過表達(dá)和敲減ame-miR-13b對意大利蜜蜂幼蟲腸道內(nèi)基因表達(dá)的影響

祝智威, 王 杰, 隆 琦, 許雅靜, 馮睿蓉, 劉佳美, 趙浩東,朱樂冉， 侯海青, 陳大福,2,*, 郭 睿,2,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所, 福州 350002)

真核生物的基因組可轉(zhuǎn)錄形成大量的非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，其中微小RNA(microRNA, miRNA)是一種長度約為18～25 nt的內(nèi)源性小RNA(small RNA, sRNA)，能通過結(jié)合靶mRNA的3′UTR致其降解或抑制其翻譯過程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要的調(diào)控作用(Fabianetal., 2010)。自從Lee等(1993)首次在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans發(fā)現(xiàn)第1個(gè)miRNAlin-4，并揭示lin-4能夠調(diào)控秀麗隱桿線蟲的發(fā)育過程以來，人們在小鼠Musmusculus、擬南芥Arabidopsisthaliana、家蠶Bombyxmori和蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis等動(dòng)植物和微生物中鑒定到大量miRNA(Tripathietal., 2019; Wangetal., 2019; Chenetal., 2020; 陳華枝等, 2020)。有研究表明動(dòng)物體內(nèi)約有50%的基因受到miRNA的調(diào)控(Kroletal., 2010)。目前，miRBase數(shù)據(jù)庫(http:∥www.mirbase.org/)中已收錄200多個(gè)物種的近40 000個(gè)miRNA信息，含31種昆蟲的3 000余個(gè)miRNA，包括西方蜜蜂Apismellifera的262個(gè)miRNA、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的469個(gè)miRNA、家蠶的563個(gè)miRNA、埃及伊蚊Aedesaegypti的164個(gè)miRNA、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的127個(gè)miRNA等。研究表明昆蟲miRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)影響生長、發(fā)育、生殖、免疫及耐藥性等重要生物學(xué)過程(楊婕等, 2021)。

目前，人們主要通過飼喂或注射相應(yīng)的模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)對昆蟲miRNA進(jìn)行功能研究(Michelyetal., 2017)。前人通過過表達(dá)和敲減對蜜蜂的miRNA進(jìn)行了一些功能研究，例如: Freitas等(2017)研究發(fā)現(xiàn)miR-34-5p能通過靶向調(diào)控西方蜜蜂體節(jié)分化基因eve,h和ftz-f1及結(jié)構(gòu)基因act5C進(jìn)而影響蜜蜂的胚胎發(fā)育；Michely等(2017)證實(shí)miR-12和miR-124可參與西方蜜蜂工蜂早期記憶的形成；Cristino等(2014)研究發(fā)現(xiàn)miR-932靶向調(diào)控西方蜜蜂的肌動(dòng)蛋白基因，進(jìn)而參與神經(jīng)元的可塑性形成，并影響西方蜜蜂長期記憶的形成；Liu等(2017)發(fā)現(xiàn)ame-miR-279a在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica哺育蜂和采集蜂頭部中顯著差異表達(dá)，通過靶向抑制Mblk-1的表達(dá)降低采集蜂對蔗糖的伸吻反應(yīng)；Zhu等(2017)研究發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂幼蟲能夠攝取植物花粉來源的miR-162a，并靶向抑制自身發(fā)育相關(guān)的amTOR基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)幼蟲趨向工蜂的性狀發(fā)育。此外，前人利用二代組學(xué)技術(shù)對西方蜜蜂miRNA進(jìn)行了較多研究，例如，Zondag等(2012)利用RNA-seq結(jié)合原位雜交對西方蜜蜂早期胚胎形成過程中的miRNA表達(dá)進(jìn)行分析，并通過敲減Dicer基因證明了miRNA參與了西方蜜蜂的胚胎形成。劉芳(2012)通過Solexa測序?qū)ξ鞣矫鄯涞牟赣浜筒杉漕^部miRNA進(jìn)行表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)9種miRNA在這兩種不同職能的蜜蜂中差異表達(dá)。Chen等(2019)發(fā)現(xiàn)部分中華蜜蜂Apisceranaeceranae的miRNA在受到東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae侵染后發(fā)生差異表達(dá)，功能注釋表明miRNA調(diào)控宿主被侵染后的能量代謝以及免疫通路。

蜜蜂作為完全變態(tài)昆蟲，其幼蟲生長以及化蛹過程受到保幼激素和蛻皮激素的共同調(diào)控，其中蛻皮激素受體(ecdysone receptor, EcR)和超氣門蛋白(ultraspiracle, USP)形成的異源二聚體在調(diào)控昆蟲蛻皮過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Chen and Fu, 2021)。表皮生長因子(epidermal growth factor, Egfr)廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物，可參與器官發(fā)育、機(jī)體生長及生殖等生物學(xué)過程(王菲等, 2017)。細(xì)胞色素P450作為一種重要的氧化代謝酶，在昆蟲中參與內(nèi)源物質(zhì)代謝并發(fā)揮解毒等重要功能(Ohkawaetal., 1998; 王洋等, 2019)。miR-13b作為miR-2家族的主要成員，已被證實(shí)可通過調(diào)節(jié)P450參與淡色庫蚊Culexpipienspallens的溴氰菊酯抗性(Guoetal., 2017)、東亞飛蝗Locustamigratoria的卵子形成(Songetal., 2019)以及德國小蠊Blattellagermanica的變態(tài)發(fā)育(Lozanoetal., 2015)等過程。意大利蜜蜂miR-2家族包括6個(gè)成員，分別是ame-miR-2-1, ame-miR-2-2, ame-miR-2-3, ame-miR-13a, ame-miR-13b和ame-miR-2b，這6個(gè)成員形成基因簇并位于1號(hào)染色體蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域(Heetal., 2008)。筆者團(tuán)隊(duì)前期利用sRNA-seq技術(shù)對意大利蜜蜂4, 5和6日齡幼蟲腸道進(jìn)行測序，通過比較分析揭示腸道發(fā)育過程中miRNA與Wnt, Hippo, FoxO和Hedgehog信號(hào)通路及蛻皮激素相關(guān)靶mRNA之間具有潛在的復(fù)雜調(diào)控關(guān)系(熊翠玲等, 2018)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ame-miR-13b在意大利蜜蜂4, 5和6日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量持續(xù)增加(TPM值分別為: 2 235.31, 2 832.86和3 003.52)，暗示其在腸道發(fā)育中具有潛在作用；另外，軟件預(yù)測結(jié)果顯示ame-miR-13b與Ecr,Egfr和P45018a1等基因之間存在靶向結(jié)合關(guān)系(郭睿等, 2018)。蜜蜂幼蟲腸道是消化吸收和免疫防御的關(guān)鍵器官，但ame-miR-13b調(diào)控意大利蜜蜂幼蟲腸道發(fā)育的研究迄今仍然缺失。

本研究根據(jù)ame-miR-13b的核酸序列合成相應(yīng)的mimic和inhibitor，嘗試通過飼喂法對意大利蜜蜂幼蟲腸道中的ame-miR-13b進(jìn)行過表達(dá)和敲減，進(jìn)而檢測過表達(dá)和敲減ame-miR-13b對其3個(gè)靶基因Ecr,Egfr和P45018a1表達(dá)的影響。研究結(jié)果可為深入探究ame-miR-13b調(diào)控意大利蜜蜂幼蟲腸道發(fā)育的分子機(jī)理提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試生物材料

本研究使用的意大利蜜蜂工蜂幼蟲取自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)教學(xué)蜂場。按照筆者團(tuán)隊(duì)前期建立的技術(shù)流程(郭睿等, 2018, 2019)進(jìn)行意大利蜜蜂幼蟲的人工飼養(yǎng)及腸道樣品的制備：(1)選取外觀健康且群勢較強(qiáng)的意大利蜜蜂蜂群，利用蜂王產(chǎn)卵控制器將蜂王限制于空脾上，自然產(chǎn)卵12 h后取出蜂王，然后迅速將上述巢脾提至實(shí)驗(yàn)室，利用移蟲針將發(fā)育至2日齡的幼蟲小心移至已預(yù)制50 μL飼料(蜂王漿50%，葡萄糖6%，果糖6%，酵母粉1%，無菌水37%)的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于恒溫恒濕箱，在35±0.5℃和相對濕度(RH)90%的條件下飼養(yǎng)。(2)預(yù)先配制分別含mimic-ame-miR-13b和inhibitor-ame-miR-13b的飼料50 μL(終濃度均為2 500 fmol/g)，飼喂意大利蜜蜂3日齡幼蟲，每12 h更換一次飼料，連續(xù)飼喂6次，飼養(yǎng)幼蟲至6日齡。同時(shí)，用含mimic-NC(無義mimic)或inhibitor-NC(無義inhibitor)的飼料50 μL(終濃度均為2 500 fmol/g)，飼喂意大利蜜蜂3日齡幼蟲，每12 h更換一次飼料，連續(xù)飼喂6次，作為對照組。每3頭作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3次生物學(xué)重復(fù)。(3)在超凈臺(tái)中用無菌的眼科剪和眼科鑷分別剖取意大利蜜蜂4, 5和6日齡幼蟲腸道(分別為Am4, Am5和Am6)，每3頭幼蟲的腸道樣品置于一個(gè)RNA-Free EP管，經(jīng)液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。參照Zhu等(2017)設(shè)計(jì)mimic-ame-miR-13b, inhibitor-ame-miR-13b, mimic-NC和inhibitor-NC序列，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，序列信息見表1。

表1 ame-miR-13b的模擬物和抑制物及相應(yīng)對照序列Table 1 Sequences of mimic and inhibitor of ame-miR-13b and their counterpart controls

1.2 ame-miR-13b的過表達(dá)和敲減效果檢測

根據(jù)ame-miR-13b的核苷酸序列，參照郭睿等(2019)方法設(shè)計(jì)特異性的Stem-loop引物和正向引物及通用的反向引物 (表2)， 委托上海生物工程公司進(jìn)行合成。利用RNA抽提試劑盒(Promega，美國)分別提取上述1.1節(jié)的Am4, Am5和Am6樣品的總RNA，將其均分為兩份，其中一份RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊，南京)說明書的步驟利用Stem-loop引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為模板進(jìn)行ame-miR-13b的RT-qPCR；另一份RNA利用Oligo dT引物進(jìn)行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為模板進(jìn)行ame-miR-13b靶基因、內(nèi)參基因18S rRNA(GenBank登錄號(hào): U89834.1)和內(nèi)參基因actin(Gene ID: AB023025.1)的RT-qPCR。

表2 引物信息Table 2 Primer information

參照SYBR Green試劑盒(諾唯贊，南京)的說明書，在ABI QuantStudio 3熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國)上進(jìn)行ame-miR-13b的RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系: SYBR Green Dye(諾唯贊，南京)10 μL, 上下游引物ame-miR-13b-F/R (2 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, DEPC水7 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 59℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)；熔解曲線程序默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)置。內(nèi)參基因?yàn)?8S rRNA(GenBank登錄號(hào)： U89834.1),每個(gè)反應(yīng)均進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.3 ame-miR-13b的靶基因表達(dá)量的RT-qPCR檢測

筆者所在團(tuán)隊(duì)前期已利用基于鏈特異性建庫的sRNA-seq技術(shù)對意大利蜜蜂4, 5和6日齡幼蟲腸道進(jìn)行測序，獲得了高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(郭睿等, 2018; 熊翠玲等, 2018)。 聯(lián)用RNAhybrid, miRanda和TargetScan軟件預(yù)測ame-miR-13b的靶基因，采用軟件默認(rèn)參數(shù)，靶向分析結(jié)果顯示ame-miR-13b可靶向結(jié)合Ecr(GenBank登錄號(hào): 406084),Egfr(GenBank登錄號(hào): 100577393)和P45018a1(GenBank登錄號(hào): 410405)基因(未發(fā)表數(shù)據(jù))。根據(jù)ame-miR-13b與上述3個(gè)靶基因之間的靶向結(jié)合關(guān)系，通過Adobe Photoshop CS6軟件繪制ame-miR-13b與靶基因3′UTR種子區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對關(guān)系示意圖。將1.2節(jié)中利用Oligo dT引物進(jìn)行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄得到的6日齡幼蟲腸道cDNA作為模板，利用qPCR檢測上述3個(gè)靶基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系: SYBR Green Dye 10 μL, 上下游引物(2 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, DEPC水7 μL。反應(yīng)條件: 5℃ 5 min; 95℃ 10 s, 59℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。以actin(Gene ID: AB023025.1)作為內(nèi)參基因。每個(gè)反應(yīng)均進(jìn)行3次平行重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)的相對定量。利用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖，數(shù)據(jù)進(jìn)行Student氏t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 意大利蜜蜂幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-13b的過表達(dá)和敲減效果

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于mimic-NC飼喂組，mimic-ame-miR-13b飼喂組中意大利蜜蜂4, 5和6日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-13b均上調(diào)表達(dá)，且在4(P=0.0042)和6(P=0.000012)日齡幼蟲腸道內(nèi)顯著上調(diào)，說明過表達(dá)效果顯著(圖1: A, C)；相較于inhibitor-NC飼喂組，飼喂inhibitor-ame-miR-13b組中5(P=0.0187)和6(P=0.0000069)日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-13b顯著下調(diào)，說明敲減效果顯著(圖1: E, F)；相較于mimic-ame-miR-13b飼喂組，inhibitor-ame-miR-13b飼喂組中4(P=0.0002), 5(P=0.0375)和6(P=0.00000026) 日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-13b 均顯著下調(diào)表達(dá) (圖1: G, H, I)；相較于mimic-NC飼喂組，inhibitor-NC飼喂組中4(P=0.3445), 5(P=0.8677)和6(P=0.0646)日齡幼蟲腸道內(nèi)ame-miR-13b均為下調(diào)表達(dá)，但差異均不顯著(圖1: J-L)。

圖1 過表達(dá)和敲減ame-miR-13b后其在意大利蜜蜂4 (A, D, G, J), 5 (B, E, H, K)和6 (C, F, I, L)日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量Fig.1 Expression levels of ame-miR-13b in the gut of the 4- (A, D, G, J), 5- (B, E, H, K) and 6-day-old (C, F, I, L)larvae of Apis mellifera ligustica after overexpression and knockdown of ame-miR-13b參照Zhu等(2017)法設(shè)計(jì)合成ame-miR-13b的模擬物mimic-ame-miR-13b和抑制劑inhibitor-ame-miR-13b及其對照mimic-NC和inhibitor-NC序列，與飼料混合后飼喂意大利蜜蜂3日齡幼蟲，以2 500 fmol/g的終濃度每間隔12 h飼喂1次，并連續(xù)飼喂6次。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上符號(hào)表示兩組間差異顯著性(ns P>0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001)(Student氏t檢驗(yàn))；下同。The sequences of mimic-ame-miR-13b and inhibitor-ame-miR-13b and their counterpart controls mimic-NC and inhibitor-NC were designed and synthesized as reported in Zhu et al.(2017), and then mixed with the diet at a final concentration of 2 500 fmol/g to feed the 3-day-old larvae of A. m. ligustica, the diet was changed every 12 h and the larvae were fed 6 times.Data in the figure are mean±SE.Symbols above bars indicate significant difference between two groups (ns P>0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001)(Student’s t-test).The same below.

2.2 過表達(dá)和敲減ame-miR-13b后意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道內(nèi)靶基因的表達(dá)量

ame-miR-13b與靶基因Ecr,Egfr和P45018a1基因的3′UTR種子區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對關(guān)系如圖2所示。

圖2 Ecr(A), Egfr(B)和P450 18a1基因(C)與ame-miR-13b之間的靶向結(jié)合關(guān)系Fig.2 Targeted binding relationship between Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) and ame-miR-13b

RT-qPCR結(jié)果顯示，相較于mimic-NC飼喂組，mimic-ame-miR-13b飼喂組中6日齡幼蟲腸道內(nèi)Ecr表達(dá)量顯著升高(P=0.0267)(圖3: A)；Egfr的表達(dá)量顯著降低(P=0.0483)(圖3: B)；P45018a1的表達(dá)量顯著升高(P=0.0267)(圖3: C)。

圖3 過表達(dá)ame-miR-13b后靶基因Ecr (A), Egfr(B)和P450 18a1(C)在意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量Fig.3 Expression levels of target genes Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) of ame-miR-13b in the gutof the 6-day-old larvae of Apis mellifera ligustica after overexpression of ame-miR-13b

與inhibitor-NC飼喂組相比，inhibitor-ame-miR-13b飼喂組中6日齡幼蟲腸道內(nèi)Ecr也顯著上調(diào)表達(dá)(P=0.0006)(圖4: A)；Egfr的表達(dá)量升高，但差異不顯著(P=0.1940)(圖4: B)；P45018a1的表達(dá)量顯著下降(P=0.0006)(圖4: C)。

圖4 敲減ame-miR-13b后靶基因Ecr (A), Egfr(B)和P450 18a1(C)在意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of target genes Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) of ame-miR-13b in the gut ofthe 6-day-old larvae of Apis mellifera ligustica after knockdown of ame-miR-13b

與mimic-ame-miR-13b飼喂組相比，inhibitor-ame-miR-13b飼喂組中6日齡幼蟲腸道內(nèi)Ecr的表達(dá)量降低，但差異不顯著(P=0.1049)(圖5: A)；Egfr的表達(dá)量升高，但差異不顯著(P=0.0528)(圖5: B)；P45018a1的表達(dá)量顯著下調(diào)(P=0.0001)(圖5: C)。上述結(jié)果顯示，P45018a1的表達(dá)與ame-miR-13b之間存在潛在正相關(guān)關(guān)系。

圖5 過表達(dá)和敲減ame-miR-13b后靶基因Ecr (A), Egfr (B)和P450 18a1(C)在意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道中的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of target genes Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) of ame-miR-13b in the gut ofthe 6-day-old larvae of Apis mellifera ligustica after overexpression and knockdown of ame-miR-13b

3 討論

本研究中，我們參照前人的方法(Zhuetal., 2017)設(shè)計(jì)合成了ame-miR-13b的模擬物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b序列，與飼料混合后對意大利蜜蜂幼蟲進(jìn)行飼喂，以2 500 fmol/g的終濃度每間隔12 h飼喂1次，并連續(xù)飼喂6次。RT-qPCR結(jié)果顯示，飼喂mimic-ame-miR-13b后ame-miR-13b在意大利蜜蜂4, 5和6日齡幼蟲腸道中均上調(diào)，在6日齡幼蟲腸道中上調(diào)幅度最大(2.33倍)且差異顯著性最高(P=0.000012)；飼喂inhibitor-ame-miR-13b后ame-miR-13b在4日齡幼蟲腸道中下調(diào)表達(dá)，在5和6日齡幼蟲腸道中均顯著下調(diào)表達(dá)(圖1)。以上結(jié)果表明通過飼喂法在蜜蜂幼蟲個(gè)體水平進(jìn)行miRNA的過表達(dá)和敲減具有充分的可行性，且過表達(dá)和敲減效果具有累積效應(yīng)。這為日后在蜜蜂幼蟲個(gè)體水平進(jìn)行miRNA的過表達(dá)和敲減提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此前，通過注射mimic和inhibitor對成年蜜蜂進(jìn)行miRNA的過表達(dá)和敲減已有一些報(bào)道(Freitasetal., 2017; Michelyetal., 2017)。本研究之所以選擇通過飼喂法對意大利蜜蜂幼蟲進(jìn)行ame-miR-13b的過表達(dá)和敲減，是因?yàn)橛紫x較為脆弱，注射導(dǎo)致的機(jī)械損傷極易造成幼蟲死亡。

筆者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)ame-miR-13b可潛在靶向結(jié)合Ecr,Egfr和P45018a1等850個(gè)基因。Ecr編碼蛻皮激素受體，蛻皮激素與保幼激素通過協(xié)同作用影響昆蟲蛻皮以及變態(tài)發(fā)育過程(Chen and Fu, 2021)。Egfr編碼的表皮生長因子是廣泛存在于后生動(dòng)物中的多功能受體，參與機(jī)體生長和生殖、創(chuàng)口修復(fù)等一系列重要的生理過程(王菲等, 2017)。P450編碼的細(xì)胞色素P450加單氧酶是昆蟲體內(nèi)三大解毒酶家族之一，對昆蟲生長發(fā)育及抗性起著關(guān)鍵作用(Ohkawaetal., 1998; 王洋等, 2019)。較多的研究表明miRNA對其靶基因表達(dá)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用(von Bornetal., 2018; Samadetal., 2019; Chenetal., 2020)。本研究中，過表達(dá)ame-miR-13b后，意大利蜜蜂6日齡幼蟲腸道中Egfr顯著下調(diào)表達(dá)(圖3： B)，敲減ame-miR-13b后Egfr上調(diào)表達(dá)但不顯著(圖4: B)，表明ame-miR-13b與Egfr之間具有潛在的負(fù)調(diào)控關(guān)系。這表明意大利蜜蜂幼蟲可能通過上調(diào)ame-miR-13b的表達(dá)水平負(fù)調(diào)控Egfr的表達(dá)進(jìn)而影響腸道發(fā)育過程。然而，Egfr在inhibitor-NCvsinhibitor-ame-miR-13b比較組中雖然表達(dá)量升高但不具有顯著性，推測這可能與飼喂的mimic和inhibitor劑量較低有關(guān)。下一步將以2 500 fmol/g濃度為基準(zhǔn)，設(shè)置梯度濃度的ame-miR-13b的mimic和inhibitor對意大利蜜蜂幼蟲進(jìn)行飼喂，進(jìn)一步確定mimic和inhibitor的最佳濃度。另外，過表達(dá)ame-miR-13b后Ecr表達(dá)量顯著升高(圖3: A)，敲減ame-miR-13b后Ecr同樣顯著上調(diào)表達(dá)(圖4: A)，ame-miR-13b與Ecr之間沒有明顯的正向或負(fù)向調(diào)控關(guān)系，說明該基因的表達(dá)還受到其他因素的調(diào)節(jié)。與mimic-NC組相比，P45018a1在mimic-ame-miR-13b組的表達(dá)量顯著上升(圖3: C)；而與inhibitor-NC組相比，P45018a1在inhibitor-ame-miR-13b組的表達(dá)量顯著下降(圖4: C)，說明ame-miR-13b與P45018a1之間并無負(fù)調(diào)控關(guān)系。鑒于目前已有少量研究報(bào)道m(xù)iRNA也能夠?qū)Π谢虮磉_(dá)進(jìn)行正調(diào)控(?rometal., 2008; Pandaetal., 2014)，ame-miR-13b與P45018a1之間如何互作及影響意大利蜜蜂幼蟲腸道發(fā)育值得進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究通過飼喂mimic-ame-miR-13b和inhibitor-ame-miR-13b的方法成功在意大利蜜蜂幼蟲體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了ame-miR-13b的過表達(dá)及敲減，并揭示ame-miR-13b與Egfr之間存在潛在的負(fù)調(diào)控關(guān)系。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究ame-miR-13b調(diào)控意大利蜜蜂幼蟲腸道發(fā)育的分子機(jī)理提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。