù)檢測全基因組染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖譜在技術(shù)上依然存在困難，而且非常昂貴，因此刺激了計(jì)算分析和數(shù)學(xué)建模的發(fā)展，結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，有助于實(shí)現(xiàn)對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的理解.Huang等[27]構(gòu)建貝葉斯累加回歸樹BART計(jì)算模型，在概念上首次論證了利用組蛋白修飾數(shù)據(jù)可以有效地預(yù)測染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu).Marco等[28]開發(fā)了層次化隱馬爾可夫模型的計(jì)算方法，能夠跨不同尺度系統(tǒng)地注釋染色質(zhì)狀態(tài)，對增強(qiáng)子進(jìn)行功能注釋，從而更好地篩選出細(xì)胞中關(guān)鍵的增強(qiáng)子.

1.2 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)

1.2.1 單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)

在過去很長一段時(shí)間內(nèi)，RNA-seq技術(shù)已被廣泛用于研究群體水平的基因表達(dá)模式.單細(xì)胞RNA-seq(scRNA-seq)[29]的出現(xiàn)為在單細(xì)胞水平上探索基因表達(dá)譜提供了前所未有的機(jī)會，并為研究細(xì)胞的基因表達(dá)異質(zhì)性和動態(tài)變化提供更加深入的見解.單細(xì)胞ATAC-seq(scATAC-seq)可以在單細(xì)胞分辨率下檢測染色質(zhì)可及性，從而幫助人們了解細(xì)胞間的譜系關(guān)系[30].除此之外，研究人員還開發(fā)了許多方法來同時(shí)獲得單細(xì)胞的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)水平，例如Paired-seq[31]、SNARE-seq[32]和SHARE-seq[33]等.

1.2.2 單細(xì)胞多組學(xué)圖譜

Li等[34]利用scATAC-seq捕獲了成年小鼠同形皮層、嗅球、海馬以及腦核區(qū)45個(gè)區(qū)域共計(jì)超過80萬個(gè)細(xì)胞的染色質(zhì)可及性，構(gòu)建了超過160多種細(xì)胞類型的順式作用元件調(diào)控圖譜，為全面分析哺乳動物大腦的基因調(diào)控程序奠定了基礎(chǔ)，有助于解釋人類各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病.Domcke等[35]對發(fā)育時(shí)間72～129 d人類胎兒的15個(gè)器官121個(gè)樣本進(jìn)行scRNA-seq和scATAC-seq，獲得了400萬個(gè)單細(xì)胞的基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)，為更好地理解人類發(fā)育中的罕見和常見疾病提供了信息資源，同時(shí)也為開發(fā)潛在的治療方法提供了支持.Ranzoni等[36]對8 000多個(gè)來自胎兒肝臟和骨髓的血細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq和scATAC-seq，確定了肝臟和骨髓的造血干細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄和功能差異.Trevino等[37]等對不同時(shí)期的人類胎兒大腦皮層組織進(jìn)行scRNA-seq和scATAC-seq，通過整合分析，完成了人大腦皮層發(fā)生過程中各細(xì)胞類型的單細(xì)胞基因表達(dá)和調(diào)控圖譜，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化的路徑以及不同的TF在這些過程中的調(diào)控機(jī)制.這些單細(xì)胞多組學(xué)圖譜有助于在單細(xì)胞分辨率下進(jìn)一步揭示發(fā)育或疾病過程中細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的機(jī)制.

1.3 基因編輯技術(shù)

1.3.1 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)

隨著CRISPR和Cas的發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas工具也逐漸成為各個(gè)領(lǐng)域廣泛使用的基因編輯技術(shù).Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)由單個(gè)導(dǎo)向RNA(sgRNA)和DNA內(nèi)切酶Cas9組成，sgRNA引導(dǎo)Cas9到特定的DNA序列并進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)便捷有效的基因編輯[38-39].此外，由Cas9兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)殘基的突變體產(chǎn)生的失活Cas9(dCas9)，雖然不能切割DNA，但是保留了以特定序列方式結(jié)合DNA的能力.dCas9可將轉(zhuǎn)錄激活因子招募到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄激活(CRISPRa)[40]，也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子Kruppel相關(guān)盒(KRAB)特異性地抑制基因表達(dá)(CRISPRi)[41].此外還有與各種效應(yīng)域融合的dCas9，大大方便了對真核生物轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的操縱.例如，原位CRISPR親和純化調(diào)節(jié)元件(CAPTURE)方法可以識別位點(diǎn)特異性染色質(zhì)調(diào)控復(fù)合物和遠(yuǎn)程DNA相互作用[42]，使用融合生物素的dCas9，可以與鏈霉素結(jié)合從而分離完整的調(diào)控復(fù)合物.在非編碼調(diào)控元件的功能研究上，Li等[43]設(shè)計(jì)了以增強(qiáng)子為靶標(biāo)的體內(nèi)CRISPR雙效應(yīng)表觀遺傳編輯系統(tǒng)enCRISPRa和enCRISPRi，用于在體外、異種移植和體內(nèi)高效分析增強(qiáng)子功能.在染色質(zhì)空間構(gòu)象與疾病的研究中，Lupiez等[44]利用CRISPR-Cas系統(tǒng)構(gòu)建了特定基因位點(diǎn)染色體重排的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)染色體重排破壞了編碼基因及其增強(qiáng)子相對于TAD邊界的正常拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，導(dǎo)致遠(yuǎn)端調(diào)控結(jié)構(gòu)重新連接而致病.

1.3.2 CRISPR-Cas9文庫篩選技術(shù)

傳統(tǒng)的利用RNA干擾途徑進(jìn)行基因敲除和大規(guī)模篩選的方式，存在廣泛脫靶效應(yīng)和基因敲除不完全等問題.而CRISPR-Cas9為高通量篩選提供了更高效便捷的平臺，通過設(shè)計(jì)sgRNA文庫，可以根據(jù)特定的表型篩選重要基因，成為全基因組功能分析的強(qiáng)有力工具[45].新開發(fā)的Perturb-seq將CRISPR-Cas9與scRNA-seq結(jié)合起來，在單個(gè)樣品中平行生成數(shù)千個(gè)基因擾動，并測定每個(gè)細(xì)胞的擾動和表型，從而準(zhǔn)確鑒定受擾動影響的單個(gè)基因靶點(diǎn)、基因特征和細(xì)胞狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的基因組功能篩查[46].基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的全基因組篩選技術(shù)對篩選疾病發(fā)生中起重要作用的非編碼調(diào)控元件具有重要意義[47].為了有效地預(yù)測增強(qiáng)子與基因之間的連接，研究人員將CRISPRi、RNA熒光原位雜交(FISH)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合起來開發(fā)了CRISPRi-FlowFISH，該方法通過擾動非編碼元件并量化其對基因表達(dá)的影響，可以系統(tǒng)地大規(guī)模預(yù)測增強(qiáng)子調(diào)控基因[11].此外，新開發(fā)的CRISPRpath方法[48]將傳統(tǒng)的僅限單個(gè)基因的增強(qiáng)子篩選方法進(jìn)一步擴(kuò)展，通過對人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的6個(gè)基因進(jìn)行干擾和切割，可以同時(shí)表征參與同一生物學(xué)途徑中多個(gè)靶基因的調(diào)控元件，并區(qū)分出不同增強(qiáng)子在功能強(qiáng)度上的差異.Fei等[49]分別設(shè)計(jì)了針對叉頭框蛋白A1(FOXA1)或CCCTC結(jié)合因子(CTCF)結(jié)合位點(diǎn)的全基因組CRISPR-Cas9敲除篩選文庫，并在乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行大規(guī)模篩選，篩選并探究超過1萬個(gè)與FOXA1或CTCF結(jié)合的順式作用元件的功能及特征.增強(qiáng)子研究中的相關(guān)技術(shù)總結(jié)于表1.

表1 增強(qiáng)子研究中的相關(guān)技術(shù)

2 增強(qiáng)子相關(guān)新機(jī)制

2.1 增強(qiáng)子靶標(biāo)基因的預(yù)測方法

對增強(qiáng)子位置的識別只是解析其生物學(xué)功能的第一步.在此基礎(chǔ)上，鑒定出每一個(gè)增強(qiáng)子直接作用的基因靶點(diǎn)，是理解增強(qiáng)子生物學(xué)效應(yīng)不可或缺的部分.Hi-C技術(shù)直觀地反映了有物理接觸的基因組位置信息，特別是利用Promoter Capture Hi-C特異性捕獲增強(qiáng)子和啟動子相互作用的片段，可以達(dá)到更高的分辨率[50].此外，利用多個(gè)樣本ATAC-seq 或H3K27ac信號和基因表達(dá)量相關(guān)性的方法也被廣泛應(yīng)用于預(yù)測增強(qiáng)子的靶標(biāo)基因[51]，甚至應(yīng)用于單細(xì)胞水平[8].還有研究人員設(shè)計(jì)了一種稱為ABC(activity-by-contact)的方法構(gòu)建了人類全基因組增強(qiáng)子-靶基因映射圖譜[11]，此方法綜合考慮了增強(qiáng)子本身的表觀修飾強(qiáng)度以及與靶基因三維連接的強(qiáng)度，已應(yīng)用于對全基因組關(guān)聯(lián)研究位點(diǎn)的功能性注釋中[52].

2.2 增強(qiáng)子簇

許多增強(qiáng)子于基因組中協(xié)同調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因，并以簇的形式存在.2008年“陰影增強(qiáng)子”的概念被提出[53]，陰影增強(qiáng)子代表在空間和時(shí)間上表現(xiàn)出部分或完全冗余的調(diào)控模式的多個(gè)增強(qiáng)子.研究表明陰影增強(qiáng)子可能提供了一種重要的機(jī)制，用于緩沖與人類疾病相關(guān)的基因非編碼調(diào)控區(qū)突變而導(dǎo)致的基因表達(dá)紊亂，提高動物發(fā)育過程中基因表達(dá)的精確性和表型穩(wěn)健性[13,54].增強(qiáng)子簇中通常具有異常高水平的增強(qiáng)子活性和增強(qiáng)子相關(guān)染色質(zhì)特征，如H3K27ac的富集，TF、輔助激活因子和染色質(zhì)的結(jié)合與占用等，因此在研究中也被鑒定為超級增強(qiáng)子(SE)[55].SE通常與細(xì)胞命運(yùn)決定和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān).目前SE是利用生物信息學(xué)方法通過對基因組中距離在12.5 kb以內(nèi)的增強(qiáng)子進(jìn)行線性聚類而識別的.

2.3 增強(qiáng)子之間的層次結(jié)構(gòu)

增強(qiáng)子簇在細(xì)胞命運(yùn)決定和疾病過程中扮演重要角色，然而它是如何發(fā)揮作用的尚不清楚，其中一個(gè)關(guān)鍵問題是，增強(qiáng)子簇內(nèi)多個(gè)增強(qiáng)子元件是如何相互協(xié)調(diào)以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因表達(dá)的精確調(diào)控的[56].大量研究證明增強(qiáng)子的調(diào)控機(jī)制具有高度的多樣性和異質(zhì)性.例如：Hay等[57]對α-珠蛋白增強(qiáng)子元件的解析表明，α-珠蛋白基因的活性隨著增強(qiáng)子的數(shù)量增加呈線性增加的狀態(tài)；Bahr等[58]證明了調(diào)節(jié)MYC基因的增強(qiáng)子簇的加和性協(xié)同作用；Shin等[59]發(fā)現(xiàn)乳清酸蛋白基因(Wap)增強(qiáng)子簇中最遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子似乎起到最關(guān)鍵的作用.增強(qiáng)子在基因激活方面也表現(xiàn)出時(shí)間上的差異，小鼠Fgf5增強(qiáng)子簇中的大多數(shù)增強(qiáng)子元件會在不同時(shí)間點(diǎn)促進(jìn)Fgf5的表達(dá)，從而誘導(dǎo)小鼠干細(xì)胞的分化[60].也有研究提出動態(tài)“轉(zhuǎn)錄樞紐”的概念，即多個(gè)增強(qiáng)子及其目標(biāo)啟動子、大量TF、轉(zhuǎn)錄輔助因子和RNA聚合酶Ⅱ同時(shí)參與相同的微環(huán)境，形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄共激活聚合物[61]，為多個(gè)增強(qiáng)子對啟動子的調(diào)控提供潛在的模型.

Huang等[62]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，在造血干細(xì)胞體外分化為成紅細(xì)胞的模型中，解析了兩個(gè)SE：1)造血干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA2基因的SE通過3個(gè)增強(qiáng)子不同分工，精確調(diào)控GATA2在分化過程中的動態(tài)表達(dá)，從而影響干細(xì)胞的維持和分化；2)SCL25A37SE中，增強(qiáng)子E3不僅對基因表達(dá)影響最大，而且還決定了E1和E2的功能，表明增強(qiáng)子在功能上存在層次結(jié)構(gòu).Huang等[63]還基于染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和組蛋白修飾等表觀組學(xué)圖譜，在人白血病細(xì)胞K562中系統(tǒng)解析了全基因組范圍內(nèi)的SE，發(fā)現(xiàn)在SE內(nèi)部存在一個(gè)重要的樞紐增強(qiáng)子，負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)多個(gè)增強(qiáng)子共同調(diào)控基因表達(dá)，由此提出一個(gè)包含樞紐增強(qiáng)子的模型，闡述增強(qiáng)子之間功能層次結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制.Kai等[64]的最近一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子在形成時(shí)間上同樣存在層次結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)子簇中的元件在分化過程中的不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)，通過與不同的細(xì)胞特異性TF結(jié)合來驅(qū)動細(xì)胞的分化過程.

3 增強(qiáng)子調(diào)控基因表達(dá)的功能

3.1 發(fā) 育

單細(xì)胞受精卵通過一系列發(fā)育途徑的選擇過程發(fā)展成為一種復(fù)雜的多細(xì)胞動物.發(fā)育過程中增強(qiáng)子可以精確控制基因的時(shí)空表達(dá)，使得基因在物種特異性遺傳程序的控制下表現(xiàn)出時(shí)空受限的表達(dá)模式，調(diào)控從生殖層形成到細(xì)胞分化的發(fā)育過程.調(diào)節(jié)細(xì)胞特異性基因的元件中，最典型的例子是基因座控制區(qū)(LCR)[65]，LCR通常是基因組上具有調(diào)節(jié)能力的DNA序列，比如人類β-珠蛋白LCR由多個(gè)紅系特異性的增強(qiáng)子組成，可以在不同發(fā)育時(shí)期通過染色質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)與珠蛋白基因結(jié)合來促進(jìn)基因特異性的表達(dá).關(guān)于增強(qiáng)子在肢體發(fā)育中的作用也開展了大量研究，這里以Shh和HoxD基因位點(diǎn)為例.遠(yuǎn)端骨骼的發(fā)育模式部分由Shh基因所控制，而Shh基因的表達(dá)由一個(gè)被稱為“極性活化帶調(diào)控元件”(ZRS)的增強(qiáng)子驅(qū)動[66]，ZRS可以與TF ETS1結(jié)合，從而驅(qū)動Shh的轉(zhuǎn)錄.在ZRS缺失的突變體中，Shh轉(zhuǎn)錄信號消失，導(dǎo)致小鼠遠(yuǎn)端骨骼的缺失，這表明ZRS對于遠(yuǎn)端肢體發(fā)育具有關(guān)鍵作用.HoxD在四足動物四肢的構(gòu)建中起著至關(guān)重要的作用，控制HoxD的增強(qiáng)子多達(dá)7個(gè)，其中位于3’-端的兩個(gè)增強(qiáng)子控制HoxD表達(dá)的早期階段，隨后染色質(zhì)發(fā)生拓?fù)渥兓?，使得部分增?qiáng)子與5’-端增強(qiáng)子一起調(diào)控HoxD后期表達(dá)[67].近期一些研究還探究了增強(qiáng)子在血液細(xì)胞發(fā)育過程中的作用.Huang等[62]利用人類造血干細(xì)胞體外分化模型，結(jié)合RNA-seq和ChIP-seq等技術(shù)檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組，利用MAnorm[68]分析了增強(qiáng)子上H3K27ac組蛋白修飾信號的差異，系統(tǒng)繪制了人類造血干細(xì)胞分化過程中增強(qiáng)子激活或失活的動態(tài)圖譜，發(fā)現(xiàn)不同的TF組合以高度特定的方式合作調(diào)控增強(qiáng)子的時(shí)空活動，比如造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)特有的RUNX1-FLI1-PU.1-ETS模塊，血液細(xì)胞中的GATA1和TAL1模塊，以及無處不在的“管家”E2F-SP1和激活蛋白1(AP1)模塊等，進(jìn)一步闡述了增強(qiáng)子在人類造血干細(xì)胞分化過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).Cai等[69]還發(fā)現(xiàn)分化后期的紅細(xì)胞中細(xì)胞特異性基因表達(dá)依賴于遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的程度比在胚胎時(shí)期紅細(xì)胞中的更強(qiáng).這些特異性基因主要通過遠(yuǎn)端增強(qiáng)子所結(jié)合的Myb以及Myb介導(dǎo)的Gata1占位來調(diào)控，而胚胎時(shí)期紅細(xì)胞特異性基因主要通過Gata1在近端啟動子區(qū)域的占用來調(diào)節(jié)，說明細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)模式隨個(gè)體發(fā)育而改變.

3.2 進(jìn) 化

除在發(fā)育調(diào)控中的核心作用外，增強(qiáng)子還是產(chǎn)生進(jìn)化變異的熱點(diǎn)[70]，因?yàn)樗鼈儞碛屑?xì)胞特異性，允許在特定組織環(huán)境中調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，而不影響其他基因功能，還可以通過冗余性來緩沖致死風(fēng)險(xiǎn)從而促進(jìn)遺傳變異的積累.在哺乳動物基因組中包含數(shù)百個(gè)連續(xù)的保守堿基序列，可以作為遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子發(fā)揮作用，稱為“超保守”增強(qiáng)子.這些超保守調(diào)控元件對維持正常發(fā)育過程有著不可或缺的作用[71].TF和增強(qiáng)子的相互作用在動物發(fā)育過程中決定了細(xì)胞特性，盡管TF家族在動物界高度保守，但控制基因表達(dá)的增強(qiáng)子在很大程度上具有物種特異性[72]，在哺乳動物基因組中，只有1%的人類組織特異性增強(qiáng)子是保守的[72].在更大進(jìn)化距離上有相似性的增強(qiáng)子更為罕見，即使是超保守增強(qiáng)子，其功能也并不一定需要在進(jìn)化中通過序列的完美保守來維持[73].雖然泛后生動物中增強(qiáng)子保守性似乎很少見，但有研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子存在一種古老、保守但靈活的調(diào)控機(jī)制[74].人類與海綿動物的胰島增強(qiáng)子沒有顯著的序列一致性，但它們通過一套相似的TF結(jié)合基序來驅(qū)動相似的基因表達(dá)模式.這種保守的TF結(jié)合基序在進(jìn)化過程中保持了穩(wěn)定的增強(qiáng)子功能，同時(shí)這些增強(qiáng)子可以通過擴(kuò)展整合新的TF結(jié)合基序以及丟掉其他基序來完成進(jìn)化.

3.3 疾 病

隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)SE驅(qū)動的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一種參與癌癥發(fā)生發(fā)展的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，在乳腺癌[75]、結(jié)直腸癌[76]和急性淋巴白血病[77]等多種癌癥中驅(qū)動或抑制癌癥的發(fā)生，對腫瘤細(xì)胞的生長、耐藥性以及免疫逃逸等能力產(chǎn)生重要的影響.SE介導(dǎo)癌癥發(fā)生的機(jī)制主要有以下幾種：1)基因組上的堿基突變導(dǎo)致新的TF結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)，進(jìn)而出現(xiàn)新的SE，例如在一部分T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)病例中，由于TAL1上游非編碼區(qū)域發(fā)生突變，產(chǎn)生了新的MYB結(jié)合位點(diǎn)，MYB蛋白結(jié)合在此新位點(diǎn)上并招募組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(CBP)形成新的SE，激活相鄰的原癌基因TAL1的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[77]；2)SE中某些關(guān)鍵位點(diǎn)的突變導(dǎo)致致癌基因或抑癌基因的表達(dá)異常，從而影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展，例如位于神經(jīng)母細(xì)胞瘤致癌基因LMO1內(nèi)的SE中的單堿基突變G > T，使得原有的TF GATA3的結(jié)合位點(diǎn)被破壞，導(dǎo)致SE驅(qū)動的LMO1表達(dá)下降，影響了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的易感性[78]；3)SE通常調(diào)控其所在TAD內(nèi)的基因，由堿基突變等原因?qū)е耇AD邊界發(fā)生改變，造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重組，使得原本不受SE調(diào)控的基因出現(xiàn)異常表達(dá)，例如在一些T-ALL病例中，TAD邊界發(fā)生突變導(dǎo)致SE異常驅(qū)動原癌基因TAL1和LMO2的表達(dá)[79].SE功能層級的紊亂通常也伴隨著基因的表達(dá)異常.例如研究發(fā)現(xiàn)位于MYC基因下游1.7 Mb的血液增強(qiáng)子簇(BENC)在MYC基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，BENC是一段由9個(gè)具有選擇性活性的增強(qiáng)子組成的SE，在不同的造血系統(tǒng)中每個(gè)增強(qiáng)子的活性不同，從而使多個(gè)增強(qiáng)子能夠形成不同的組合，實(shí)現(xiàn)譜系特異性的基因調(diào)控，而BENC的調(diào)控異常使MYC基因的表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致白血病的發(fā)生[58].

近年來針對各類疾病的基因編輯療法正在快速發(fā)展，其中靶向增強(qiáng)子位點(diǎn)的基因編輯療法已被成功應(yīng)用到鐮刀型貧血癥和β地中海貧血癥中，這類疾病是由于編碼β-珠蛋白的基因突變使其無法與α-珠蛋白形成正常的血紅蛋白HbA導(dǎo)致的.利用CRISPR-Cas9對患者自身CD34+細(xì)胞中BCL11A增強(qiáng)子上的GATA1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行切割，由于增強(qiáng)子的時(shí)空特異性，對該增強(qiáng)子的切割不影響其他細(xì)胞類型中BCL11A的功能，僅特異性地抑制了紅系細(xì)胞中BCL11A的表達(dá)，恢復(fù)了出生后被抑制的γ-珠蛋白的表達(dá)，與α-珠蛋白重新形成胎兒血紅蛋白HbF[47,80].經(jīng)靶向增強(qiáng)子編輯后的CD34+細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，能有效恢復(fù)患者體內(nèi)的HbF水平，使患者不再需要輸血治療[81].相比于靶向基因序列，對增強(qiáng)子進(jìn)行編輯改變了對基因的表達(dá)調(diào)控，且沒有造成基因突變，增強(qiáng)子的時(shí)空特異性也大大降低了基因編輯的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為各類疾病中都具有巨大潛力的基因編輯療法新靶點(diǎn).

4 總結(jié)與展望

增強(qiáng)子是基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)元件，研究人員在其效應(yīng)和機(jī)制研究方面取得了巨大進(jìn)展，它們的功能與TF、輔助因子的募集以及增強(qiáng)子與啟動子相互作用的形成密切相關(guān).近年來，二代測序的發(fā)展也極大地?cái)U(kuò)展了人們探索全基因組組成的知識和技能.本文從不同方面回顧了增強(qiáng)子的歷史、研究技術(shù)、重要性、機(jī)制和研究進(jìn)展(圖1).目前，如何有效注釋基因組中大量增強(qiáng)子的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).

P表示啟動子；E表示增強(qiáng)子;hub表示樞紐增強(qiáng)子.

目前仍有許多關(guān)于增強(qiáng)子的未解之迷，如：增強(qiáng)子是如何選擇目標(biāo)基因的？多個(gè)增強(qiáng)子如何在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中協(xié)調(diào)，這些增強(qiáng)子中的冗余有多廣泛？增強(qiáng)子與啟動子活性的機(jī)制差異是什么？三維環(huán)狀染色質(zhì)結(jié)構(gòu)是否是基因調(diào)控的決定因素？增強(qiáng)子激活靶基因啟動子的確切機(jī)制是什么？研究人員需要在開發(fā)新方法和積累不同細(xì)胞類型和組織的數(shù)據(jù)方面做出更多努力，為該領(lǐng)域的研究提供更多的線索，以期進(jìn)一步了解增強(qiáng)子在基因調(diào)控中的作用和機(jī)制.