陜西某羊場(chǎng)莎能奶山羊球蟲(chóng)分離鑒定及感染情況

高嘉淇，王逸群，王玥婷，袁晨陽(yáng)，梁高星，李 媛，王 一，宋軍科

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

山羊球蟲(chóng)病是由寄生于山羊腸道的艾美耳科(Eimeiridae)艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲(chóng)引起的一種寄生性原蟲(chóng)病?？杉纳谏窖蚰c道的球蟲(chóng)種類(lèi)繁多，目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的山羊球蟲(chóng)主要有9種，分別是雅氏艾美耳球蟲(chóng)(E.ninakohlyakimovae)、阿氏艾美耳球蟲(chóng)(E.arloingi)、柯氏艾美耳球蟲(chóng)(E.christenseni)、艾氏艾美耳球蟲(chóng)(E.alijevi)、家山羊艾美耳球蟲(chóng)(E.hirci)、約氏艾美耳球蟲(chóng)(E.jolchijevi)、阿普艾美耳球蟲(chóng)(E.apsheronica)、山羊艾美耳球蟲(chóng)(E.caprina)和羊艾美耳球蟲(chóng)(E.caprovina)[1]。山羊球蟲(chóng)病是山羊最常見(jiàn)、危害最為嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病之一，呈世界性分布，各年齡段的山羊?qū)η蛳x(chóng)均有易感性。青年羊和成年羊感染后可出現(xiàn)下痢、消瘦、貧血、發(fā)育不良等臨床癥狀，使羊生長(zhǎng)緩慢及生產(chǎn)性能下降[2]。球蟲(chóng)感染羔羊后危害極大，除導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉外，還可使羔羊大批死亡，病死率可達(dá)80%以上，對(duì)羊的健康和養(yǎng)羊業(yè)造成很大威脅[3-4]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，球蟲(chóng)體積微小、形態(tài)相近，應(yīng)用常規(guī)方法很難快速準(zhǔn)確地進(jìn)行種類(lèi)鑒定，因此給山羊球蟲(chóng)病的有效防控帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)山羊球蟲(chóng)病已經(jīng)有了一些研究，但陜西地區(qū)山羊球蟲(chóng)病的調(diào)查研究鮮見(jiàn)報(bào)道。加之，奶山羊產(chǎn)業(yè)是中國(guó)畜牧業(yè)和乳品行業(yè)的重要組成部分，也是陜西省畜牧業(yè)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)，陜西省奶山羊存欄量、羊奶產(chǎn)量等均穩(wěn)居全國(guó)首位[5-6]。因此，本研究對(duì)陜西省某羊場(chǎng)莎能奶山羊的球蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查研究，進(jìn)一步對(duì)分離到的球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行分離和種類(lèi)鑒定，以期為該地區(qū)山羊球蟲(chóng)病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品

從陜西省某羊場(chǎng)采集莎能奶山羊糞便樣品共49份，其中，6～12月齡山羊14份，3～5月齡羔羊13份，2月齡羔羊22份(表1)。

表1 不同年齡段山羊糞便樣品采集情況

1.2 儀器與設(shè)備

60目銅篩，購(gòu)自浙江省上虞市大亨橋化驗(yàn)儀器廠(chǎng)；4 ℃冰箱、鐵絲圈、50 mL離心管、麥克馬斯特計(jì)數(shù)板、顯微成像系統(tǒng)，購(gòu)自尼康儀器(上海)有限公司；L-550臺(tái)式低速離心機(jī)，購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 主要試劑

NaCl、重鉻酸鉀、去離子水等。

1.4 樣品采集與保存

將采集到的新鮮糞便樣品分別裝入干凈塑料袋內(nèi)，標(biāo)記年齡信息、糞便狀態(tài)和山羊整體狀態(tài)， 4 ℃冰箱保存。

1.5 糞便檢查與OPG統(tǒng)計(jì)

根據(jù)龔振興等[7]的研究結(jié)果，采用飽和食鹽水漂浮法對(duì)糞便樣品進(jìn)行光學(xué)顯微鏡下檢查，并采用麥克馬斯特計(jì)數(shù)法[8]測(cè)定每克糞便樣品中的球蟲(chóng)卵囊數(shù)(OPG值)。

1.6 球蟲(chóng)卵囊的分離與培養(yǎng)

將不同年齡段山羊糞便以腹瀉與否為標(biāo)準(zhǔn)，將定量檢測(cè)后剩余的糞樣加入適量水研磨并充分混合后經(jīng)60目銅篩過(guò)濾，濾液3 500 r/min 離心5 min 2次，沉淀加入飽和食鹽水后混勻，1 700 r/min離心5 min，用吊環(huán)吊取最上層液面至清水中，重復(fù)2～3次至鏡檢后發(fā)現(xiàn)卵囊數(shù)較多即可。加入上清1.5倍體積的清水混合后，4 000 r/min離心8 min 2次，棄上清，沉淀即為收集的卵囊。取適量分離所得卵囊于20 mL含量為5%的重鉻酸鉀溶液中孵化(溫度為28.5 ℃)，待球蟲(chóng)卵囊孢子化率達(dá)80%后，存至4 ℃冰箱。

1.7 卵囊的純化與富集

經(jīng)培養(yǎng)孢子化的卵囊于5 000 r/min 離心8 min 2次，所得沉淀即富集的卵囊。

1.8 卵囊的形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察富集的孢子化卵囊，根據(jù)孢子化卵囊的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征(卵囊大小、卵形指數(shù)、極帽、卵膜孔、子孢子大小、折光體、斯氏體、內(nèi)殘?bào)w、外殘?bào)w、極粒等)，并結(jié)合文獻(xiàn)資料進(jìn)行球蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年齡段山羊球蟲(chóng)感染率

研究結(jié)果顯示(表2)，該羊場(chǎng)山羊各年齡段普遍存在球蟲(chóng)感染，總感染率為98.0%(48/49)，其中 3～5月齡山羊和6～12月齡山羊感染率最高，達(dá)100%(27/27)。

表2 山羊的球蟲(chóng)感染率

2.2 不同年齡段山羊糞便OPG值

由表3可知，該羊場(chǎng)3～5月齡羔羊球蟲(chóng)平均OPG最高，為2 442個(gè)/g，6～12月齡山羊球蟲(chóng)平均OPG最低，為369個(gè)/g。但2月齡羔羊中檢出最高OPG，為15 083個(gè)/g。說(shuō)明羔羊?qū)η蛳x(chóng)易感性更高，這與前人研究結(jié)果相一致[11-13]。

表3 不同年齡段山羊球蟲(chóng)感染的OPG統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 球蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定

2.3.1 山羊艾美耳球蟲(chóng)種類(lèi) 對(duì)不同年齡的山羊糞便分別用飽和食鹽水漂浮法分離純化卵囊，然后進(jìn)行孢子化培養(yǎng)60 h。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定(表4)共檢測(cè)出7種球蟲(chóng)，分別為柯氏艾美耳球蟲(chóng)(E.christenseni)、阿氏艾美耳球蟲(chóng)(E.arloingi)、雅氏艾美耳球蟲(chóng)(E.ninakohlyakimovae)、艾麗艾美耳球蟲(chóng)(E.alijeri)、小型艾美耳球蟲(chóng)(E.parva)、家山羊艾美耳球蟲(chóng)(E.hirci)、山羊艾美耳球蟲(chóng)(E.caprina)(圖1)。

表4 莎能奶山羊感染球蟲(chóng)的種類(lèi)及形態(tài)學(xué)特征

a. 極帽；b. 卵膜孔；c. 極粒； d. 孢子囊；e. 斯氏體；A. 柯氏艾美耳球蟲(chóng)；B. 阿氏艾美耳球蟲(chóng)；C. 雅氏艾美耳球蟲(chóng)；D. 艾麗艾美耳球蟲(chóng)；E. 小型艾美耳球蟲(chóng)；F. 家山羊艾美耳球蟲(chóng); G. 山羊艾美耳球蟲(chóng)

2.3.2 優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)隨機(jī)提取的277個(gè)孢子化球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種統(tǒng)計(jì)分析，其中，雅氏艾美耳球蟲(chóng)(E.ninakohlyakimovae)、阿氏艾美耳球蟲(chóng)(E.arloingi)和柯氏艾美耳球蟲(chóng)(E.christenseni)占比最高，依次為17.3%(48/277)，15.9%(44/277)和15.2%(42/277)，是該羊場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種。

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的山羊球蟲(chóng)主要有9種[1]，在臨床上常為混合感染。在9種球蟲(chóng)中，阿氏艾美耳球蟲(chóng)(E.arloingi)、柯氏艾美耳球蟲(chóng)(E.christenseni)、艾麗艾美耳球蟲(chóng)(E.alijeri)和雅氏艾美耳球蟲(chóng)(E.ninakohlyakimovae)已被公認(rèn)為是致病性最強(qiáng)的4種山羊球蟲(chóng)[14-15]。目前，雅氏艾美耳球蟲(chóng)(E.ninakohlyakimovae)和阿氏艾美耳球蟲(chóng)(E.arloingi)是許多國(guó)家/地區(qū)山羊球蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種，包括荷蘭、捷克、馬來(lái)西亞、波蘭、南非、斯里蘭卡、伊拉克、約旦、土耳其、伊朗、肯尼亞、津巴布韋和坦桑尼亞[14,16]。本試驗(yàn)通過(guò)飽和食鹽水漂浮法對(duì)球蟲(chóng)卵囊進(jìn)行分離[9,17]、形態(tài)學(xué)鑒定[10-11]，發(fā)現(xiàn)該羊場(chǎng)混合感染柯氏艾美耳球蟲(chóng)(E.christenseni)、阿氏艾美耳球蟲(chóng)(E.arloingi)、雅氏艾美耳球蟲(chóng)(E.ninakohlyakimovae)、艾麗艾美耳球蟲(chóng)(E.alijeri)、小型艾美耳球蟲(chóng)(E.parva)、家山羊艾美耳球蟲(chóng)(E.hirci)、山羊艾美耳球蟲(chóng)(E.caprina)。且該羊場(chǎng)雅氏艾美耳球蟲(chóng)(17.3%, 48/277)、阿氏艾美耳球蟲(chóng) (15.9%, 44/277)和柯氏艾美耳球蟲(chóng)(15.2%, 42/277)為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種。卵形指數(shù)分別為1.20、 1.50、1.47，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14-15,18-19]。

研究結(jié)果表明，該羊場(chǎng)各年齡段的山羊普遍存在球蟲(chóng)感染。其中3～5月齡山羊和6～12月齡山羊感染率最高，達(dá)100%(27/27)。2月齡山羊感染率為95.5%(21/22)。該山羊場(chǎng)球蟲(chóng)平均感染率達(dá)98%。比賀圣杰等[18]在楊凌的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(95.2%)高，可能與該羊場(chǎng)的防控力度較弱有關(guān)。也比常艷凱等[20]在西藏的調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果(81.2%)高，可能因?yàn)殛兾麝P(guān)中屬盆地平原型地形，溫度高于西藏高原山地，氣候更適于卵囊快速發(fā)育[21-22]。

本研究中3～5月齡羔羊球蟲(chóng)平均OPG最高，為2 442個(gè)/g，6～12月齡山羊球蟲(chóng)平均OPG最低，為369個(gè)/g。但2月羔羊中檢出最高的OPG，為15 083個(gè)/g。此次調(diào)查結(jié)果表明山羊月齡越小，球蟲(chóng)感染率相對(duì)越高，這與陶立等[23]、林琳等[24]的報(bào)道一致。

綜上所述，雖然該羊場(chǎng)球蟲(chóng)感染較為普遍，但臨床表現(xiàn)多為隱形感染，僅有少數(shù)羊只出現(xiàn)腹瀉癥狀，導(dǎo)致該場(chǎng)在養(yǎng)殖中常忽視球蟲(chóng)防控。本次對(duì)球蟲(chóng)種類(lèi)的分離與鑒定，闡明該羊場(chǎng)球蟲(chóng)種類(lèi)分布和優(yōu)勢(shì)種，也明確了流行于該場(chǎng)羊只中致病性較高的球蟲(chóng)種類(lèi)，從而有針對(duì)性地對(duì)病羊進(jìn)行診治。因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)羊群的飼養(yǎng)管理、改善飼養(yǎng)條件，采用抗球蟲(chóng)藥物對(duì)圈舍羊群進(jìn)行預(yù)防性驅(qū)蟲(chóng)，定期對(duì)圈舍進(jìn)行清潔消毒，保持圈舍干燥。保證飼草飼料、飲水的衛(wèi)生，避免污染。對(duì)于已發(fā)病的羊只應(yīng)及時(shí)隔離消毒，及時(shí)清理其排泄物、分泌物，防止交叉感染[21-22, 25-26]。