柑橘大實(shí)蠅非典型氣味受體基因的克隆、序列分析及組織表達(dá)模式

王兆祥，田曉麗，齊振華，桂連友，王福蓮，張國(guó)輝

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，昆蟲研究所，湖北荊州 434025；2.長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；3.青島郵局海關(guān)，山東青島 266000)

嗅覺(jué)是大多數(shù)動(dòng)物接收外界信息的一種重要感覺(jué)方式。它們利用嗅覺(jué)識(shí)別環(huán)境中的信息化合物，以此來(lái)調(diào)控它們的行為，如尋找食物源、定位配偶以及躲避天敵等。動(dòng)物嗅覺(jué)機(jī)制研究的重大突破得益于1991年Buck和Axel[1]首次發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物氣味受體基因(odorant receptor,OR)。哺乳動(dòng)物的氣味受體蛋白屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族，該家族的典型特征是具有7個(gè)跨膜區(qū)，氨基端位于膜外，羧基端位于膜內(nèi)。這類氣味受體蛋白著生于哺乳動(dòng)物鼻腔嗅覺(jué)上皮組織嗅覺(jué)神經(jīng)元樹突膜上。一旦與氣味分子結(jié)合，氣味受體蛋白就利用G蛋白/cAMP信號(hào)通路把這種化學(xué)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)沖動(dòng)信號(hào)進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物相應(yīng)的行為[2-4]。昆蟲氣味受體蛋白的發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)滯后于哺乳動(dòng)物，昆蟲中第1個(gè)氣味受體蛋白是1999年才在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)的[5-7]。昆蟲氣味受體蛋白著生于昆蟲觸角和下顎須表面嗅覺(jué)感器內(nèi)的嗅覺(jué)神經(jīng)樹突膜上[8-9]。雖然昆蟲氣味受體蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物非常相似，但兩者也具有明顯不同[10-11]。第一，在細(xì)胞膜上的方向不同：昆蟲氣味受體蛋白的氨基端位于胞內(nèi)，羧基端位于胞外，而哺乳動(dòng)物氣味受體蛋白的氨基端位于胞外，羧基端位于胞內(nèi)。第二，昆蟲氣味受體蛋白是以異源二聚體形式作為一個(gè)功能單位，其中包括1個(gè)在進(jìn)化上高度分化的氣味受體蛋白ORx(用于識(shí)別特異性氣味物質(zhì))和1個(gè)進(jìn)化上高度保守的氣味受體蛋白(odorant receptor co-receptor,Orco)，并且Orco只存在于昆蟲中[12-13]。Orco本身并不直接與氣味配體結(jié)合，也不具有氣味識(shí)別的功能，但它可以與ORx構(gòu)成陽(yáng)離子通道，并能引導(dǎo)氣味分子和ORx結(jié)合，促使信號(hào)傳導(dǎo)形成[10,12]。研究表明，每種昆蟲只有一種Orco,在不同昆蟲種間高度保守，尤其是在氨基酸序列的羧基端[14-19]。近年來(lái)，大量的相關(guān)研究表明，對(duì)Orco的表達(dá)進(jìn)行干擾將會(huì)導(dǎo)致昆蟲嗅覺(jué)功能顯著受損[20-24]。因此，對(duì)Orco進(jìn)行有效干擾或破壞，將會(huì)嚴(yán)重影響昆蟲對(duì)氣味分子的感知，進(jìn)而干擾到昆蟲的取食、交配和產(chǎn)卵等重要的生命活動(dòng)，這暗示Orco可以作為害蟲防治的一個(gè)潛在靶標(biāo)[17]。

柑橘大實(shí)蠅(Bactroceraminax)屬雙翅目，實(shí)蠅科，果實(shí)蠅屬，大實(shí)蠅亞屬[25]，其幼蟲俗稱“柑蛆”，是一種危害柑橘類果實(shí)的主要害蟲[26]。該蟲在中國(guó)、尼泊爾、不丹和印度的柑橘生產(chǎn)區(qū)廣泛分布[25,27-28]，主要以幼蟲在果實(shí)內(nèi)取食進(jìn)行為害，對(duì)柑橘果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)造成重大影響[29]。由于柑橘大實(shí)蠅幼蟲鉆蛀危害，不易防治，因此人們將防控重點(diǎn)放在柑橘大實(shí)蠅成蟲的防控上。眾所周知，利用嗅覺(jué)來(lái)誘捕害蟲是一個(gè)高效、環(huán)保的防治策略。因此，研究柑橘大實(shí)蠅的關(guān)鍵嗅覺(jué)基因不僅可以加深對(duì)柑橘大實(shí)蠅嗅覺(jué)的認(rèn)知，同時(shí)也為研制高效引誘劑或驅(qū)避劑提供重要的理論依據(jù)。

本研究基于長(zhǎng)江大學(xué)昆蟲生理生化課題組已獲得的柑橘大實(shí)蠅成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR技術(shù)克隆柑橘大實(shí)蠅Orco基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在雌雄成蟲不同組織的表達(dá)特征，以期為柑橘大實(shí)蠅后續(xù)的嗅覺(jué)分子機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

昆蟲樣本：柑橘大實(shí)蠅取自長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲化學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)飼養(yǎng)種群[30]。分別收取1～3日齡雌雄成蟲的觸角、頭(不含觸角)、胸、腹、足、翅等組織，將收取的組織樣本存放于 -80 ℃冰箱，備用。

試劑及儀器：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0)、DL2000 DNA Marker、TB GreenTMPremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；pGEM-T easy vector，Promega；F-DH5α感受態(tài)細(xì)胞，唯地生物。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，T100TMPCR儀，Bio-Rad CFX connect Real-Time System,美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取 柑橘大實(shí)蠅各組織總RNA使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提??；第一鏈cDNA用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成。-20 ℃保存，備用。

1.2.2 柑橘大實(shí)蠅Orco基因的克隆鑒定 從柑橘大實(shí)蠅成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得Orco基因序列，通過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對(duì)鑒定，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)驗(yàn)證引物(表1，酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)示)克隆柑橘大實(shí)蠅Orco基因。以觸角組織的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系( 25 μL)：cDNA模板 2 μL、PremixTaq(LATaqVersion 2.0)12.5 μL、上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 100 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物用10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段連接到pGEM-T easy vector,再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。菌液PCR檢測(cè)后，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0提取檢測(cè)正確的質(zhì)粒DNA送樣測(cè)序。序列測(cè)定及引物合成均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2.3 柑橘大實(shí)蠅Orco基因的生物信息學(xué)分析 柑橘大實(shí)蠅Orco核苷酸序列利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找開放閱讀框，通過(guò)DNAMAN 7.0軟件推導(dǎo)氨基酸序列；利用Expasy的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；信號(hào)肽采用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)運(yùn)用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)其跨膜域進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用NCBI獲取已知昆蟲Orco氨基酸序列，其氨基酸序列的多重比對(duì)由DNAMAN 7.0軟件完成；選取鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、半翅目、膜翅目和直翅目共45種昆蟲Orco氨基酸序列，運(yùn)用MEGA 5.1軟件中鄰接法(NJ樹)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置Bootstrap為1 000，并使用iTOL(https://itol.embl.de/)編輯進(jìn)化樹。

1.2.4 柑橘大實(shí)蠅Orco基因的組織表達(dá)分析 利用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR中使用的特異性引物(表1)，內(nèi)參基因選用GAPDH。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)和Bio-Rad CFX connect Real-Time System檢測(cè)Orco的組織表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為25 μL：cDNA 模板 2 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、ddH2O 8.5 μL、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)。設(shè)置2次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。用溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2-ΔΔCt法[31]對(duì)柑橘大實(shí)蠅Orco基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 引物信息

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。不同組織間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s檢驗(yàn)分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘大實(shí)蠅Orco基因克隆與序列分析

柑橘大實(shí)蠅Orco開放閱讀框全長(zhǎng)1 431 bp，編碼476個(gè)氨基酸(圖1)，等電點(diǎn)為8.69，分子質(zhì)量53.41 ku,不穩(wěn)定指數(shù)為29.00，親水性總平均值(GRAVY)為0.296，是穩(wěn)定的疏水性蛋白，帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為31，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為37。序列分析表明該基因編碼的蛋白中無(wú)信號(hào)肽；跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，推導(dǎo)出的柑橘大實(shí)蠅Orco氨基酸序列含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(7-TM)，分別為 TM-1= 40～62 aa、TM-2= 72～90 aa、TM-3= 131～153 aa、TM-4=185～207 aa、TM-5= 337～359 aa、TM-6= 374～396 aa、TM-7= 450～472 aa，并且氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外(圖1，圖2)。

終止密碼子用星號(hào)顯示；下劃線標(biāo)出跨膜結(jié)構(gòu)域1-7(TM1-7)

跨膜結(jié)構(gòu)域是紅色的，里面是藍(lán)色，外面是紫色

2.2 柑橘大實(shí)蠅Orco的系統(tǒng)進(jìn)化分析

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖3)表明，柑橘大實(shí)蠅Orco氨基酸序列與鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、半翅目、膜翅目和直翅目昆蟲氨基酸序列有較高的相似性(68.19%、86.42%、65.15%、56.43%、63.84%和59.92%)，尤其是和雙翅目昆蟲的氨基酸序列一致性最高，而且在羧基端高度保守?；诓煌坷ハxOrco的氨基酸同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，發(fā)現(xiàn)同一目昆蟲的Orco均聚為一支，符合進(jìn)化關(guān)系。柑橘大實(shí)蠅Orco位于雙翅目分支上，與桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis的BdorOrco和地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata的CcapOrco聚在一起，可知柑橘大實(shí)蠅與同為果實(shí)蠅屬的桔小實(shí)蠅遺傳距離較近，其次是地中海實(shí)蠅，與半翅目昆蟲的遺傳距離最遠(yuǎn)。

BminOrco.柑橘大實(shí)蠅Orco；TcasOrco.赤擬谷盜Orco(XP_008194693.1，鞘翅目)；DmelOrco.黑腹果蠅Orco(NP_001097687.1，雙翅目)；McinOrco.腰帶長(zhǎng)體繭蜂Orco(AGI62937.2，膜翅目)；HarmOrco.棉鈴蟲Orco(ADQ13177.1，鱗翅目)；LmigOrco.東亞飛蝗Orco(ALD51504.1，直翅目)；LhesOrco.西部牧草盲蝽Orco(AFX73447.1，半翅目)。序列一致性.黑色=100%，綠色≥75%，紫色≥50%?？缒そY(jié)構(gòu)域1～7 (TM 1～7)用線表示

紫色.鞘翅目；黃色.雙翅目；黑色.鱗翅目；綠色.半翅目；粉色.膜翅目；藍(lán)色.直翅目；ApisOrco.豌豆蚜(XP_001951646.2)；YsigOrco.錘脅蹺蝽(AVO63533.1)；ClecOrco.溫帶臭蟲(NP_001303637.1)；LhesOrco.西部牧草盲蝽(AFX73447.1)；AlucOrco.綠盲蝽(AHC72290.1)；OasiOrco.亞洲小車蝗(QAB43939.1)；LmigOrco.東亞飛蝗(ALD51504.1)；SgreOrco.沙漠蝗(AEX28371.1)；NvitOrco.麗蠅蛹集金小蜂(NP_001164465.1)；McinOrco.腰帶長(zhǎng)體繭蜂(AGI62937.2)；MmedOrco.中紅側(cè)溝繭蜂(ABM05966.1)；CcinOrco.北美麥莖蜂(NP_001310774.1)；AmelOrco.西方蜜蜂(NP_001128415.1)；MsexOrco.煙草天蛾(XP_030036707.1)；BmorOrco.家蠶(NP_001037060.1)；LbotOrco.葡萄花翅小卷蛾(AXF48755.1)；PoctOrco.綠頭卷葉蛾(AJF23826.1)；EposOrco.蘋淡褐卷蛾(ACJ12928.2)；AsegOrco.黃地老虎(AGS41440.1)；SlitOrco.?；页嵋苟?ABQ82137.1)；HvirOrco.煙芽夜蛾(PCG73648.1)；HarmOrco.棉鈴蟲(ADQ13177.1)；HzeaOrco.美洲棉鈴蟲(AAX14773.1)；PstrOrco.黃曲條跳甲(ACD40044.1)；AcorOrco.銅綠麗金龜(AKC58535.1)；HoblOrco.華北大黑鰓金龜(AEE69033.1)；HparOrco.暗黑鰓金龜(AEG88961.1)；OcomOrco.廣聚螢葉甲(QEE83332.1)；AglaOrco.光肩星天牛(XP_018568191.1)；CbowOrco.大猿葉蟲(ALR72547.1)；AquaOrco.榆紫葉甲(AJF94638.2)；DponOrco.中歐山松大小蠹(XP_019768125.1)；TcasOrco.赤擬谷盜(XP_008194693.1)；TmolOrco.黃粉蟲(AJO62219.1)；AgamOcro.岡比亞按蚊(XP_312379.3)；AaegOrco.埃及伊蚊(NP_001345400.1)；CquiOrco.致倦庫(kù)蚊(ABB29301.1)；CcapOrco.地中海實(shí)蠅(NP_001266301.1)；BdorOrco：桔小實(shí)蠅 (ACC86853.1)；MdomOrco.家蠅(AFH96944.1)；DbusOrco.醋果蠅(XP_017848171.1)；DpseOrco.擬暗果蠅(XP_001359364.3)；DsuzOrco.斑翅果蠅(SAL89172.1)；DmelOrco.黑腹果蠅(NP_001097687.1)；BminOrco.柑橘大實(shí)蠅

2.3 柑橘大實(shí)蠅Orco的組織表達(dá)模式

柑橘大實(shí)蠅Orco的組織表達(dá)譜(圖5)顯示，柑橘大實(shí)蠅Orco基因在成蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織，并且在雌成蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于雄成蟲；在頭部(不含觸角)、胸、腹、足和翅中微量表達(dá)。

不同字母表示不同組織間差異顯著(P<0.05，Duncan’s test),小寫字母表示雌成蟲，大寫字母表示雄成蟲

3 討 論

本研究鑒定分析柑橘大實(shí)蠅非典型性氣味受體基因BminOrco。昆蟲Orco氨基酸序列羧基端的4個(gè)保守基序(conserved motifs)RSAIKYWVERHKHVVR, IFGNRL, WYDGSEEAK 和 FASVLGATVTYFMVLVQLK被認(rèn)為是昆蟲Orco家族的典型特征[22,32]。柑橘大實(shí)蠅BminOrco序列的羧基端也發(fā)現(xiàn)了這些保守基序(RSAIKYWVERHKHVVR (residues 325-340), IFGNRL (residues 400～405), WYDGSEEAK (residues 421～429)and FASVLGAVVTYFMVLVQLK (residues 458～476)，但BminOrco序列第4個(gè)基序的第8位氨基酸突變?yōu)槔i氨酸(V)。前人的研究表明，昆蟲氣味受體蛋白的氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外[10,33]。BminOrco跨膜結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，BminOrco的氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外(圖2)。這一結(jié)果同已被試驗(yàn)證實(shí)的果蠅D.melanogaster和榕小蜂ApocryptabakeriOrco 的膜拓?fù)鋵W(xué)(membrane topology)是一致的[11,34]。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明昆蟲氣味受體蛋白不同于哺乳動(dòng)物氣味受體蛋白。

系統(tǒng)樹分析顯示，6個(gè)目昆蟲的Orco被分成6個(gè)不同的組(圖4)，來(lái)自相同目的昆蟲總是聚在一起，說(shuō)明昆蟲Orco基因可能來(lái)自1個(gè)共同祖先，隨后由于不同的選擇壓力產(chǎn)生了相應(yīng)分化。然而，Orco在不同目昆蟲間好像又可以實(shí)現(xiàn)功能同源，因?yàn)閬?lái)自谷實(shí)夜蛾Helicoverpazea、地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata和岡比亞按蚊Anophelesgambiae的Orco在Orco(Or83b)缺陷的果蠅突變體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)后，該果蠅可以恢復(fù)對(duì)乙酸乙酯等氣味的嗅覺(jué)反應(yīng)[35]。昆蟲Orco要實(shí)現(xiàn)在不同昆蟲中的功能同源性，就必須保證其氨基酸序列的關(guān)鍵氨基酸或者結(jié)構(gòu)域在不同昆蟲種類中保持高度保守。序列多重比較的結(jié)果顯示，昆蟲Orco序列在羧基端高度保守，這暗示這段高度保守區(qū)域可能是Orco在不同昆蟲中行使相同功能的保證。其中位于第6跨膜區(qū)和第7跨膜區(qū)之間的環(huán)被認(rèn)為是Orco與ORx互作過(guò)程中不可或缺的區(qū)域[10]。位于第7跨膜區(qū)的酪氨酸(Y)(在家蠶BombyxmoriOrco位于464位Y464，在果蠅D.melanogasterOrco位于第478位Y478)被認(rèn)為在ORx/Orco 復(fù)合體形成陽(yáng)離子通道的過(guò)程中起了重要作用[36]。在柑橘大實(shí)蠅Orco中它位于第468位(Y468)。

組織表達(dá)模式的結(jié)果顯示，BminOrco主要在柑橘大實(shí)蠅雌雄成蟲觸角中高度表達(dá)，這與許多昆蟲Orco在組織中的表達(dá)分布情況相符合，推測(cè)是因?yàn)橛|角作為昆蟲的主要嗅覺(jué)器官，其上分布著大量嗅覺(jué)感受器，在接收外界信息的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[14-19,37]。柑橘大實(shí)蠅BminOrco在頭(不含觸角)、胸、腹、足、翅等組織中僅微量表達(dá)，這種現(xiàn)象在其他昆蟲中也有類似情況[15-19]。另外，昆蟲Orco的表達(dá)還會(huì)受昆蟲性別和發(fā)育時(shí)期的影響，如張帥等[14]對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂Orco在成蟲羽化不同時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，雌雄成蟲觸角之間的表達(dá)量在羽化的不同時(shí)期差異比較大，而董鈞鋒等[16]對(duì)棉鈴蟲齒唇姬蜂Orco的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在雄蜂觸角中的表達(dá)量是在雌蜂觸角中表達(dá)量的8.0倍。本研究發(fā)現(xiàn)，BminOrco在雌成蟲觸角中的表達(dá)量高于雄成蟲觸角中的表達(dá)量，且二者之間差異顯著。這是否意味著柑橘大實(shí)蠅雌成蟲具有更多的嗅覺(jué)行為表現(xiàn)，需要進(jìn)一步研究。

本研究從柑橘大實(shí)蠅成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定、克隆得到BminOrco基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR明確該基因的組織表達(dá)譜，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究柑橘大實(shí)蠅Orco的結(jié)構(gòu)和功能奠定一定的基礎(chǔ)。