GbCDPK83基因在干旱脅迫下的功能鑒定

史光珍，高 鑫，朱新霞

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物也是最重要的纖維作物之一。干旱是制約棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大問題，它會使棉花葉片出現(xiàn)萎蔫，棉株生長和發(fā)育受阻，對棉花的產(chǎn)量、品質(zhì)影響非常大[1-2]。新疆是中國最大的商品棉生產(chǎn)基地，海島棉纖維品質(zhì)優(yōu)良、生育期較長，主要在無霜期較長的南疆種植，而南疆又干旱、少雨，挖掘海島棉的耐旱基因，提高海島棉的耐旱性是目前亟待解決的主要問題。

為了應(yīng)對干旱脅迫，植物需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控以盡量減少干旱對植物的危害。鈣依賴性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPKs)是一類重要的鈣信號感受響應(yīng)蛋白，當(dāng)植物處于逆境時(shí)，C端與EF-hands結(jié)構(gòu)結(jié)合，CDPKs的活性被激活，從而引發(fā)調(diào)控過程改變，使得植物細(xì)胞的生理生化發(fā)生變化，提高植物對不良環(huán)境的耐受性[3]。前期研究報(bào)道在擬南芥中，AtCPK10基因可通過參與 ABA 途徑，增強(qiáng)植株耐旱性[4]；過表達(dá)AtCPK8可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力[5]；在水稻中，過表達(dá)OsCDPK7可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力[6]。這些研究結(jié)果說明 CDPKs可能參與了植物對干旱脅迫的響應(yīng)。

病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是一種利用 TRV 病毒來構(gòu)建特異性載體，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)基因沉默的技術(shù)，VIGS技術(shù)在植物抗逆、抗病等相關(guān)基因功能鑒定中已被廣泛應(yīng)用[7]。

綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)，GbCDPK83基因在棉花植株受干旱脅迫時(shí)上調(diào)表達(dá)，為研究該基因?qū)γ藁购敌缘挠绊?，本研究采用基因沉默技術(shù)，在棉花幼苗中將GbCDPK83基因沉默，對沉默植株及對照植株作干旱脅迫處理，通過觀察測定沉默植株與對照植株表型差異及生理生化指標(biāo)變化，探究GbCDPK83基因的功能，為提高海島棉抗逆性奠定 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

海島棉H7124(GossypiumbarbadenseL. H7124)，大腸桿菌(Esherichiacoli) DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、pTRV1(輔助載體)、pTRV2均由綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的制備 采集海島棉幼苗葉片，加液氮充分研磨后，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作，得到海島棉cDNA。

1.2.2GbCDPK83的克隆 從CottonFGD(https://cottonfgd.org/)數(shù)據(jù)庫中調(diào)取GbCDPK83的序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄的海島棉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系共20 μL：1 μL cDNA模板、1 μL混合引物、10 μL 2×Mix、8 μL ddH2O補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性30 s，59 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；16 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收、純化，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3GbCDPK83的生物信息學(xué)分析 基于該基因的氨基酸序列，利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)分析蛋白的理化性質(zhì)；ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)分析蛋白的親/疏水性；TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析蛋白的信號肽序列；PRABI-GERLAND(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin)預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測蛋白的高級結(jié)構(gòu)；SMART MODE(http://smart.embl-heidelberg.de)分析蛋白的結(jié)構(gòu)域；PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位信息。

1.2.4 VIGS載體構(gòu)建 以pMD-19T-GbCDPK83為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物見表1，表1中的下劃線為酶切位點(diǎn)，得到VIGS片段，對pTRV2空載體用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切，得到線性化載體。將回收所得VIGS片段與pTRV2線性載體用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，成功構(gòu)建載體pTRV-GbCDPK83。

1.2.5 VIGS沉默及相對表達(dá)量檢測 選取出苗10 d的海島棉H7124，分別向子葉注射含有重組載體pTRV1/pTRV2-GhCLA1的農(nóng)桿菌菌液和含有GbCDPK83基因沉默載體pTRV1/pTRV2-GbCDPK83的農(nóng)桿菌菌液，以非轉(zhuǎn)基因植株和注射了僅含有空載體的農(nóng)桿菌菌液的棉花植株作為對照，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)24 h后于適宜條件下培養(yǎng)。當(dāng)pTRV-GhCLA1的侵染苗表現(xiàn)出白化后，分別采集沉默植株(pTRV-GbCDPK83)和對照植株第二片真葉液氮保存，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以UBQ7做內(nèi)參基因，所用引物見表1，利用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR染料對GbCDPK83基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所得數(shù)據(jù)用 2-ΔΔCt方法計(jì)算獲得相對表達(dá)量[8]。

表1 所用引物

1.2.6GbCDPK83基因的功能探究 將非轉(zhuǎn)基因棉株(CK)、空載對照棉株(pTRV-00)、試驗(yàn)組(pTRV-GbCDPK83)分為兩組，對其中一組進(jìn)行干旱脅迫處理，另一組以正常條件進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察表型變化，并取葉片進(jìn)行相對含水量、相對電導(dǎo)率、脯氨酸含量、丙二醛含量的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GbCDPK83基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄獲取的海島棉cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增GbCDPK83基因，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，克隆得到全長1 611 bp的GbCDPK83基因序列，測序后比對，與數(shù)據(jù)庫中的CDS序列相一致。

1,2. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； M. DL2000 DNA Marker

2.2 GbCDPK83蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 GbCDPK83蛋白理化性質(zhì)分析 GbCDPK83共編碼536個(gè)氨基酸，其中精氨酸和賴氨酸(帶正電荷)共計(jì)67個(gè)，天冬氨酸和谷氨酸(帶負(fù)電荷)共計(jì)76個(gè)；單個(gè)數(shù)目最多的賴氨酸殘基(Lys)共41個(gè)(7.6%)，數(shù)目最少的色氨酸殘基(Trp)僅5個(gè)(0.9 %)。分子式C2668H4205N741O810S25，相對分子質(zhì)量60 423.72 u，理論等電點(diǎn)(pI)為6.09。

2.2.2 GbCDPK83蛋白的親/疏水性分析 利用ProtScale分析GbCDPK83蛋白的親疏水性，匯總為圖2的曲線。其中131和132位的Lys和Glu評分最低(-3.144)，即親水性最高，而評分最高(2.744)的是279位的Leu，即疏水性最高。就整體而言，GbCDPK83蛋白表現(xiàn)為親水性。

圖2 GbCDPK83蛋白的親/疏水性分析

2.2.3 GbCDPK83蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析與信號肽預(yù)測 經(jīng)TMHMM Server v.2.0分析 GbCDPK83蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白。SignalP-5.0 Server分析GbCDPK83蛋白的信號肽預(yù)測評價(jià)為0.003，而無信號肽(其他)的評價(jià)為0.997，表明GbCDPK83蛋白并不具備信 號肽。

2.2.4 GbCDPK83蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析 使用PRABI-GERLAND預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)GbCDPK83蛋白二級結(jié)構(gòu)組成主要為α螺旋(224個(gè)氨基酸殘基，占比41.79%)，其次為無規(guī)卷曲(211個(gè)氨基酸殘基，占比39.37%)，β轉(zhuǎn)角(48個(gè)氨基酸殘基，占比8.96%)。使用SWISS-MODEL預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)GbCDPK83蛋白三級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象中包含大量的α螺旋，此外還有β轉(zhuǎn)角及一些無規(guī)卷曲，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符。

2.2.5 GbCDPK83蛋白的結(jié)構(gòu)域分析 結(jié)構(gòu)域預(yù)測此蛋白在89～347位具有一個(gè)Ser/Thr 蛋白激酶基序，在394～422、430～458、466～494、 501～529四個(gè)位置，有4個(gè)可結(jié)合Ca2+進(jìn)而激活其活性的EF-hands結(jié)構(gòu)(圖3)，說明GbCDPK83蛋白具有CDPKs特有的結(jié)構(gòu)。

圖3 GbCDPK83蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.2.6 GbCDPK83蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測 在線分析工具的預(yù)測結(jié)果：質(zhì)膜0.850，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 0.496，微體(過氧化物酶體)0.306，葉綠體內(nèi)膜 0.118，說明GbCDPK83蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的位點(diǎn)有可能在質(zhì)膜上。

2.3 GbCDPK83的基因沉默

2.3.1GbCDPK83基因的VIGS載體構(gòu)建 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖4-A，說明擴(kuò)增出大小為403 bp的GbCDPK83基因沉默片段。使用BamH I和XhoI對構(gòu)建的VIGS載體進(jìn)行雙酶切鑒定(圖4-B)， 發(fā)現(xiàn)VIGS片段與空載體pTRV-00成功連接，表明沉默載體構(gòu)建成功。

A. GbCDPK83沉默片段擴(kuò)增產(chǎn)物；1. 陰性對照；2. 沉默片段；M. DL2000 DNA Marker;B. 沉默載體雙酶切結(jié)果； 1. 雙酶切結(jié)果；2. 質(zhì)粒對照；M. Marker Ⅲ

2.3.2GbCDPK83基因的沉默及相對表達(dá)量測定 VIGS侵染后的結(jié)果如圖5所示，注射空載體和注射GbCDPK83沉默載體菌液的棉花葉片顏色正常，未出現(xiàn)白化現(xiàn)象。而注射GhCLA1沉默載體菌液的棉花植株，葉片表現(xiàn)出明顯白化，表明本試驗(yàn)所使用的沉默載體可用于棉花VIGS沉默研究。

pTRV-GhCLA1. CLA1基因沉默植株；pTRV-00.TRV空載體植株； pTRV- GbCDPK83. GbCDPK83基因沉默植株

相對于注射了空載體pTRV-00的棉株，注射GbCDPK83沉默載體菌液的棉花植株，表達(dá)量極顯著降低(圖6)，表明TRV體系成功抑制了GbCDPK83基因的表達(dá)。

2.4 GbCDPK83基因的功能探究

2.4.1 干旱脅迫處理后表型變化 自然干旱10 d 后， 注射pTRV-GhCLA1的植株失水萎蔫，注射空載體和pTRV-GbCDPK83的植株嚴(yán)重失水枯萎，注射 pTRV-GbCDPK83的葉片枯萎更嚴(yán)重(圖7-A)。離體葉片在20%PEG中，非轉(zhuǎn)基因植株的葉片萎蔫程度較輕，注射pTRV-GbCDPK83的沉默植株萎蔫嚴(yán)重(圖7-B)。

*P<0.05,**P<0.01

pTRV-GhCLA1. CLA1基因沉默植株；WT. 非轉(zhuǎn)基因植株； pTRV-00.TRV空載體植株；pTRV- GbCDPK83. GbCDPK83基因沉默植株;A.干旱脅迫10 d后的棉花；B.干旱脅迫后的離體葉片

2.4.2 生理指標(biāo)測定結(jié)果 在正常狀態(tài)下，空載體植株相對含水量最高，GbCDPK83基因沉默植株的相對含水量和非轉(zhuǎn)基因的植株相差不大。干旱脅迫后，相對含水量均降低，其中GbCDPK83基因沉默植株的相對含水量極顯著降低(圖8-A)。

在正常狀態(tài)下，空載體植株相對電導(dǎo)率最高，GbCDPK83基因沉默植株的相對電導(dǎo)率最低。干旱脅迫后，相對電導(dǎo)率均升高，其中GbCDPK83基因沉默植株的相對電導(dǎo)率極顯著上升(圖8-B)。

在正常狀態(tài)下，空載體植株脯氨酸含量最高，GbCDPK83基因沉默植株的脯氨酸含量介于空載體植株和非轉(zhuǎn)基因植株之間。干旱脅迫后，脯氨酸含量均增加，但非轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量增加的最多，空載體植株次之，GbCDPK83基因沉默植株增加的最少(圖8-C)。

在正常狀態(tài)下，空載體植株丙二醛含量最低，GbCDPK83基因沉默植株的丙二醛含量介于非轉(zhuǎn)基因植株和空載體植株之間。干旱脅迫后，MDA 含量均有升高，GbCDPK83基因沉默植株的MDA 含量極顯著上升，空載體植株次之，非轉(zhuǎn)基因植株上升的不明顯(圖8-D)。

圖8 正常與干旱脅迫狀態(tài)下生理指標(biāo)

3 討 論

GbCDPK83蛋白具有CDPK家族典型的結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測該蛋白主要由α-螺旋組成，前人研究報(bào)道CDPKs中EF-hand功能域是保守的，該功能域中的保守氨基酸殘基多數(shù)位于α-螺旋中，GbCDPK83蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)[9]。

VIGS技術(shù)能夠在短期內(nèi)穩(wěn)定的將目標(biāo)基因沉默，進(jìn)而通過表型、生理生化指標(biāo)對目標(biāo)基因進(jìn)行功能分析[10]。為了進(jìn)一步研究GbCDPK83的功能，本研究利用VIGS技術(shù)構(gòu)建沉默表達(dá)載體，經(jīng)分析沉默GbCDPK83基因前后基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)TRV體系成功抑制了GbCDPK83基因的表達(dá)。

干旱脅迫下植物的生長發(fā)育變緩，其原因就是植物體內(nèi)水分缺失，造成了滲調(diào)物質(zhì)增加、膜脂過氧化損傷[11]。丙二醛和電導(dǎo)率是反映植物細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)，干旱脅迫會增加丙二醛含量和電導(dǎo)率[12]。脯氨酸對維持植物細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的平衡起著重要作用，脯氨酸含量越高，抗旱能力越強(qiáng)[13]，干旱脅迫后，GbCDPK83基因沉默植株的相對含水量顯著降低，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著上升，脯氨酸含量升高但低于空載體及非轉(zhuǎn)基因植株，可能是GbCDPK83基因沉默植株中，GbCDPK83基因表達(dá)受到了抑制，GbCDPK83蛋白在細(xì)胞內(nèi)的水平降低，響應(yīng)干旱脅迫時(shí)，傳遞信號的能力受到影響，使得細(xì)胞無法及時(shí)適應(yīng)干旱脅迫帶來的不利影響，因此受到了比GbCDPK83基因正常表達(dá)植株更嚴(yán)重的細(xì)胞膜損傷，滲透調(diào)節(jié)平衡能力也受到影響。

4 結(jié) 論

基于VIGS技術(shù)，成功構(gòu)建GbCDPK83基因的沉默載體，獲得GbCDPK83基因沉默棉株。干旱脅迫后，GbCDPK83基因沉默棉株表現(xiàn)為相對含水量顯著降低，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著升高，脯氨酸含量升高但低于空載體及非轉(zhuǎn)基因植株，表明沉默棉株耐旱性減弱。