茶尺蠖無機(jī)焦磷酸酶EoPPase672的表達(dá)與功能研究

尹 恒, 傅子卓, 楊曉霞, 袁東雪, 毛新芳, 劉忠淵, *

(1.四川輕化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 四川自貢 643000; 2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 烏魯木齊 830046)

無機(jī)焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase, PPase)最先在酵母中純化得到(Kunitz, 1952)，可以將多種代謝物中的焦磷酸基團(tuán)水解成磷酸基團(tuán)，在機(jī)體的正常物質(zhì)代謝和能量傳遞中起到重要作用(Harold, 1966; Sivulaetal., 1999; Nelson and Cox, 2000; Poole and Reeve, 2005)。無機(jī)焦磷酸酶具有較高催化效率，可使焦磷酸鹽(pyrophosphate, PPi)的水解速率提高1010-11倍，可以在短時(shí)間內(nèi)降低PPi基團(tuán)的積累，保證大分子持續(xù)合成，促進(jìn)機(jī)體發(fā)育(Oksanenetal., 2007; 吳群峰, 2014)。無機(jī)焦磷酸酶可根據(jù)蛋白溶解性分為膜結(jié)合無機(jī)焦磷酸酶和可溶性無機(jī)焦磷酸酶。膜結(jié)合無機(jī)焦磷酸酶主要存在于植物、細(xì)菌以及寄生性生物中，可作為質(zhì)子泵和Na+泵，在生物能的保存和傳遞中發(fā)揮重要功能(李小園等, 2004)。對水稻、細(xì)菌的無機(jī)焦磷酸酶研究表明，無機(jī)焦磷酸酶在反應(yīng)過程中可以釋放能量，推動(dòng)熱力學(xué)平衡向生物合成方向進(jìn)行，對合成反應(yīng)具有促進(jìn)作用，在ATP缺乏的情況下可應(yīng)對外界脅迫(黃園波等, 2013; 張亞芳等, 2013)?？扇苄越沽姿崦钢饕嬖谟诎|(zhì)內(nèi)，廣泛分布于動(dòng)物、植物以及真菌體內(nèi)，具有調(diào)節(jié)焦磷酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán)比例，維持正常生命活動(dòng)的作用。朱家紅等(2013)在橡膠中分離得到3個(gè)可溶性無機(jī)焦磷酸酶蛋白，證明其可以抑制PPi積累，促進(jìn)橡膠的生物合成，提高橡膠的產(chǎn)量(Prévtetal.,1987)。對黑腹果蠅Drosophilamelanogaster焦磷酸酶研究發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)染色體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄(Gdulaetal., 1998)；對線蟲和蛔蟲體內(nèi)焦磷酸酶深入研究證明，其與幼蟲發(fā)育息息相關(guān)(Islametal., 2003; Koetal., 2007)。

茶尺蠖Ectropisobliqua是一種鱗翅目(Lepidoptera)尺蠖蛾科(Geometridae)的昆蟲，俗稱拱背蟲、造橋蟲等，是茶園中發(fā)生普遍、為害嚴(yán)重的害蟲之一(張漢鵠, 2001)。其具有暴食性，早期幼蟲咬食嫩葉、嫩梢，后期取食量增加常將葉片咬食形成缺刻，大面積發(fā)生時(shí)可以將葉片全部吃光，茶園如同火燒一般，無茶可采，導(dǎo)致樹勢衰弱，對茶葉的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重大影響，常年造成茶葉產(chǎn)量損失約15%(趙磊等, 2014)。目前對于茶尺蠖體內(nèi)相關(guān)酶的報(bào)道較少，僅有茶尺蠖脂肪酶合成基因EoL2的克隆(杜琴等, 2015)與利用短穩(wěn)桿菌Empedobacterbrevis防治茶尺蠖后茶尺蠖中腸的血淋巴內(nèi)解毒酶(AchE, CarE和GSTs)的應(yīng)激情況(李良德等, 2020)的研究，更多的則是對于茶尺蠖的防治開展的一些研究(李喜旺等, 2017; 張帥琪等, 2020)。

此外，相關(guān)研究主要集中在植物和細(xì)菌中(劉海英等, 2008)，昆蟲無機(jī)焦磷酸酶報(bào)道較少，從NCBI中可以檢索到很多鱗翅目昆蟲無機(jī)焦磷酸酶基因，但是對其進(jìn)行深入研究的鮮有報(bào)道。另外，已有報(bào)道表明焦磷酸酶可作為PCR增強(qiáng)劑(王磊, 2014)。PCR增強(qiáng)劑的發(fā)展源于PCR在擴(kuò)增過程中會出現(xiàn)擴(kuò)增效率低、擴(kuò)增量少等問題。PCR反應(yīng)一般設(shè)置30～35個(gè)循環(huán)，循環(huán)次數(shù)過多會造成大量副產(chǎn)物如PPi的積累，產(chǎn)物積累速度減慢，非特異性條帶的擴(kuò)增概率增加，而PCR增強(qiáng)劑的使用可以解決這些問題。無機(jī)焦磷酸酶具有水解PPi的特性，因此研究無機(jī)焦磷酸酶對PCR的增強(qiáng)效果具有重要意義。本研究通過茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中獲得無機(jī)焦磷酸酶EoPPase672的基因序列，進(jìn)行體外表達(dá)和功能驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究無機(jī)焦磷酸酶在茶尺蠖解毒過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

研究所用茶尺蠖卵來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)人工飼養(yǎng)和繁殖，飼養(yǎng)溫度為22±0.5℃，相對濕度為75%±5%，光周期為14L∶10D，幼蟲飼喂新鮮的茶葉枝。

1.2 材料與試劑

大腸桿菌Escherichiacoli菌株DH5α和BL21(DE3)、DNA Marker、Taq酶、pUCm-T載體和膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Transzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；ProteinFind?Anti-His Mouse Monoclonal Antibody和 ProteinFind?Goat Anti-Mouse IgG(H+L), HRP Conjugate購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET32a質(zhì)粒載體為實(shí)驗(yàn)室保存；溴氰菊酯(50 mL/瓶)購自浙江威爾達(dá)化工有限公司；其他未標(biāo)明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 生物學(xué)信息分析

通過茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Yinetal., 2021)獲得EoPPase672基因cDNA序列，利用在線預(yù)測軟件對EoPPase672理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。 通過在線程序ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf)預(yù)測基因序列的開放閱讀框；使用在線軟件ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白分子量和等電點(diǎn)；使用ProtScale (http:∥web.expasy.org/protscale/)預(yù)測蛋白親疏水性；使用在線軟件SignalIP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP-4.1/)分析蛋白的信號肽位點(diǎn)。利用InterPro(http:∥www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)在線分析軟件預(yù)測蛋白質(zhì)中包含的結(jié)構(gòu)域；利用PredictProtein(https:∥www.predictprotein.org/home)在線預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載昆蟲無機(jī)焦磷酸酶的氨基酸序列，利用MEGA 5軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建茶尺蠖EoPPase672和其他物種PPase的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 重組蛋白EoPPase672的表達(dá)和純化

將實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pET-32a-EoPPase672轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆菌落37℃ 220 r/min過夜培養(yǎng)，按照1∶100(v/v)轉(zhuǎn)接入10 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)4 h(OD600=0.6～0.8)后，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.5 μmol/L)，37℃ 220 r/min誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。12 000 r/min離心1 min收集菌體。12%的SDS-PAGE檢測。

將陽性單克隆菌液接入1 L新鮮LB培養(yǎng)基(含Amp+)進(jìn)行大量誘導(dǎo)，離心收集菌體；用Binding Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Imidazole, pH 8.0)重懸菌體，超聲破碎后離心后收集上清；將上清液加入鎳柱中，旋轉(zhuǎn)搖床低溫結(jié)合2 h。收集流穿液，用含不同濃度咪唑 (20, 25, 50和200 mmol/L)的洗脫溶液洗脫柱子，收集洗脫液，12%的SDS-PAGE檢測。

在低溫條件下，將純化后蛋白洗脫液裝入透析袋，在透析液(20 mmol/L Tris-HCl)中4℃透析48 h(12～16 h換1次透析液)。用10 kD的超濾管濃縮蛋白，12% SDS-PAGE檢測蛋白純度，Bradford法定量蛋白濃度。

1.5 Western bolt鑒定重組蛋白EoPPase672

將1.4節(jié)純化的重組蛋白EoPPase672樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，將分離膠部分進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(冰浴條件下，20 V恒壓轉(zhuǎn)移1 h)，用含5%脫脂奶粉的TBST，37℃封閉NC膜4 h。用含3%脫脂奶粉的TBST按1∶5 000(v/v)稀釋一抗(Mouse Anti His-Tag MonoClonal antibody)，37℃孵育2 h，洗膜5次；1∶3 000 (v/v)稀釋二抗(Horseradish Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG)，37℃孵育1.5 h，洗膜5次；DAB染色液避光染色5 min后觀察顯色情況。

1.6 溴氰菊酯刺激后茶尺蠖EoPPase672的表達(dá)水平檢測

通過毒力實(shí)驗(yàn)測定，測得溴氰菊酯對茶尺蠖的亞致死濃度(LC10=2.08 mg/L)，使用(LC10)溴氰菊酯浸泡茶葉10 s后飼喂茶尺蠖2-4齡幼蟲，分別在0(CK), 12, 24和48 h后取試蟲，一個(gè)處理?xiàng)l件處理6頭同齡昆蟲，液氮冷凍保存，使用Transzol法提取幼蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物序列，以18S rRNA(正向引物: 5′-GAGAAACGGCTACCACATCCA-3′; 反向引物: 5′-GCAAATGCTTTCGCTGATGTT-3′)作為內(nèi)參基因，基于茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的EoPPase672基因cDNA序列的保守性設(shè)計(jì)相應(yīng)引物(正向引物: 5′-CCACACAGTTTTCCGCTACA-3′; 反向引物: 5′-TATGCTCACCAAGCAGCATC-3′)，qRT-PCR檢測溴氰菊酯刺激后不同時(shí)間點(diǎn)EoPPase672的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green Mix 12.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL, cDNA模板1.0 μL, RNase-Free Water 6.5 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后添加溶解曲線。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)來自2頭個(gè)體，3個(gè)技術(shù)性重復(fù)。

1.7 茶尺蠖EoPPase672酶活力測定

配制Na2HPO4(0.1 mol/L)溶液，取用不同量(0, 150, 250, 350, 450, 550, 600, 750和850 μL)加H2O定容至25 mL混勻，每份取240 μL并加入2 mL AAM[體積比為H2O∶正鉬酸銨(20 mmol/L)∶硫酸(2 mmol/L)∶丙酮=0.12∶0.5∶1.25∶2]靜置顯色3 min后于420 nm下比色測定，制作磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)組依次加入20 μL焦磷酸鈉(0.017 mol/L), 500 μL P Buffer[0.06 g Tris-HCl， 0.003g MgSO4(1 mmol/L)定容于100 mL]，50 μL H2O，1.4節(jié)原核表達(dá)純化后的茶尺蠖EoPPase672酶液(0.28 mg/mL) 20 μL，對照組用H2O替代，65℃水浴30 min，立即加入100 μL檸檬酸(0.1 mmol/L)溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫取240 μL加入2 mL AAM，靜置顯色3 min后于420 nm下比色測定磷酸根濃度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出溶液中無機(jī)磷酸鹽(Pi)的濃度，進(jìn)一步測定EoPPase672酶活力。將1.4節(jié)原核表達(dá)純化后的茶尺蠖EoPPase672酶液稀釋200倍后，按上述酶活力測定的方法測定不同pH(4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0和10.5)下的酶活力[1 個(gè)酶活力單位(U)為1 μmol EoPPase672在65℃時(shí)，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需的酶量]，制作酶活力與pH相關(guān)曲線，測定酶反應(yīng)最適pH。將1.4節(jié)原核表達(dá)純化后的茶尺蠖EoPPase672酶液稀釋200倍后，按上述酶活力測定的方法測定不同溫度下(25, 35, 45, 55, 65, 75, 85和95℃)酶活力，制作酶活力與溫度相關(guān)曲線，測定酶反應(yīng)最適溫度。用不同金屬離子(Ca2+, Cu2+, Mn2+和Zn2+)替換P Buffer中的Mg2+，檢測添加不同金屬離子與Mg2+共同作為輔因子時(shí)重組蛋白EoPPase672的活力，驗(yàn)證不同金屬離子對酶活力的影響。

1.8 重組蛋白EoPPase672在PCR反應(yīng)中對PPi的去除效果檢測

為了研究PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的焦磷酸基團(tuán)對PCR擴(kuò)增的抑制效果，稱取0.003 g焦磷酸鈉配制4 mmol/L焦磷酸鈉溶液，依次稀釋為0, 0.25, 0.5, 1, 2和4 mmol/L后加入PCR反應(yīng)中，基于EoPPase672序列設(shè)計(jì)正反向引物(5′-GCATTATCG CCGCGCGTGTT-3′; 5′-GAGATTGGAAGCGAGGTAG-3′)，以pET-32a-EoPPase672質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL)： Taq 9 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL， DNA模板1.0 μL， ddH2O 8.0 μL, PPi 1.0 μL。反應(yīng)程序： 94℃ 4 min; 94℃ 50 s, 57℃ 40 s, 72℃ 40 s, 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

以只添加不同濃度的PPi(0, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6和1.8 mmol/L)為對照組，實(shí)驗(yàn)組中添加與對照組中相同濃度的PPi和1 μL重組蛋白EoPPase672(1.0 mg/mL)，檢測不同濃度的PPi對PCR擴(kuò)增效率的影響以及重組蛋白EoPPase672對PPi抑制效果的影響?；贓oPPase672序列設(shè)計(jì)正反向引物(5′-GCATTATCGCCGCGCGTGTT-3′; 5′-GAGATTGGAAGCGAGGTAG-3′)，以pET-32a-EoPPase672質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL)： Taq 9 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, pET-32a-EoPPase672質(zhì)粒DNA模板1.0 μL, ddH2O 8.0 μL, PPi 1.0 μL。反應(yīng)程序： 94℃ 4 min; 94℃ 50 s, 57℃ 40 s, 72℃ 40 s, 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

1.9 重組蛋白EoPPase672對PCR擴(kuò)增效率的影響檢測

在實(shí)驗(yàn)組中依次加入不同劑量的Taq酶(10, 15, 20, 25和30 U)和重組蛋白EoPPase672(1.0 mg/mL) 1 μL，以只含有不同濃度Taq酶(10, 15, 20, 25和30 U)的PCR作為對照組，進(jìn)行PCR，引物序列同1.8節(jié)，分析重組蛋白EoPPase672對PCR擴(kuò)增效率的影響。PCR反應(yīng)體系(20 μL): Taq 9 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, DNA模板1.0 μL, ddH2O 7.0 μL, PPi 1.0 μL，重組蛋白EoPPase672(1.0 mg/mL) 1.0 μL。反應(yīng)程序: 94℃ 4 min; 94℃ 50 s, 57℃ 40 s,72℃ 40 s 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠檢測PCR結(jié)果。

1.10 數(shù)據(jù)分析

基因相對表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法，利用IBM SPSS Statistics 2分析基因相對表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析和LSD多重比較分析差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 茶尺蠖EoPPase672序列分析

從茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到EoPPase672 cDNA(GenBank登錄號: OM962968),其開放閱讀框全長1 023 bp，編碼340個(gè)氨基酸。其編碼蛋白PPase672預(yù)測相對分子質(zhì)量為37.8 kD，等電點(diǎn)為6.27，親水性指數(shù)為-0.326，推測為親水性蛋白。無信號肽，為分泌型蛋白。

氨基酸序列比對結(jié)果表明(圖1)，昆蟲的PPase結(jié)構(gòu)域序列保守。茶尺蠖EoPPase672與家蠶BombyxmoriBmPPase的序列一致性最高，為80%，與粉紋夜蛾TrichopiusianiTnPPase的序列一致性為76%，與斜紋夜蛾SpodopteralituraSlPPase的序列一致性為76%，與棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHaPPase的序列一致性為77%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明茶尺蠖EoPPase672與鱗翅目昆蟲夜蛾類中的粉紋夜蛾TnPPase的親緣關(guān)系最近，與鞘翅目的赤擬谷盜TriboliumcastaneumTcPPase親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)。

圖1 茶尺蠖EoPPase672與其他昆蟲PPase氨基酸序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of EoPPase672from Ectropis obliqua and PPase from other insects蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: EoPPase672: 茶尺蠖Ectropis obliqua, OM962968; TnPPase: 粉紋夜蛾Trichopiusia ni, XP_026737068.1; SlPPase: 斜紋夜蛾Spodoptera litura, XP_022835395.1; HaPPase: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, XP_021199627.1; HvPPase: 煙芽夜蛾Heliothis virescens, PCG63030.1; BmPPase: 家蠶Bombyx mori, XP_004922937.1; VtPPase: 特美紅蛺蝶Vanessa tameamea, XP_026484258.1; DppPPase: 黑脈金斑蝶Danaus plexippus plexippus, XP_032513218.1; AtPPase: 臍橙螟Amyelois transitella, XP_013184525.1; PxPPase: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella, CAG9132134.1; GmPPase: 大蠟螟Galleria mellonella, XP_026753285.1.

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的茶尺蠖和其他昆蟲PPase672的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig.2 Phylogenetic tree of PPase672 from Ectropis obliquaand other insects by neighbor-joining method based onamino acid sequences (1 000 replicates)蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: TnPPase: 粉紋夜蛾Trichoplusia ni, XP_026737068.1; SlPPase: 斜紋夜蛾Spodoptera litura, XP_022835395.1; HaPPase: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, XP_021199627.1; HvPPase: 煙芽夜蛾Heliothis virescens, PCG63030.1; EoPPase672: 茶尺蠖Ectropis obliqua, OM962968; CsPPase672: 水稻二化螟Chilo suppressalis,RVE43533.1; BmaPPase:野桑蠶Bombyx mandarina; XP_028027307.1; BmPPase: 家蠶Bombyx mori, XP_004922937.1; AtPPase: 臍橙螟Amyelois transitella, XP_013184525.1; GmPPase: 大蠟螟Galleria mellonella, XP_026753285.1; PrPPase: 菜粉蝶Pieris rapae, XP_022123308.1; PmPPase: 金鳳蝶Papilio machaon, XP_014370251.1; PxPPase: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus, KPI99608.1; TcPPase: 赤擬谷盜Tribolium castaneum, XP_008200814.1.

2.2 EoPPase672的原核表達(dá)

SDS-PAGE結(jié)果如圖3(A, B)所示，在50 kD處有一條表達(dá)量很高的條帶，與目的蛋白大小一致。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明重組EoPPase672蛋白的正確表達(dá)(圖3: C)。將蛋白洗脫液經(jīng)過透析、濃縮和定量，最終獲得重組EoPPase672蛋白濃度為0.28 mg/mL，單一性較強(qiáng)，可用于后續(xù)功能驗(yàn)證。

圖3 重組EoPPase672蛋白表達(dá)(A)、純化(B)的SDS-PAGE及Western blotting(C)Fig.3 SDS-PAGE detection of expression (A) and purification (B), and Western blotting (C) of the recombinant EoPPase672M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 總菌體裂解液(未誘導(dǎo))Total bacterial lysate (not induced); 2: 37℃下0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的總菌體裂解液Total bacterial lysate induced by 0.6 mmol/L IPTG at 37℃ for 4 h; 3: 超聲上清 Ultrasonic supernatant; 4: 超聲沉淀Ultrasonic precipitate; 5: 總菌體裂解液(未誘導(dǎo))Total bacterial lysate (not induced); 6: 28℃ 180 r/min下0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的總菌體裂解液Total bacterial lysate induced by 0.6 mmol/L IPTG at 28℃ and 180 r/min for 4 h; 7: 流穿液Flow-through sample; 8-13: 分別用濃度為20, 25, 50和200 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫獲得的蛋白Protein samples washed with 20, 25, 50 and 200 mmol/L imidazole elution buffer, respectively; 14: Western blot檢測的純化重組蛋白Purified recombinant protein detected by Western blot.

2.3 溴氰菊酯刺激后茶尺蠖幼蟲中EoPPase672的表達(dá)水平

結(jié)果表明(圖4)，溴氰菊酯(LC10=2.08 mg/L)刺激12 h后，茶尺蠖幼蟲中EoPPase672表達(dá)整體情況呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，2和3齡幼蟲中的表達(dá)量與對照組的相比顯著上調(diào)(P<0.001)，4齡幼蟲中的小幅上調(diào)，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；24 h后，2和3齡幼蟲中EoPPase672的表達(dá)量與對照組相比仍然顯著上調(diào)(P<0.001)，但相對于處理12 h而言，表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。

圖4 溴氰菊酯(LC10=2.08 mg/L)刺激不同時(shí)間后EoPPase672在茶尺蠖不同齡期幼蟲中的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of EoPPase672 in Ectropisobliqua larvae at different instars after exposed todeltamethrin (LC10=2.08 mg/L) for different time圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 柱上星號表示基因相對表達(dá)量在處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE.Asterisk above bars indicates significant difference in the relative gene expression level between the treatment group and the control group (*P<0.01; **P<0.01; ***P<0.001)(t-test).

2.4 EoPPase672酶活力

酶活力測定結(jié)果顯示(圖5: A)，通過Pi含量標(biāo)準(zhǔn)曲線可得EoPPase672比活力為1 279.6 U/mg。pH 4-6時(shí)酶活力低，隨著pH增加酶活力呈線性增加(圖5: B)，在靠近pH 6-7之間突然降低，推測原因可能是此pH接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，酶反應(yīng)最適pH 7-8，高于pH 8之后酶活力緩慢降低，表明EoPPae672酶反應(yīng)最適pH 7.5左右。熱穩(wěn)定性研究表明(圖5: C)，重組蛋白EoPPase672在20-100℃之間都有酶活力，65℃時(shí)活力最高，為酶反應(yīng)最適溫度，當(dāng)溫度低至20℃或高至95℃時(shí)相對活力都高達(dá)40%以上，表明重組蛋白EoPPase672具有很好的熱穩(wěn)定性。酶反應(yīng)的發(fā)生需要金屬離子作為輔因子，結(jié)果表明，Mg2+是最適金屬離子，Zn2+和Mn2+對重組蛋白EoPPase672的酶活力具有抑制作用(圖5: D)。

圖5 重組蛋白EoPPase672的酶活力(A)以及最適pH (B)、最適溫度(C)和最適金屬離子(D)Fig.5 Determination of activity (A), and the optimum pH (B), optimum temperature (C)and optimum metal ion (D) of the recombinant EoPPase672利用無機(jī)磷酸鹽(Pi)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測得酶活力。Standard curve of inorganic phosphate (Pi) content was used to determine the enzyme activity.

2.5 EoPPase672在PCR反應(yīng)中對PPi去除效果

PCR反應(yīng)后期，副產(chǎn)物的大量積累會直接影響擴(kuò)增效率，為了驗(yàn)證PPi對PCR反應(yīng)的抑制效果，外源添加焦磷酸鈉到PCR反應(yīng)中，結(jié)果如圖6，當(dāng)焦磷酸鈉濃度較低(0.25和0.5 mmol/L)時(shí)，對PCR的抑制效果不明顯，當(dāng)焦磷酸鈉濃度增加到1 mmol/L時(shí)明顯抑制了擴(kuò)增效率，2 mmol/L以上則完全抑制。表明當(dāng)反應(yīng)體系中存在大量PPi時(shí)會對擴(kuò)增效率產(chǎn)生一定影響。在PPi濃度相同的情況下，添加1.0 mg/mL EoPPase672后泳道4(未添加EoPPase672)與3(0.4 mmol/L PPi)無顯著差異。當(dāng)焦磷酸鈉濃度為0.8 mmol/L時(shí)，泳道6(未添加EoPPase672)擴(kuò)增結(jié)果明顯低于泳道5。當(dāng)焦磷酸鈉濃度高于 1.0 mmol/L 時(shí)，如未添加 EoPPase672的泳道8, 10, 12, 14和16所示，PCR擴(kuò)增被完全抑制，添加重組蛋白EoPPase672的不受抑制，如泳道7, 9, 11, 13和15所示，擴(kuò)增條帶與對照組(0 mmol/L焦磷酸鈉)無顯著差異(圖7)。說明在PCR反應(yīng)中添加重組蛋白EoPPase672可以在一定程度上水解PPi，解除PPi對PCR擴(kuò)增的抑制作用。

圖6 不同濃度焦磷酸鈉(PPi)對PCR反應(yīng)的抑制作用Fig.6 Inhibition of sodium pyrophosphate (PPi) ofdifferent concentrations on PCR reactionM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker; 1-6: 分別為0(CK), 0.25, 0.5, 1, 2和4 mmol/L PPi 0(CK)， 0.25, 0.5, 1, 2 and 4 mmol/L PPi, respectively.

圖7 重組蛋白EoPPase672 (1.0 mg/mL)在PCR反應(yīng)中對焦磷酸鈉(PPi)去除效果Fig.7 Effect of the recombinant EoPPase672 (1.0 mg/mL)on the removal of sodium pyrophosphate (PPi)in PCR reactionM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker; 1: 0 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 2: 0 mmol/L PPi; 3: 0.4 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 4: 0.4 mmol/L PPi; 5: 0.8 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 6: 0.8 mmol/L PPi; 7: 1.0 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 8: 1.0 mmol/L PPi; 9: 1.2 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 10: 1.2 mmol/L PPi; 11: 1.4 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 12: 1.4 mmol/L PPi; 13: 1.6 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 14: 1.6 mmol/L PPi; 15: 1.8 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 16: 1.8 mmol/L PPi.

2.6 重組蛋白EoPPase672對PCR擴(kuò)增效率的影響

結(jié)果顯示(圖8)，泳道1為2 μL Taq酶，無明顯條帶，泳道2為2 μL Taq酶加1 μL重組蛋白EoPPase672，擴(kuò)增結(jié)果顯示有較淡條帶。加入重組蛋白EoPPase672后泳道4, 6, 8和10擴(kuò)增結(jié)果明顯高于對照組泳道3, 5, 7和9(不加重組蛋白EoPPase672)。結(jié)果表明PCR反應(yīng)體系中加入重組蛋白EoPPase672對PCR擴(kuò)增效率具有增強(qiáng)效果。

圖8 重組蛋白EoPPase672 (1.0 mg/mL)對PCR擴(kuò)增效果的影響Fig.8 Effect of the recombinant EoPPase672 (1.0 mg/mL)on the PCR amplification efficiencyM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker; 1: 2 μL Taq; 2: 2 μL Taq+1 μL EoPPase672; 3: 3 μL Taq; 4: 3 μL Taq+1 μL EoPPase672; 5: 4 μL Taq; 6: 4 μL Taq+1 μL EoPPase672; 7: 5 μL Taq; 8: 5 μL Taq+1 μL EoPPase672; 9: 6 μL Taq; 10: 6 μL Taq+1 μL EoPPase672.

3 討論

本研究從菊酯類殺蟲劑處理茶尺蠖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到無機(jī)焦磷酸酶基因EoPPase672片段，該基因可以被殺蟲劑誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(圖4)。對基因序列進(jìn)行生物學(xué)信息預(yù)測，結(jié)果表明EoPPase672的ORF全長1 023 bp可編碼340個(gè)氨基酸殘基，推測為親水性蛋白。通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，成功表達(dá)可溶性的蛋白(圖3)，在高溫下穩(wěn)定性強(qiáng)，在pH 7.5，65℃下活力最高(圖5)。

在溴氰菊酯刺激茶尺蠖不同齡期幼蟲后，12 h后EoPPase672表達(dá)量迅速升高(圖4)，推測可能昆蟲對溴氰菊酯的作用反應(yīng)比較迅速。比較不同齡期之間的反應(yīng)程度，齡期越小的幼蟲在受到外界殺蟲劑入侵后更易誘導(dǎo)無機(jī)焦磷酸酶的表達(dá)，而齡期較高的幼蟲，機(jī)體本身免疫防御能力強(qiáng)，在LC10濃度下對4齡幼蟲的影響較低，結(jié)果提示茶尺蠖的防治在4齡幼蟲之前，殺蟲劑的作用效果較強(qiáng)，用量少。

有報(bào)道稱，焦磷酸可能是輔酶α連接酶的抑制劑，這種抑制作用可以通過添加PPase來解除，該酶可以催化PPi水解無機(jī)磷酸鹽(Pi)，從而可以加速ATP的生成(Lelièvreetal., 2020)。此外，PPase對不同的DNA聚合酶的增強(qiáng)效果不同，例如對iProof, Pfu turbo, S-KT的效果明顯弱于對Taq(李小園等, 2004)，推測原因可能是Taq酶中的金屬離子為Mg2+，在反應(yīng)過程中會競爭離子，從而導(dǎo)致增強(qiáng)效果稍弱(李小園等, 2004)。金屬離子是蛋白酶發(fā)揮活性的輔助因子，如果缺乏會影響到酶活力。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Mg2+對EoPPase672的活力是必不可少的，而其他離子起到少量的促進(jìn)或者抑制作用(圖5)。當(dāng)同時(shí)加入Mg2+, Cu2+或者Ca2+時(shí)，無機(jī)焦磷酸酶的活力下降，當(dāng)加入Mn2+時(shí)酶活力抑制程度增強(qiáng)，而Zn2+幾乎完全抑制。

此外，PPase在許多生物學(xué)過程中起著重要作用(Poole and Reeve, 2005; Carman and Han, 2006)，并且與許多臨床疾病(例如肺腺癌和結(jié)直腸癌)有關(guān)(Friedmanetal., 2004)。因此，可以建立一些簡便、靈敏的PPase活力測定方法，通過測定PPase的活力，以此來預(yù)測相關(guān)的疾病。一些生物傳感器的建立(Zhangetal., 2017)為PPase活力的測定帶來了便利。

PCR擴(kuò)增后期會進(jìn)入平臺期，產(chǎn)物積累速度減慢，酶和底物的穩(wěn)定性、活力均降低，前期不斷產(chǎn)生的焦磷酸基團(tuán)大量積累，抑制擴(kuò)增效率，同時(shí)存在引物二聚體或非特異性產(chǎn)物發(fā)生非特異性競爭，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底和擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性等現(xiàn)象。無機(jī)焦磷酸酶可以水解PPi基團(tuán)，研究發(fā)現(xiàn)體外表達(dá)的EoPPase672對PCR反應(yīng)具有增效的作用(圖8)，而加入無機(jī)焦磷酸酶可以有效消除這種現(xiàn)象。本研究中在加入重組蛋白EoPPase672后，PCR的擴(kuò)增效率得到極大的提升，說明PPase作為一種PCR擴(kuò)增增強(qiáng)劑的可行性，其熱穩(wěn)定性也為發(fā)揮功能提供了保障。研究結(jié)果為茶尺蠖解毒機(jī)理的研究提供了思路與依據(jù)。