黑龍江立克次體感染對小鼠脾臟免疫相關基因轉錄的影響

于永慧，段長松，焦俊，趙月峨，周冬生，溫博海，歐陽譞，熊小路

軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

黑龍江立克次體(Rickettsia heilongjiangensis)是遠東斑點熱(far eastern spotted fever，F(xiàn)ESF)的病原體，屬于斑點熱群立克次體(spotted fever group rickettsiae，SFGR)，1983年由我國科學家分離并鑒定，是我國主要的斑點熱流行株[1]。黑龍江立克次體為革蘭陰性專性胞內寄生菌，在自然界中通過蜱叮咬感染人。人感染后，普遍出現(xiàn)多器官病灶炎性損傷、炎性浸潤及脾大等。脾臟作為立克次體感染的主要靶器官，是人體最大的外周免疫器官及成熟淋巴細胞聚集區(qū)，也是發(fā)生免疫應答的重要器官。機體感染病原體后產生的免疫應答分為即刻天然免疫應答(0～4 h)、早期誘導天然免疫應答(4～96 h)及獲得性免疫應答(>96 h)3個階段。有研究對恙蟲病立克次體感染內皮細胞的轉錄情況進行分析發(fā)現(xiàn)，感染早期(1～3 h)有40個轉錄因子發(fā)生明顯變化，其中在感染3 h后白細胞介素(interleukin，IL)-6、趨化因子CCL2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)、IL-10等因子的表達明顯上調[2]。在康氏立克次體(Rickettsia conorii)感染小鼠3 d的肺部轉錄組研究中，有206個長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)明顯上調、277個明顯下調。細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)能夠通過識別被感染細胞表面的主要組織相容性復合體Ⅰ類(major histocompatibility complex class I，MHC-Ⅰ)分子，分泌γ干擾素(IFN-γ)，以增強宿主抵抗澳大利亞立克次體(Rickettsia australis)感染的能力[3]。本研究分析了黑龍江立克次體感染后小鼠免疫相關基因的轉錄變化，旨在明確機體抵抗黑龍江立克次體感染的免疫調控過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細胞株 黑龍江立克次體054株(Rickettsia heilongjiangensisstr. 054，ATCC VR-1524)為本實驗室保存。非洲綠猴腎細胞E6株(Vero-E6)購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.1.2 實驗動物 5周齡SPF級雌性C3H/HeN小鼠20只，體重14～15 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。小鼠在軍事醫(yī)學研究院豐臺動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)及實驗操作均符合軍事醫(yī)學研究院實驗動物倫理委員會的要求。

1.1.3 主要試劑及儀器 Trizol(15596-062)購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基(SH3022.01B)、胎牛血清(SH30070.03)、胰蛋白酶(SH30042.02)、磷酸鹽緩沖液(P BS，SH 3 0 2 5 6.0 1 B)購自美國Hyclone公司；復方泛影葡胺注射液(國藥準字H31021607)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；異丙醇(80109218)、無水乙醇(10009218)購自國藥集團化學試劑有限公司；DEPC處理水(R1600)、去離子水(F0025)購自北京索萊寶科技有限公司。細胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱購自日本Sanyo公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司；生物安全柜Ⅱ購自美國Nuaire公司；高速冷凍離心機購自美國Beckman公司；微量分光光度計購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 黑龍江立克次體培養(yǎng)及純化 復蘇Vero-E6細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種于T175細胞培養(yǎng)瓶(每瓶約2×107個)，置于37 ℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)至細胞單層。按感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=20將立克次體懸液加到預先培養(yǎng)好的Vero-E6細胞單層上，33 ℃吸附4 h。補充含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于33 ℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)。當感染黑龍江立克次體的Vero-E6細胞出現(xiàn)嚴重的空斑樣脫落時富集細胞。富集的細胞經(jīng)玻璃珠破碎后，以400×g離心20 min，收集上清，采用泛影葡胺密度梯度離心法純化黑龍江立克次體[4]，菌體沉淀用PBS重懸，保存于–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黑龍江立克次體感染小鼠 采用隨機抽樣法將20只小鼠分為未感染組(0 hpi)、感染3 h組(3 hpi)、感染3 d組(3 dpi)和感染6 d組(6 dpi)，每組5只。在Ⅲ級生物安全實驗室內，將5×106個菌落形成單位(CFU)的黑龍江立克次體自尾靜脈注射感染小鼠。在4個時相點解剖該組5只小鼠取脾，每個脾剪碎后稱取100 mg，立即置入裝有1 ml Trizol溶液的EP管中。使用手動研磨器將脾臟研磨均勻，室溫靜置15 min后置于–20 ℃冰箱凍存，2 h后轉移至–80 ℃冰箱保存，待所有樣品收集完后提取總RNA。

1.2.3 總RNA提取及測序 每組取出凍存的樣品1 ml，在室溫解凍后采用Trizol法提取總RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測總RNA濃度、RIN值、28S/18S及片段大小。利用Oligo-dT磁珠純化mRNA，經(jīng)片段化處理后，進行cDNA合成及磁珠純化，純化后的cDNA經(jīng)A堿基及Adapter連接并行磁珠純化，利用PCR反應及磁珠純化獲得文庫檢測樣本。采用Agilent 2100 Bioanalyzer進行文庫檢測，測序由Illumina Solexa HiSeq 2000平臺完成，采用100 bp雙端測序，文庫使用插入片段330 bp的鏈特異性文庫，每個樣品設計測序數(shù)據(jù)產出為40 M reads，數(shù)據(jù)產出量為每個樣品8 GB。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)處理與分析 采用Cut adapt(v1.15)對測序所得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進行過濾，得到純凈序列(clean reads)用于后續(xù)分析。采用TopHat2 v2.0.4軟件[5]將clean reads回貼至小鼠基因組(mm9)。采用軟件Cufflinks 2.0分析4個測序樣本回貼至基因組后的比對結果，重新構建轉錄本。單個樣本構建的轉錄本集合并不完全，或者可能并未構建出全長，因此用軟件Cuffcompare 2.0將4個樣本中鑒定到的所有轉錄本進行差補、均一化合并成統(tǒng)一的轉錄本矩陣(同一轉錄本出現(xiàn)多次采用最高的讀數(shù)作為該轉錄本的定量信息)[6]。采用軟件Cuffdiff 2.0計算4個測序樣本的JS散度(Jensen Shannon score，JS score)。

1.2.5 免疫相關特異性轉錄基因篩選 對小鼠基因進行功能注釋分析，按照GO功能分類的天然免疫(GO:0045087)、獲得性免疫(GO:0002250)及炎癥反應(GO:0006954)，將特異性轉錄基因中免疫相關基因提取出來。采用軟件Cuffdiff 2.0定量分析免疫相關基因的表達，篩選免疫相關顯著的特異性轉錄基因。篩選條件為：與感染前(0 hpi)相比，感染后3個時相免疫相關基因轉錄差異倍數(shù)|log2(Fold change)|>1。

1.2.6 功能富集分析 利用R包ClusterProfiler對黑龍江立克次體感染小鼠后轉錄差異基因進行功能富集分析?；谌斯づ凶x文獻及基因注釋，選取天然免疫相關基因、獲得性免疫相關基因、炎癥反應相關基因并進行分析。KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)這3類基因顯著富集于參與感染相關過程的通路。

1.3 統(tǒng)計學處理 轉錄差異基因通過JS score分析，用于度量兩個概率分布的相似度，其取值為0～1間的連續(xù)變量，隨基因表達特異性增強而增大[7]，根據(jù)經(jīng)驗值以JS score>0.9作為各時相特異性轉錄基因的篩選條件。GO與KEGG以轉錄組差異基因變化倍數(shù)|log2(倍數(shù))|>1為具有顯著性差異；免疫功能轉錄差異基因R語言功能富集以–log10(qvalue) >1.3為具有顯著性差異。P<0.05為顯著性富集。

2 結 果

2.1 黑龍江立克次體感染小鼠脾臟組織轉錄組測序結果 本實驗樣品所有reads (讀長)的4種堿基分布均勻(圖1A)，且測序質量>20(圖1B)，得到219 930個轉錄本(表1)，0 hpi、3 hpi、3 dpi、6 dpi 4個時相分別篩選出特異性轉錄基因164、152、90、122個。

圖1 miRNA測序reads質量評估Fig. 1 Quality control of obtained sequencing reads

表1 清除冗余reads后的轉錄本及多外顯子數(shù)目Tab. 1 The number of transcripts and multi-exon after clearing redundant reads

2.2 時相轉錄差異基因GO富集分析 在顯著上調的前30個GO富集通路中，0 hpi時，小鼠脾臟MAPK信號通路、葡萄糖轉運、肌纖維組裝等基礎生理功能明顯上調(P<0.05)(圖2A)；3 hpi時，脾臟細胞中趨化因子受體結合、趨化因子活性、巨噬細胞等天然免疫反應通路明顯上調(P<0.05)(圖2B)；3 dpi時，鳥苷酸激酶/L型鈣通道區(qū)域、蛋白酪氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶活性等明顯上調(P<0.05)(圖2C)；6 dpi時，抗生素、2Fe-2S鐵氧還蛋白、鐵硫蛋白結合位點、黃嘌呤脫氫酶等明顯上調(P<0.05)(圖2D)。

圖2 時相轉錄差異基因GO富集分析Fig. 2 GO enrichment analysis of phase transcription difference gene

2.3 免疫功能轉錄差異基因分析 GO注釋分析結果顯示，分別有35個天然免疫相關基因(圖3A)、31個獲得性免疫相關基因(圖3B)及41個炎癥反應相關基因(圖3C)轉錄發(fā)生顯著性變化(P<0.05)。維恩分析顯示，免疫相關特異性轉錄基因具有時相差異性及共同性，其中感染后3個時相(3 hpi、3 dpi、6 dpi)分別有7、6、6個基因特異性轉錄，有37個共同基因特異性轉錄(圖3D)。在天然免疫相關基因中，顯著特異性轉錄基因有irg1、ccl2、il12b、cd14、ubd、gbp10；在獲得性免疫相關基因中，顯著特異性轉錄基因有gzmb、batf、irf7、fcgr1、il18bp、cr2、c4b；在炎癥反應相關基因中，顯著特異性轉錄基因有il27、nos2、cxcl11、cxcl10、cxcl9、il10。

圖3 小鼠感染黑龍江立克次體后3個時相免疫相關特異性轉錄基因分析Fig. 3 Immune-related specific transcription genes in 3 phases after mice infection of Reckettsia helongjinggensis

2.4 免疫功能轉錄差異基因R語言功能富集分析結果 早期激活信號受體通路、中期激活胞內信號傳導通路、晚期激活細胞凋亡通路及細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路貫穿黑龍江立克次體感染全過程，且在早期感染階段炎癥反應相關基因顯著性富集(P<0.05) (圖4)。

圖4 免疫相關轉錄差異基因的R語言富集分析Fig. 4 R language enrichment analysis of immune-related transcriptional differential genes

2.5 免疫功能轉錄差異基因KEGG可視化功能分析結果 在黑龍江立克次體感染早期，細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路中有21個基因顯著性富集，主要包含16個趨化因子家族基因，其中CC子集包含ccl3、ccl4、ccl8、ccl11、ccl12、ccr7、ccr3、ccr5共8個基因，CXC子集包含cxcl1、cxcl2、cxcl5、cxcl9、cxcl10、cxcl13、cxcl11、cxcr3共8個基因(圖5)。

圖5 細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路的KEGG可視化功能分析Fig. 5 KEGG visual function analysis of cytokine-cytokine receptor interaction signaling pathway

3 討 論

在自然界，立克次體通過節(jié)肢動物的叮咬進入宿主血液，沿血行擴散到身體其他部位。有研究發(fā)現(xiàn)，Balb/c小鼠感染黑龍江立克次體后，出現(xiàn)類似人感染立克次體的特征，包括血源散布性、多器官病灶炎性損傷及炎性浸潤、脾大等[4]。本研究選用對斑點熱立克次體敏感的C3H/HeN小鼠作為模型鼠，采用尾靜脈注射的方法模擬節(jié)肢動物叮咬，使黑龍江立克次體直接進入小鼠血液循環(huán)系統(tǒng)引起感染。

在天然免疫進程中，IFN-γ可誘導巨噬細胞活化，使其對胞內病原菌的殺傷作用顯著增強[8]，并具有誘導T細胞向Th1(T-helper 1，Th1)亞群分化、促進CTL分化并增強其殺傷功能等多種免疫活性，是哺乳動物對抗胞內寄生菌入侵發(fā)揮重要作用的細胞因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，與IFN-γ相關的gbp10、irg1、ccl2、ubd基因轉錄水平顯著升高；感染3 d后其表達量逐漸下降，但仍維持較高的水平，提示小鼠感染黑龍江立克次體后脾臟細胞對IFN-γ的應答活躍。IL-12b是IL-12的一個亞基，IL-12由活化的巨噬細胞分泌，主要作用于T細胞及自然殺傷(natural killer，NK)細胞，促進其分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α等細胞因子[10]。本研究結果顯示，小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，IL-12b轉錄水平顯著升高，提示NK細胞數(shù)量增加，IFN-γ大量產生，機體啟動了抗立克次體天然免疫。CD14是革蘭陰性菌脂多糖(LPS)及LPS結合蛋白復合物的高親和力受體，能介導LPS對細胞的刺激作用，通過激活核轉錄因子(NF)-κB及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)兩條通路促進IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子的釋放[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，CD14基因轉錄水平升高約30倍，隨后逐漸下降，但仍維持在較高水平，提示黑龍江立克次體的LPS具有刺激CD14+免疫細胞增殖的作用。

獲得性免疫相關基因中，gzmb基因編碼一種絲氨酸蛋白酶(granzyme B，GZMB)，其主要來自CTL及NK細胞釋放的細胞質顆粒。CTL在識別被感染細胞的膜表面異己成分后，通過釋放GZMB至被感染細胞內，誘導被感染細胞凋亡，因此GZMB在誘導細胞凋亡中起關鍵作用[12]。本研究結果顯示，gzmb是轉錄上調最顯著的獲得性免疫相關基因，提示感染6 d后，CTL通過細胞凋亡途徑高效、特異地殺傷感染立克次體的細胞?？贵wFc受體fcgr1基因在感染3 d、6 d后均轉錄上調，提示宿主產生抗體依賴的細胞毒作用，殺傷被立克次體感染的細胞。C4B補體活化相關基因在感染3 d后表達水平上調，提示補體系統(tǒng)參與了抗立克次體的免疫應答。在宿主抗胞內病原體感染過程中，Th1型免疫反應發(fā)揮了重要作用。Th1型細胞可通過釋放IFN-γ、IL-12等細胞因子而活化巨噬細胞及淋巴細胞，誘導細胞免疫反應，也可通過直接接觸誘導CTL分化[13]。根據(jù)基因功能注釋，il18bp基因與Th1型免疫反應相關，其轉錄水平升高提示黑龍江立克次體感染激活了Th1型免疫反應。batf基因編碼一種B細胞轉錄激活因子，控制免疫細胞特別是Th17細胞的分化。batf基因在感染后轉錄上調并持續(xù)處于3倍以上的升高水平，提示Th17亦參與了抗立克次體感染的細胞免疫應答。

對炎癥反應相關基因進行分析發(fā)現(xiàn)，感染后多種基因轉錄水平呈先升高后降低的趨勢，包括趨化因子CCL、CXCL及其相應受體基因和白細胞介素基因等。小鼠感染黑龍江立克次體3 h后，CCL、CXCL等趨化因子轉錄水平升高，提示炎癥反應啟動，多種效應細胞(如單核/巨噬細胞、中性粒細胞、CD8+T細胞等)被募集活化參與抗感染免疫。其中轉錄上調明顯的ccl2可趨化單核/巨噬細胞到炎癥部位，cxcl10可趨化T淋巴細胞及單核細胞，介導Th1型炎性反應。活化的巨噬細胞對胞內病原菌具有強大的殺傷破壞作用。一氧化氮合酶(NOS)2是NOS家族3種亞型中的第2類，為誘導型NOS(iNOS)。NOS2能與L-精氨酸及氧發(fā)生作用，產生NO及L-瓜氨酸，其中NO具有殺滅病原體的作用。其轉錄水平在感染3 d后升高99倍，感染6 d后下降至30倍，提示感染3 d后免疫活性細胞產生的NO較多，殺傷立克次體的活性較強。il27是轉錄上調最明顯的基因，其編碼的IL-27由激活的抗原提呈細胞分泌，具有促進或抑制IFN-γ分泌的雙重作用，能雙向調節(jié)Th1型免疫反應。IL-10是一種免疫抑制因子，可抑制Th1型反應。本研究中il10基因轉錄上調，可能是IL-10通過抑制宿主抗立克次體免疫應答，起到免疫調節(jié)、維持宿主免疫平衡的作用[14]。

綜上所述，C3H/HeN小鼠感染黑龍江立克次體后，在抗感染免疫的不同階段，脾臟中多種基因的轉錄水平發(fā)生變化，包括35個天然免疫相關基因、31個獲得性免疫相關基因及41個炎癥反應相關基因。在感染早期，參與IFN-γ信號通路的irg1、gbp10基因及促炎因子轉錄上調，炎癥反應啟動；細胞因子及細胞因子受體信號通路中ccl4基因轉錄上調，多種免疫效應細胞被募集活化。在獲得性免疫階段，參與細胞凋亡通路的gzmb基因轉錄上調，Th1及CTL細胞介導的細胞免疫在抗立克次體感染中發(fā)揮了重要作用。本研究初步揭示了小鼠在抗黑龍江立克次體感染中的免疫調控過程，為了解遠東斑點熱的致病過程及宿主免疫防御機制提供了依據(jù)。但本研究只是基于RNA轉錄組學分析，挑選出來的實際靶點如irg1、gbp10、gzmb、ccl2等關鍵宿主因子，仍需通過體外相互作用生化實驗、體內敲低/敲除/過表達細胞系或小鼠實驗進行驗證。