深海微生物來(lái)源細(xì)胞色素P450酶與天然產(chǎn)物生物合成

李 眾，張鏡明，李盛英，張 偉

(山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(微生物技術(shù)研究院)，山東 青島 266237)

海洋作為地球上最廣闊的水體，占地球表面積的71%，蘊(yùn)藏極其豐富的礦產(chǎn)和生物資源，其中大部分(超過(guò)95%)為水深超過(guò)200 m的黑暗、缺氧、寡營(yíng)養(yǎng)、高壓、高鹽、低溫或高溫(熱泉)的深海環(huán)境[1-3].盡管深海屬于極端生境，但深海生態(tài)系統(tǒng)蘊(yùn)藏了豐富的生物多樣性，如深海海綿、珊瑚、藻類等動(dòng)植物以及數(shù)以萬(wàn)計(jì)的微生物.為了適應(yīng)嚴(yán)苛的深海生態(tài)系統(tǒng)，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，深海生命獲得了顯著不同于其他生境(如陸地和近淺海)生命形式的特殊遺傳背景、新穎生理代謝途徑和化學(xué)防御策略.這些獨(dú)特的生命特征和生命活動(dòng)過(guò)程賦予了深海生物產(chǎn)生天然產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性和生物合成過(guò)程的復(fù)雜性和新穎性[2,4-5].

天然產(chǎn)物是動(dòng)植物和微生物等生物產(chǎn)生的有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，其數(shù)量龐大，結(jié)構(gòu)豐富，生物學(xué)功能多樣，包括蛋白質(zhì)、糖類、脂肪酸類、萜類、多肽類和生物堿等結(jié)構(gòu)類型，被廣泛地應(yīng)用于人類生產(chǎn)生活的方方面面[6-7].自Alexander Fleming從青霉菌(Penicilliumsp.)中發(fā)現(xiàn)青霉素(penicillin)以來(lái)，微生物天然產(chǎn)物吸引了藥學(xué)家和化學(xué)家的濃厚興趣，且在過(guò)去的一個(gè)多世紀(jì)一直是研究熱點(diǎn)，如日本科學(xué)家Satoshimura和美國(guó)科學(xué)家William C.Campbell因從阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)中發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)農(nóng)藥阿維菌素(avermectin)榮獲2015年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[8].微生物產(chǎn)生的具有豐富生物活性的天然產(chǎn)物是其進(jìn)行化學(xué)防御、排除異己的重要“武器”，不僅為藥物研發(fā)提供了豐富的先導(dǎo)化合物來(lái)源，也是化學(xué)合成以及改造修飾的重要骨架資源.2020年，David J.Newman和Gordon M.Cragg撰文統(tǒng)計(jì)了1981—2019年間美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市的1 881個(gè)新藥，其中，約46%的藥物來(lái)源于天然產(chǎn)物及其衍生物，且以抗生素和抗腫瘤藥物為主[9].

面對(duì)腫瘤等惡性疾病發(fā)病率的提高、致病菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重、新型致病病毒的不斷出現(xiàn)等危害個(gè)人及公共衛(wèi)生安全的嚴(yán)峻考驗(yàn)，人類對(duì)新型活性天然產(chǎn)物的需求更加迫切，科學(xué)家們也逐漸將目光投向深海微生物資源及其獨(dú)特的天然產(chǎn)物合成能力[5,10].目前，已發(fā)現(xiàn)的深海微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型豐富，如萜類、聚酮類、非核糖體肽類及生物堿等；且具有多樣化的生物活性及顯著的藥用潛力，如抗真菌、抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗瘧原蟲(chóng)及抗病毒等[2,5].因此，海洋微生物作為海洋生物資源的重要組成部分，是海洋先導(dǎo)分子和新型藥物的重要來(lái)源，其在海洋藥物研發(fā)過(guò)程中具有重要地位.深海來(lái)源活性天然產(chǎn)物的獨(dú)特生物合成機(jī)制也吸引了科學(xué)家們的關(guān)注，以期闡明其生物合成過(guò)程，挖掘獲得新穎的酶學(xué)催化元件，為利用合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和改造、改善其藥學(xué)性質(zhì)、產(chǎn)生具有更好成藥性的“非天然”天然產(chǎn)物提供支持[11-12].

一般而言，微生物天然產(chǎn)物的生物合成主要分為3個(gè)階段：1)前體供應(yīng)階段.微生物通過(guò)初級(jí)代謝或環(huán)境攝取獲得天然產(chǎn)物合成所需的骨架原料、能量和金屬離子，如氨基酸、丙二酸及其衍生物、還原型輔酶Ⅰ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)和鎂離子等.2)骨架形成階段.前體物質(zhì)經(jīng)骨架合成酶的識(shí)別、激活、裝載后，通過(guò)連續(xù)縮合或環(huán)化過(guò)程形成相應(yīng)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型的核心骨架，代表性的骨架合成酶有非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)、聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)、萜類合酶(terpene synthase，TS)等.3)后修飾階段.天然產(chǎn)物生物合成后修飾酶通過(guò)立體、區(qū)位選擇性地催化復(fù)雜天然產(chǎn)物的官能化反應(yīng)，如氧化酶(細(xì)胞色素P450酶、黃素依賴型加氧酶、α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶等)、糖基轉(zhuǎn)移酶、?；浮⒓谆D(zhuǎn)移酶、鹵化酶等，極大地拓寬了天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和生物學(xué)功能多樣性.當(dāng)然，也存在諸多修飾酶在骨架形成階段完成“線上修飾”，或在前體供應(yīng)階段參與非天然氨基酸或脂肪酸等衍生物的生物合成[13].

參與天然產(chǎn)物生物合成后修飾途徑的諸多氧化酶中，細(xì)胞色素P450酶分布最為廣泛，功能最為吸引人.細(xì)胞色素P450酶為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族，因其還原態(tài)與一氧化碳結(jié)合后的紫外-可見(jiàn)光譜在450 nm處具有最大吸收值而得名[14-15].P450酶的血紅素鐵基團(tuán)通過(guò)軸向保守半胱氨酸連接到脫輔基蛋白上，這是其特征光譜吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).自從P450作為一種色素從大鼠肝微粒體發(fā)現(xiàn)以來(lái)，關(guān)于P450酶的研究已有60余年的歷史[16].截至2021年10月，已有超過(guò)50萬(wàn)個(gè)編碼P450酶的基因序列被UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)收錄.且P450基因被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人類、動(dòng)物、植物、微生物甚至病毒中，展示了它們?cè)谧匀唤缰械亩鄻有訹17].P450酶具有催化反應(yīng)類型和底物結(jié)構(gòu)類型多樣的特點(diǎn)，在天然產(chǎn)物生物合成、異源物質(zhì)降解、類固醇激素生物合成和藥物代謝等諸多方面扮演著重要角色[7,18-22](圖1).因此，開(kāi)展對(duì)P450酶學(xué)及酶工程的研究，對(duì)于綠色可持續(xù)催化及應(yīng)用具有重要的理論和實(shí)踐意義.

圖1 細(xì)胞色素P450酶的應(yīng)用領(lǐng)域

P450酶被認(rèn)為是萬(wàn)能生物催化劑[23]，可在溫和條件下高選擇性地催化底物進(jìn)行不同類型的氧化反應(yīng)，除常見(jiàn)的羥基化、環(huán)氧化等反應(yīng)類型外，還包括脫羧、N/O-脫烷基、硝基化、C—S成鍵、C—C偶聯(lián)及斷裂反應(yīng)、螺環(huán)形成、C—N成鍵及C—N鍵去飽和等20多種非常規(guī)反應(yīng)，極大地拓寬了天然產(chǎn)物的化學(xué)空間[7,20,22,24-25].此外，P450酶的底物結(jié)構(gòu)類型幾乎涵蓋了自然界中發(fā)現(xiàn)的所有天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型，如萜類、聚酮類、脂肪酸、生物堿和多肽化合物等.由于大部分天然產(chǎn)物的化學(xué)骨架是由C—H鍵所構(gòu)筑形成的，P450酶能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)惰性C—H鍵的選擇性氧化活化，為改造天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及改善其水溶性、提供可修飾基團(tuán)，進(jìn)而改變其生物活性提供了重要選項(xiàng)和關(guān)鍵解決策略.

在P450酶的結(jié)構(gòu)、功能、酶工程改造等領(lǐng)域有許多出色的綜述總結(jié)[21,24]，本課題組長(zhǎng)期從事P450酶學(xué)與酶工程研究，在該領(lǐng)域開(kāi)展了具有重要推動(dòng)作用的工作，例如：首次發(fā)現(xiàn)了P450酶催化功能的可塑性[26]，系統(tǒng)性地提出了P450氧化還原伴侶(redox partners)的選擇性準(zhǔn)則[27]，提出CYP152家族催化機(jī)制新見(jiàn)解[28]，闡明了多種細(xì)菌、真菌P450酶在天然產(chǎn)物合成過(guò)程中的功能及催化機(jī)制[29-34].基于上述研究，本課題組先后撰寫(xiě)了多篇P450酶與天然產(chǎn)物生物合成相關(guān)的綜述：曾在NaturalProductReports雜志上兩次以封面文章的形式闡述了負(fù)責(zé)微生物天然產(chǎn)物中常規(guī)及非常規(guī)反應(yīng)的P450酶的來(lái)源、功能及催化機(jī)制[7,22]；系統(tǒng)概述了P450酶與微生物藥物創(chuàng)制[35]、P450酶催化系統(tǒng)的工程化改造及其在生物醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用[36]、P450酶的催化功能及其在生物合成和有機(jī)合成中的應(yīng)用[37]；綜述了參與脂肪酸生物合成的P450酶學(xué)及酶工程的研究進(jìn)展[38]；總結(jié)并展望了氧化還原伴侶與P450酶的相互作用及其對(duì)P450酶功能調(diào)控的重要作用[39].本文則聚焦于深海來(lái)源微生物天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶，以期為深海來(lái)源的P450酶的發(fā)掘、工程化改造以及功能研究和潛在應(yīng)用提供借鑒.

1 細(xì)胞色素P450酶的催化循環(huán)

一般而言，P450單加氧酶都需要氧化還原伴侶傳遞從NADH或還原型輔酶Ⅱ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)獲得的2個(gè)電子到亞鐵血紅素反應(yīng)中心實(shí)現(xiàn)氧分子的激活，其中一個(gè)氧原子參與形成一分子的產(chǎn)物水，另一個(gè)氧原子則修飾C—H鍵形成氧化基團(tuán).P450酶有一個(gè)共同的、復(fù)雜的催化循環(huán)過(guò)程，以典型的羥基化反應(yīng)為例(如圖2所示，反應(yīng)通式：R—H+O2+H++NAD(P)H→R—OH+NAD(P)++H2O)，概述P450酶的催化機(jī)制[36,40].首先，處于靜息態(tài)的P450酶(A)通常接受底物RH，RH取代活性部位的水分子，但不直接與鐵結(jié)合；與底物結(jié)合的高自旋配合物B的三價(jià)鐵FeⅢ被氧化還原伴侶傳遞來(lái)的一個(gè)電子還原為亞鐵FeⅡ(配合物C).隨后，一分子氧氣與FeⅡ結(jié)合形成[FeⅡO2]的復(fù)合物D，復(fù)合物D接收來(lái)自氧化還原伴侶傳遞來(lái)的第2個(gè)電子從而被還原為復(fù)合物E，復(fù)合物E從水溶液中獲得一個(gè)質(zhì)子生成[FeⅢ-OOH]的復(fù)合物F(Cpd 0)；Cpd 0的O—O鍵在獲得第2個(gè)質(zhì)子后異裂，釋放出一個(gè)水分子，生成含高價(jià)卟啉自由基陽(yáng)離子四價(jià)鐵[FeⅣO]的復(fù)合物G(Cpd Ⅰ)；這種反應(yīng)性極強(qiáng)的復(fù)合物G從底物中奪取一個(gè)氫原子，從而形成復(fù)合物H(CpdⅡ).接著，底物自由基與復(fù)合物H的羥基發(fā)生反應(yīng)得到復(fù)合物I.最后，羥化產(chǎn)物ROH從復(fù)合物I中解離并且水分子重新與FeⅢ配位，P450酶恢復(fù)到靜息態(tài)A.當(dāng)?shù)孜锓肿釉俅谓Y(jié)合到P450酶血紅素中心的活性位點(diǎn)時(shí)，重復(fù)啟動(dòng)相同的催化循環(huán).值得一提的是，P450酶也可以利用過(guò)氧化氫作為電子供體從而走“捷徑”來(lái)形成Cpd 0，進(jìn)一步形成CpdⅠ來(lái)完成底物催化.除依賴過(guò)氧化氫的P450過(guò)加氧酶(如CYP152家族)外，對(duì)于大多數(shù)P450單加酶來(lái)說(shuō)，其對(duì)過(guò)氧化氫的耐受性差且過(guò)氧化氫途徑的催化效率低，限制了該策略在P450酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用.

圖2 P450酶催化的C—H鍵選擇性氧化反應(yīng)循環(huán)過(guò)程

2 深海微生物來(lái)源天然產(chǎn)物生物合成過(guò)程的P450酶

目前，已鑒定的深海微生物來(lái)源的P450酶，主要參與聚酮類、非核糖體肽類及聚酮-非核糖體肽雜合類天然產(chǎn)物的生物合成過(guò)程.其催化反應(yīng)類型包括羥基化、環(huán)氧化、酮基化、硝基化、橋醚鍵構(gòu)筑、C—N成鍵反應(yīng)等，展現(xiàn)了P450酶在深?；钚蕴烊划a(chǎn)物的骨架構(gòu)筑、結(jié)構(gòu)修飾及活性提升中扮演著至關(guān)重要的角色.

2.1 聚酮類天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶

聚酮類化合物(polyketide)是一種由模塊化的聚酮合酶生物合成得到的天然產(chǎn)物，是重要的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型，具有抗腫瘤、降血脂、殺菌等生物活性[41-42].如來(lái)自土曲霉(Aspergillusterreus)的降血脂藥物洛伐他汀、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素、利福霉素、泰樂(lè)菌素等)、免疫抑制劑(雷帕霉素和FK506)、殺蟲(chóng)劑(阿維菌素和南昌霉素)、抗癌藥物(光輝霉素和多柔比星).聚酮類化合物骨架多樣性主要源于模塊式的Ⅰ型聚酮合酶、迭代式的Ⅱ型聚酮合酶和含可重復(fù)進(jìn)行縮合反應(yīng)的酮基合成酶結(jié)構(gòu)域的Ⅲ型聚酮合酶[41].值得一提的是，聚酮類化合物的生物合成過(guò)程中，往往存在P450酶催化反應(yīng)的蹤影.

heronamide類化合物擁有獨(dú)特的膜結(jié)合能力，并且可能影響細(xì)胞形態(tài)[43-44].Zhu等[45]報(bào)道了分離自印度洋孟加拉灣的一株深海(3 412 m)鏈霉菌Streptomycessp.SCSIO 03032的聚酮類化合物heronamide F的生物合成基因簇及生物合成途徑.為了研究heronamide F生物合成基因簇中編碼P450酶的基因herO的功能，他們首先基于同源重組的策略構(gòu)建了herO的阻斷突變株，經(jīng)發(fā)酵和產(chǎn)物鑒定后發(fā)現(xiàn)其主要積累由8個(gè)Ⅰ型聚酮合酶(Her-A1A2BCDEFG)順序加載裝配、環(huán)化釋放的8-脫氧-heronamide F.為進(jìn)一步驗(yàn)證HerO的體外功能，他們將HerO與本課題組開(kāi)發(fā)的來(lái)自紅球菌(Rhodococcussp.)NCIMB 9784的伴侶蛋白R(shí)hFRED融合得到HerO-RhFRED，在添加NADPH或NADH作為電子供體時(shí)，特異地催化8-脫氧-heronamide F的C-8位羥基化反應(yīng)，得到heronamide F(圖3(a)).以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HerO是負(fù)責(zé)催化8-脫氧-heronamide F羥基化反應(yīng)的關(guān)鍵氧化酶[45].

abyssomicin是一類結(jié)構(gòu)新穎的多環(huán)聚酮類化合物，具有豐富的藥理活性[46-47].從深海來(lái)源的鏈霉菌S.koyangensisSCSIO 5802中分離得到多個(gè)abyssomicin類化合物，如具有增強(qiáng)人淋巴中免疫缺陷病毒Ⅰ型復(fù)制的neoabyssomicin A和C[48]，抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的abyssomicin 2、neoabyssomicin F和G二聚體[49].通過(guò)全基因組測(cè)序、生物信息學(xué)分析、基因敲除及異源表達(dá)等手段，Tu等[50]初步完成了S.koyangensisSCSIO 5802中neoabyssomicin/abyssomicin生物合成基因簇的鑒定及生物合成機(jī)制推測(cè)：3個(gè)Ⅰ型聚酮合酶AbmB1～AbmB3負(fù)責(zé)C16的聚酮鏈的生物合成，進(jìn)一步在AbmA1～AbmA5等作用下連接C3結(jié)構(gòu)單元并環(huán)化得到獨(dú)特的tetronate環(huán)；最終經(jīng)第爾斯-阿爾德反應(yīng)、氧化反應(yīng)得到含獨(dú)特橋醚環(huán)結(jié)構(gòu)的abyssomicin 2.

L-pip.L-(4-羥基化)六氫噠嗪酸.

除此之外，Zhang等[52]針對(duì)深海來(lái)源的橄欖鏈霉菌(S.olivaceus)SCSIO T05的全基因組分析發(fā)現(xiàn)了一條聚酮類化合物lobophorin CR4的生物合成基因簇，簇內(nèi)包含了一個(gè)可能參與其生物合成過(guò)程的P450基因lbpP1，但其具體的催化功能尚無(wú)相關(guān)生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)證據(jù).

2.2 非核糖體肽類天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶

非核糖體肽類經(jīng)由一類模塊化的NRPS生物合成得到，其生物活性豐富，如抗菌劑(萬(wàn)古霉素、短桿菌素、達(dá)托霉素、棘白霉素類藥物等)、免疫抑制劑環(huán)孢菌素、抗腫瘤藥物羅米地辛等[53].一個(gè)基本NRPS模塊主要由負(fù)責(zé)識(shí)別激活氨基酸的腺苷酰化結(jié)構(gòu)域(adenylation domain)、掛載肽鏈的肽酰載體蛋白結(jié)構(gòu)域(peptidyl carrier protein domain，PCP)和催化氨基酸之間形成肽鍵的縮合結(jié)構(gòu)域(condensation domain)組成[54-55].在非核糖體肽類天然產(chǎn)物生物合成過(guò)程中，既有負(fù)責(zé)修飾氨基酸前體產(chǎn)生非天然氨基酸的P450酶，也有以NRPS加載產(chǎn)生環(huán)肽骨架再進(jìn)行后修飾的P450酶[7].

Ma等[56]從深海來(lái)源的鏈霉菌S.atratusSCSIO ZH16發(fā)酵產(chǎn)物中獲得6個(gè)怡萊霉素化合物(ilamycins B1、B2、C1、C2、D、E1)，從其突變株中分離得到怡萊霉素E2和F1.怡萊霉素類化合物也可以通過(guò)抑制來(lái)自結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumturberculosis)中靶標(biāo)蛋白ClpC1的活性從而造成胞內(nèi)代謝紊亂，進(jìn)而發(fā)揮抗結(jié)核活性[57]，其中怡萊霉素E對(duì)結(jié)核分支桿菌 的最小抑制濃度可達(dá)9.8 nmol/L，目前已完成該抗結(jié)核化合物的成藥性評(píng)價(jià)，展現(xiàn)了其在結(jié)核病治療中的應(yīng)用前景；怡萊霉素C和E可通過(guò)不同的途徑引起三陰乳腺癌細(xì)胞凋亡[58-59].

從結(jié)構(gòu)上分析，怡萊霉素是由7個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，結(jié)構(gòu)中含有罕見(jiàn)的L-2-氨基-4-己烯酸、3-硝基-L-酪氨酸和異戊烯基化的色氨酸結(jié)構(gòu)單元.根據(jù)怡萊霉素的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)生物信息學(xué)分析、基因敲除、前體飼喂、同位素標(biāo)記等多維策略，確定了負(fù)責(zé)怡萊霉素的生物合成基因簇和從異戊烯基化的色氨酸出發(fā)的NRPS骨架結(jié)構(gòu)生物合成過(guò)程[56].

在怡萊霉素的生物合成過(guò)程中共有4個(gè)P450酶的參與，Ma等[56]對(duì)它們進(jìn)行了細(xì)致的生物信息學(xué)分析及體內(nèi)功能闡明，2個(gè)P450酶(IlaD和IlaN)負(fù)責(zé)非天然氨基酸前體的生物合成，另外2個(gè)P450酶(IlaL和IlaR)則負(fù)責(zé)怡萊霉素中亮氨酸末端甲基的羧基化及異戊烯基的環(huán)氧化，具體如下(圖3(c))：1)通過(guò)敲除編碼Ⅰ型聚酮合酶的基因ilaE或編碼P450酶的基因ilaD，發(fā)現(xiàn)突變株均無(wú)法產(chǎn)生怡萊霉素，飼喂L-2-氨基-4-己烯酸后突變株可恢復(fù)怡萊霉素的生成；飼喂13C標(biāo)記的乙酸鈉，發(fā)現(xiàn)分離獲得的怡萊霉素中L-2-氨基-4-己烯酸中的碳信號(hào)出現(xiàn)增益，充分說(shuō)明IlaE負(fù)責(zé)其聚酮鏈的生物合成，P450酶IlaD則催化掛載于?；d體蛋白(acyl carrier protein,ACP)的己烯片段的α-位四電子連續(xù)氧化成酮基，隨后經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶IlaH的催化形成α-氨基并由Ⅱ型硫酯酶IlaF水解釋放.2)敲除怡萊霉素生物合成基因簇中的一氧化氮合酶基因ilaM和P450酶基因ilaN，突變株均喪失怡萊霉素的合成能力，回補(bǔ)3-硝基-L-酪氨酸使得怡萊霉素的生產(chǎn)得以恢復(fù)，說(shuō)明它們參與到L-酪氨酸的硝基化過(guò)程.其中，IlaM負(fù)責(zé)催化精氨酸釋放一氧化氮；P450酶IlaN則繼續(xù)以一氧化氮和色氨酸作為底物，實(shí)現(xiàn)色氨酸苯環(huán)上的硝基化反應(yīng)，其催化機(jī)制很可能類似于thaxtomin生物合成過(guò)程中的P450酶TxtE[60-61].3)P450酶基因ilaL的阻斷突變株主要積累NRPS IlaS負(fù)責(zé)合成的怡萊霉素B1及環(huán)氧化產(chǎn)物B2，表明P450酶IlaL負(fù)責(zé)催化亮氨酸末端甲基連續(xù)氧化成羧基.4)P450酶基因ilaR被阻斷后，突變株中則主要積累怡萊霉素B1、E1、E2和F，即不再產(chǎn)生環(huán)氧異戊烯基怡萊霉素，表明IlaR負(fù)責(zé)環(huán)氧基團(tuán)的生成.其中，怡萊霉素E1和E2是IlaL氧化怡萊霉素B1形成的中間體經(jīng)自發(fā)的C—N成鍵形成六元環(huán)后產(chǎn)生的.

隨后，基于鏈霉菌S.atratusSCSIO ZH16的全基因組信息及次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的分析，Sun等[62]成功激活其中一個(gè)非核糖體肽類天然產(chǎn)物基因簇，并獲得了含肉桂酸結(jié)構(gòu)單元的atratumycin類化合物.活性測(cè)試表明atratumycin對(duì)致病菌結(jié)核分枝桿菌展現(xiàn)出較好的抑制活性，可在微摩爾級(jí)發(fā)揮效用.相應(yīng)的基因敲除及突變體發(fā)酵產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，atratumycin主要經(jīng)由3個(gè)NRPS(Atr21～23)共7個(gè)模塊負(fù)責(zé)合成，其由一分子鄰甲基肉桂酸和甘氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-纈氨酸、L-脯氨酸、D-天冬酰胺及2S,3S-3-羥基苯丙氨酸共10個(gè)氨基酸組成.敲除NRPS基因atr23和P450酶基因atr27，突變株均無(wú)法生物合成atratumycin.他們進(jìn)一步嘗試?yán)脕?lái)自聚球藻的氧化還原伴侶組合Fdx_1499/FdR_0978和菠菜的氧化還原伴侶組合spFdx/spFdR來(lái)體外重建Atr27對(duì)L-苯丙氨酸的催化反應(yīng)活性，發(fā)現(xiàn)Atr27無(wú)法催化L-苯丙氨酸的羥基化反應(yīng)[62].以上體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Atr27很可能是在NRPS合成線上實(shí)現(xiàn)苯丙氨酸的選擇性羥基化反應(yīng)(圖3(d)).

Zhou等[63]從我國(guó)南海深海(1 396 m)沉積物中分離得到的鏈霉菌S.drozdowicziiSCSIO 10141的發(fā)酵液中分離得到6個(gè)新環(huán)肽類化合物，命名為甲哌霉素(marformycins)A～F，其結(jié)構(gòu)骨架主要由一分子L-蘇氨酸、L-亮氨酸、N-甲基-纈氨酸、(4-羥基化)六氫噠嗪酸(piperazic acid)、D-別異亮氨酸或D-纈氨酸、O-甲基-D-酪氨酸、L-別異亮氨酸或L-纈氨酸共7個(gè)氨基酸所組成.體外活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)甲哌霉素A～E對(duì)條件致病菌藤黃微球菌(Micrococcusluteus)具有較好的抑制活性且無(wú)顯著的細(xì)胞毒性.隨后，Liu等[64]對(duì)S.drozdowicziiSCSIO 10141進(jìn)行全基因組測(cè)序并獲得含20個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORFs)的長(zhǎng)約45 kb的甲哌霉素生物合成物基因簇mfn，并結(jié)合基因敲除實(shí)驗(yàn)完成了對(duì)該基因簇的功能鑒定.甲哌霉素的骨架由5個(gè)NRPS(MfnC、MfnD、MfnE、MfnK和MfnL，累計(jì)7個(gè)模塊共26個(gè)結(jié)構(gòu)域)通過(guò)連續(xù)的氨基酸識(shí)別、修飾、縮合并釋放得到.他們敲除編碼P450酶的mfnN基因發(fā)現(xiàn)突變株無(wú)法產(chǎn)生甲哌霉素C、D和E，主要積累甲哌霉素A、B和F，暗示P450酶MfnN可能以釋放后的環(huán)肽骨架作為底物，催化六氫哌嗪酸的4-位選擇性羥基化反應(yīng)(圖3(e)).但目前不能排除識(shí)別六氫哌嗪酸的腺苷酰化結(jié)構(gòu)域具有寬泛的底物特異性，能夠同時(shí)識(shí)別羥基化和非羥基化六氫哌嗪酸作為底物并加載到結(jié)構(gòu)骨架中；或者腺苷?；Y(jié)構(gòu)域識(shí)別非羥基化的六氫哌嗪酸并裝載到ACP結(jié)構(gòu)域后，由MfnN催化裝配線上的羥基化.因此，該P(yáng)450酶的具體反應(yīng)機(jī)制還需更進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí).

來(lái)自深海放線菌MarinactinosporathermotoleransSCSIO 00652的methylpendolmycin 和pendolmycin為含吲哚結(jié)構(gòu)的內(nèi)酰胺類化合物.其中，methylpendolmycin具有抑制佛波酯(phorbol ester)與蛋白激酶C結(jié)合的生物活性[65]；pendolmycin則可抑制人皮膚鱗癌細(xì)胞A431中表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的磷脂酰肌醇周轉(zhuǎn)[66].Ma等[67]通過(guò)對(duì)M.thermotoleransSCSIO 00652的基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析定位，鎖定了methylpendolmycin/pendolmycin的生物合成基因簇；采取逐一敲除核心基因mpnABCDEF的策略結(jié)合蛋白質(zhì)同源比對(duì)分析，完成了生物合成基因簇mpn中關(guān)鍵基因功能的解析.作為雙模塊的NRPS蛋白，MpnB首先激活L-異亮氨酸或L-纈氨酸，且其甲基化結(jié)構(gòu)域(methylation domain)催化該氨基酸的N-甲基化，第2個(gè)模塊激活裝載L-色氨酸并催化其與L-異亮氨酸或L-纈氨酸的縮合得到二肽結(jié)構(gòu)骨架；P450酶MpnC則催化該二肽分子內(nèi)(化合物9)的C—N鍵(非常規(guī)P450酶反應(yīng))形成；最后，經(jīng)異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶MpnD的催化得到相應(yīng)的終產(chǎn)物(圖3(f)).MpnC的催化機(jī)制很可能與參與indolactam V生物合成的P450酶TleB(來(lái)自鏈霉菌S.blastmyceticus)和HinD(來(lái)自Streptoalloteichushindustanus)一致，即P450酶通過(guò)3種可能的中間體完成C—N成鍵反應(yīng)：1)催化底物N-甲基-L-纈氨酸-L-色氨醇形成苯環(huán)雙鍵環(huán)氧化中間體；2)催化底物上仲胺基團(tuán)脫氫形成氮自由基；3)催化底物上仲胺基團(tuán)及苯環(huán)脫氫形成雙自由基中間體[68].

Fan等[69]和Liu等[70]從一株深海來(lái)源的真菌Dichotomomycescejpii中分離獲得了一系列膠霉毒素(gliotoxin)類化合物.膠霉毒素是經(jīng)NRPS途徑生物合成得到的含二硫橋的二酮哌嗪化合物，具備多種生物活性，如免疫抑制活性和細(xì)胞毒性等.膠霉毒素的生物合成途徑在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中得到初步解析[71].通過(guò)基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，Ye等[72]在D.cejpii基因組中鎖定了膠霉毒素的生物合成基因簇gli，結(jié)合已鑒定的同源基因簇中的基因功能，推測(cè)P450酶GliF可能參與環(huán)二肽骨架中苯丙氨酸和絲氨酸α-位碳原子的羥基化反應(yīng)以及后續(xù)的非常規(guī)C—N成鍵反應(yīng)(圖3(g)).

2.3 聚酮-非核糖體肽雜合類天然產(chǎn)物生物合成中的P450酶

聚酮-非核糖體肽雜合類天然產(chǎn)物是由PKS和NRPS共同負(fù)責(zé)核心骨架的生物合成.其中，NRPS的縮合結(jié)構(gòu)域往往負(fù)責(zé)實(shí)現(xiàn)氨基酸與裝載在PKS上的酰基結(jié)構(gòu)單元之間的縮合反應(yīng)；相應(yīng)的骨架進(jìn)一步通過(guò)以P450酶為代表的后修飾酶完成氧化、C—C成鍵、C—N成鍵等修飾作用[73].該類化合物具有良好的生物活性，在臨床上應(yīng)用廣泛，典型的代表如雷帕霉素(rapamycins)、埃博霉素(epothilones)等.

多環(huán)特特拉姆酸大環(huán)內(nèi)酰胺(polycyclic tetramate macrolactams，PTMs)是一類母核結(jié)構(gòu)經(jīng)PKS-NRPS雜合途徑生物合成由特特拉姆酸(tetramic acid)結(jié)構(gòu)和多環(huán)體系(常為2～3環(huán))構(gòu)成的內(nèi)酰胺類化合物，具備抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌等生物活性[74].Hou等[75]前期通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化的策略從來(lái)自中國(guó)南海深海的鏈霉菌S.somaliensisSCSIO ZH66中分離得到的新PTM類化合物somamycin A～D，對(duì)植物致病真菌以及腫瘤細(xì)胞具有不同程度的抑制活性，且抑制活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照抗生素制霉菌素.基于全基因組數(shù)據(jù)及生物信息學(xué)分析成功地鑒定了somamycin的生物合成基因簇ptm，但其中預(yù)測(cè)為P450酶的編碼基因orf7的功能并未得到闡明.該課題組的最新研究[76]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)同源重組的策略敲除ptm中的orf7后，突變株中主要積累somamycin D但無(wú)法產(chǎn)生somamycin C，因此，Orf7很可能負(fù)責(zé)駢環(huán)結(jié)構(gòu)的氧化修飾，即負(fù)責(zé)將somamycin D的14-位羥基進(jìn)一步氧化為羰基(圖3(h)).

Ding等[77]針對(duì)深海來(lái)源的S.koyangensisSCSIO 5802的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了一條PKS-NRPS雜合的長(zhǎng)度約16 kb的生物合成基因簇sko，通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其負(fù)責(zé)10-epi-HSAF(10-epi-heat-stable antifungal factor)和一個(gè)新的PTM類化合物koyanamide A的生物合成.該基因簇sko中存在一個(gè)推測(cè)編碼P450酶的基因skoE，可能參與koyanamide A中的[4+4]環(huán)加成反應(yīng)，但目前仍缺乏相應(yīng)的體內(nèi)或者體外生理生化的實(shí)驗(yàn)證據(jù)(圖3(i)).已鑒定的參與天然產(chǎn)物生物合成的深海來(lái)源P450酶匯總于表1.

表1 已鑒定的參與天然產(chǎn)物生物合成的深海來(lái)源P450酶

除以上概述的結(jié)構(gòu)類型外，在深海鏈霉菌生物堿類化合物的生物合成基因簇中也發(fā)現(xiàn)了P450酶基因的蹤跡.Ma等[78]在研究一株來(lái)自深海的鏈霉菌Streptomycessp.SCSIO 03032中產(chǎn)生的具有抗菌、抗腫瘤活性的吲哚咔唑類生物堿spiroindimicins的生物合成機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，P450酶編碼基因spmP位于編碼chromopyrrolic acid 合成酶的關(guān)鍵基因spmD的下游.盡管SpmP與已鑒定的參與吲哚咔唑類生物堿星形孢菌素(staurosporine)生物合成的P450酶StaP的相似度達(dá)到57%，但有趣的是，敲除spmP并未影響Streptomycessp.SCSIO 03032中spiroindimicins的生物合成，暗示著SpmP可能不參與其生物合成或者簇外存在功能補(bǔ)償?shù)娜哂郟450酶編碼基因.

3 總結(jié)與展望

長(zhǎng)期以來(lái)，深海探測(cè)采樣和原位培養(yǎng)等技術(shù)手段的匱乏極大地限制了人們對(duì)深海生物資源的開(kāi)發(fā)利用.近年來(lái)，隨著科學(xué)家們針對(duì)深海來(lái)源天然產(chǎn)物的化學(xué)生物學(xué)以及生態(tài)學(xué)研究的逐步深入，若干P450酶被發(fā)現(xiàn)參與它們的生物合成過(guò)程，呈現(xiàn)出多樣化的催化反應(yīng)類型(羥基化、酮基化、C—N成鍵、硝基化等)，豐富了現(xiàn)有的P450酶天然資源庫(kù)(圖4).鑒于深海環(huán)境的獨(dú)特性，深海來(lái)源的P450酶可能具有耐鹽(比如來(lái)自咸海鮮球菌(Jeotgalicoccussp.ATCC 8456)的P450酶OleTJE便展現(xiàn)出中度嗜鹽的特性[79])、抗逆性強(qiáng)等諸多特性，這為P450酶工程改造及生物催化應(yīng)用提供了很好的候選酶.

圖4 深海來(lái)源P450酶的一般研究策略及潛在意義

隨著深海探測(cè)技術(shù)和宏基因組測(cè)序的長(zhǎng)足進(jìn)步，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中P450酶的編碼基因數(shù)量呈現(xiàn)急劇增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，其中包含數(shù)量可觀的深海來(lái)源的真菌、細(xì)菌乃至病毒的P450酶編碼基因[54]，展示了深海P450酶庫(kù)開(kāi)發(fā)和研究的無(wú)窮潛力.目前，深海來(lái)源P450酶的研究主要集中于放線菌來(lái)源，特別是側(cè)重于天然產(chǎn)物生物合成過(guò)程中P450酶的生理生化功能研究，而催化機(jī)制和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究相對(duì)滯后.形成鮮明對(duì)比的是，深海真菌、藻類及動(dòng)物來(lái)源P450酶的研究則較為稀缺，對(duì)于一些參與異源毒素降解或者孤兒P450酶(Orphan P450)的生物學(xué)功能探究更是匱乏.

從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展來(lái)看，對(duì)于深海P450酶的挖掘、功能鑒定及潛在應(yīng)用的探索和研究仍需要多學(xué)科的交叉融合、相輔相成(圖4)：1)設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)精良的深海裝備，促進(jìn)對(duì)深海生物資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)及獲??；2)不可培養(yǎng)的深海微生物獲得以及原位培養(yǎng)技術(shù)的突破；3)結(jié)合表觀遺傳修飾、大規(guī)模發(fā)酵、全基因組測(cè)序、沉默基因激活等不同的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)含P450酶基因的天然產(chǎn)物生物合成基因簇的功能研究；4)宏基因組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析，獲取深海環(huán)境中的P450酶基因并構(gòu)建相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合α-fold等蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)進(jìn)行同源建模和功能預(yù)測(cè)；5)針對(duì)具備工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的P450酶，開(kāi)展結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、定向進(jìn)化等方面的研究，從而實(shí)現(xiàn)高活性和高選擇性P450酶的研制以適應(yīng)產(chǎn)業(yè)的需求.相信通過(guò)對(duì)深海來(lái)源P450酶的多維研究，將極大地豐富對(duì)P450酶參與天然產(chǎn)物生物合成過(guò)程中的功能認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步充實(shí)P450生物催化元件庫(kù)而助力合成生物學(xué)和相關(guān)工業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展.