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    布雷菲德菌素A對(duì)蕨類植物卵發(fā)育的影響

    2022-05-19 07:21:20郭嚴(yán)冬曹建國(guó)周義峰戴錫玲王全喜張明霞
    植物研究 2022年3期
    關(guān)鍵詞:高爾基體卵細(xì)胞細(xì)胞器

    郭嚴(yán)冬 曹建國(guó) 周義峰 戴錫玲 王全喜 張明霞

    (1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所,南京 210014;2. 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

    蕨類植物的位置在植物界中較為特殊,是介于苔蘚植物與種子植物之間的一個(gè)過(guò)渡類群,具有孢子體和配子體2 個(gè)世代,且2 個(gè)世代均能存活,這在植物界是獨(dú)有的。目前對(duì)蕨類植物的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)分類以及新分布等方面。水蕨(L.Brongn.)作為蕨類植物的模式植物,其高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器較為典型。相關(guān)研究結(jié)果表明:受精孔是精子進(jìn)入卵細(xì)胞的通道,對(duì)研究蕨類植物有性生殖生物學(xué)具有重要的作用。課題組在前期研究的基礎(chǔ)上推測(cè)受精孔的形成可能與卵細(xì)胞和腹溝細(xì)胞中的多種細(xì)胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、囊泡、胞間連絲等)密切相關(guān)。但受精孔在蕨類植物中發(fā)生的普遍性、細(xì)胞發(fā)生機(jī)制、生物學(xué)功能和演化意義等仍未可知。

    相關(guān)研究結(jié)果表明:布雷菲德菌素A(brefeld?in A,BFA)可誘導(dǎo)高爾基體的分解,反競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體,抑制蛋白質(zhì)從高爾基體的運(yùn)輸。Shaw 等研究發(fā)現(xiàn),BFA對(duì)分泌系統(tǒng)(包括高爾基體的變化、大囊泡的形成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)匾囊的增多)具有顯著效果,阻止了高爾基體分泌物的運(yùn)輸。國(guó)內(nèi)關(guān)于BFA 的研究還主要集中在抗癌細(xì)胞中的作用等方面,且多數(shù)研究集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。而關(guān)于BFA 對(duì)植物的影響,尤其是對(duì)植物生殖發(fā)育的影響的研究還較少。水蕨因其孢子生活力很強(qiáng)、容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、孢子萌發(fā)2周后配子體就能達(dá)到性成熟、精子器和頸卵器都直接暴露在配子體的表面而易于觀察等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為一個(gè)很好的研究配子發(fā)生和相互作用的模型。鑒于此,本研究使用BFA 處理發(fā)育中的頸卵器,通過(guò)觀察高爾基體、囊泡等細(xì)胞器形態(tài)上一些可見(jiàn)的變化來(lái)探索高爾基體、囊泡等細(xì)胞器對(duì)卵膜和受精孔形成的影響,進(jìn)而探索受精孔形成的機(jī)制,為蕨類植物生殖生物學(xué)的研究提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    水蕨的孢子于2012 年10 月采自云南西雙版納植物園。將帶成熟孢子的葉片收集于標(biāo)本紙中,置于干燥通風(fēng)處使孢子自然散落。10 d后將孢子去雜并收集于硫酸紙袋中,置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩{證標(biāo)本現(xiàn)存放于上海師范大學(xué)植物標(biāo)本室。

    1.2 方法

    采用參考文獻(xiàn)中的方法對(duì)成熟孢子進(jìn)行消毒和培養(yǎng),用Nikon SMZ1500 解剖鏡和Nikon E800光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并照相記錄,待配子體上長(zhǎng)出幼嫩頸卵器后,挑選一批配子體(大于30 個(gè))放入不同質(zhì)量濃度(5、50、100 μg·mL)的BFA 溶液中,然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)10、20、30 h,共9 組,各重復(fù)3 次。對(duì)照組為未進(jìn)行任何處理的水蕨配子體(長(zhǎng)出頸卵器)。

    每隔10 h從不同質(zhì)量濃度的BFA 溶液中挑選出一批(大于10 個(gè))水蕨配子體放入0.1 mol·L磷酸緩沖液配制的體積分?jǐn)?shù)3%的戊二醛中室溫固定6 h,經(jīng)相同緩沖液沖洗后,用體積分?jǐn)?shù)2%的鋨酸后固定2 h。系列丙酮(體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%、100%)脫水后,用Spurr’s 樹(shù)脂滲透并包埋,經(jīng)70 ℃聚合9 h 得到包埋塊。半薄切片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后,用Nikon E800 觀察和照相。超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后,用Hitachi-600 電鏡觀察和照相。

    高碘酸-錫夫反應(yīng)(PAS):半薄切片用自來(lái)水浸泡1 min,1%的高碘酸氧化30 min,自來(lái)水沖洗,錫夫試劑染色30 min,用自來(lái)水沖洗1 min,亞硫酸鈉漂洗液漂洗3 次,每次2 min,自來(lái)水沖洗3 min,蒸餾水經(jīng)過(guò),自然干燥,光學(xué)顯微鏡觀察并照相。

    蘇丹黑B 反應(yīng):半薄切片用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1~2 min,用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)0.3%蘇丹黑B液(體積分?jǐn)?shù)70%乙醇配制)在40 ℃條件下染色30 min;體積分?jǐn)?shù)70%乙醇分色1 min,自來(lái)水沖洗,蒸餾水經(jīng)過(guò),自然干燥,光學(xué)顯微鏡觀察并照相。

    2 結(jié)果和分析

    對(duì)制備的9個(gè)處理組樣品觀察后發(fā)現(xiàn):經(jīng)不同質(zhì)量濃度BFA 處理不同時(shí)間后的水蕨均受到不同程度的影響,其中以50 μg·mLBFA 處理30 h的處理組的各器官表型性狀變化較為典型,因此,以該處理組(經(jīng)50 μg·mLBFA 處理30 h)的樣品與對(duì)照組(未經(jīng)BFA 處理)的樣品進(jìn)行比較。觀察結(jié)果(見(jiàn)圖版Ⅰ)表明:對(duì)照組發(fā)育卵中期的水蕨(見(jiàn)圖版Ⅰ:A1)卵細(xì)胞較大、呈杯型,細(xì)胞核體積也較大、呈弓狀,核仁呈圓形,細(xì)胞內(nèi)包含高爾基體、線粒體以及質(zhì)體等細(xì)胞器;卵細(xì)胞和腹溝細(xì)胞間的受精孔清晰可見(jiàn),二者間的分離腔內(nèi)僅有極少量的泡狀分泌物。處理組的卵細(xì)胞及細(xì)胞核整體形態(tài)與對(duì)照組基本一致,但在細(xì)胞核上方和卵膜下方均分布著大量的嗜鋨性囊泡,分離腔中充滿了絮狀物質(zhì),核仁中也呈現(xiàn)較小且數(shù)量較多的白色泡狀物質(zhì)(見(jiàn)圖版Ⅰ:B1)。組織定位顯示:對(duì)照組的分離腔較空(見(jiàn)圖版Ⅰ:A2),處理組腔內(nèi)染色較深(見(jiàn)圖版Ⅰ:B2),高碘酸-錫夫反應(yīng)(PAS)顯示處理組分離腔內(nèi)充滿著多糖類物質(zhì)(見(jiàn)圖版Ⅰ:B3)。對(duì)照組受精孔周圍的卵膜較厚,有明顯的層次,膜下有少量的嗜鋨性囊泡,受精孔下方有較多的線粒體和少量的高爾基體分布(見(jiàn)圖版Ⅰ:A3~A4);處理組卵細(xì)胞受精孔及其附近的卵膜基本上由數(shù)量較多、大小不一的囊泡組成,也有較多的線粒體分布(見(jiàn)圖版Ⅰ:B4~B5)。

    圖版Ⅰ 布雷菲德菌素A對(duì)蕨類植物卵發(fā)育的影響A1~A4.對(duì)照組;B1~B5.處理組;VCC.腹溝細(xì)胞;SeC.分離腔;P.質(zhì)體;N.細(xì)胞核;E.卵細(xì)胞;NCC.頸溝細(xì)胞;FP.受精孔;M.線粒體;EM.卵膜;OM.嗜鋨物質(zhì)PlateⅠ Effect of brefeldin A on the development of fern egg A1?A4.Control group;B1?B5.Treatment group;VCC.Ventral canal cell;SeC.Separation cavity;P.Plastid;N.Nucleus;E.Egg;NCC.Neck canal cell;FP.Fertilization pore;M.Mitochondrion;EM.Egg membrane;OM.Osmiophilic material

    從細(xì)胞器看,對(duì)照組卵細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)達(dá),且數(shù)量較多(見(jiàn)圖版Ⅱ:A5~A6),而處理組的卵細(xì)胞中則基本上觀察不到完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,出現(xiàn)較多的是囊泡和嗜鋨性囊泡(見(jiàn)圖版Ⅱ:B7~B8)。增加放大倍數(shù)可見(jiàn),對(duì)照組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體基本完整、連續(xù)(見(jiàn)圖版Ⅱ:A7),而處理組的高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已斷裂,被斷裂的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹(見(jiàn)圖版Ⅱ:B9~B10)。值得注意的是,頸卵器周圍的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中也出現(xiàn)了一個(gè)較為明顯的變化,對(duì)照組細(xì)胞中質(zhì)體分布較為分散(見(jiàn)圖版Ⅱ:A8),而處理組營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中的質(zhì)體則出現(xiàn)“聚集”的現(xiàn)象(見(jiàn)圖版Ⅱ:B11~B12)。

    圖版Ⅱ 布雷菲德菌素A對(duì)蕨類植物卵發(fā)育的影響A5~A8.對(duì)照組;B6~B12.處理組;G.高爾基體;ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng);Ver.膜性囊泡;Vo.嗜鋨性囊泡;Ve.囊泡;VC.營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞Plate Ⅱ Effect of brefeldin A on the development of fern egg A5?A8.Control group;B6?B12.Treatment group;G.Golgi body;ER.Endoplasmic reticulum;Ver.Reticulum vesicle;Vo.Osmiophilic vesicles;Ve.Vesicle;VC.Vegetative cell

    3 討論

    Keidan 等認(rèn)為,向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的紫球藻()中添加(10~25 μmol·L)BFA 會(huì)降低結(jié)合多糖和可溶性多糖的含量,但用20 μmol·LBFA 處理穩(wěn)定期的紫球藻細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁結(jié)合多糖形成的抑制效果要強(qiáng)于可溶性多糖,說(shuō)明BFA 處理濃度和細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的不同可能會(huì)有略微的差異,但總體的處理效果大致相同。超微結(jié)構(gòu)研究也表明:20 μmol·LBFA 處理細(xì)胞16 h 會(huì)破壞高爾基體的完整性。本研究中,設(shè)置不同的BFA 處理濃度和時(shí)間,經(jīng)大量觀察后發(fā)現(xiàn)各BFA 處理組的細(xì)胞均會(huì)受到不同程度的損傷,細(xì)胞中的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的完整性遭到破壞。Cros?ti 等的研究結(jié)果表明:BFA 處理會(huì)抑制蛋白質(zhì)從高爾基體的運(yùn)輸;Kartusch 等的研究結(jié)果表明:BFA 處理會(huì)影響分泌系統(tǒng)(包括高爾基體的堆疊、大囊泡的形成以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)扁囊的擴(kuò)展),甚至高質(zhì)量濃度(60 μg·mL)會(huì)導(dǎo)致高爾基體的分解,但對(duì)細(xì)胞壁無(wú)影響。頸卵器卵細(xì)胞中的受精孔與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體密切相關(guān),本研究顯微觀察表明:BFA 處理后的卵細(xì)胞中的高爾基體較少,觀察到的幾個(gè)高爾基體的結(jié)構(gòu)也不完整;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)也遭到了破壞;小囊泡的數(shù)量增多,這可能是因?yàn)槁鸭?xì)胞中的分泌系統(tǒng)遭到破壞,原本應(yīng)該被運(yùn)輸?shù)铰鸭?xì)胞上方用于卵膜形成的蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致形成的卵膜不典型(由多個(gè)囊泡堆疊形成)。對(duì)照組的卵細(xì)胞和腹溝細(xì)胞間的物質(zhì)交換是通過(guò)受精孔在線粒體供能的條件下完成的,分離腔基本無(wú)分泌物;而處理組的卵細(xì)胞由于卵細(xì)胞上方的卵膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,受精孔形成不典型,卵細(xì)胞中的物質(zhì)會(huì)通過(guò)整個(gè)卵細(xì)胞上方卵膜與腹溝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸,分離腔內(nèi)充滿了分泌物,進(jìn)而影響整個(gè)頸卵器的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn),盡管BFA 處理會(huì)影響膜分泌系統(tǒng),會(huì)影響小囊泡在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的“出芽”和“融合”,但在高爾基體未被完全分解的條件下,分泌系統(tǒng)仍然會(huì)行使其功能;值得注意的是處理組細(xì)胞中質(zhì)體出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,這可能是因?yàn)锽FA 處理會(huì)導(dǎo)致膜性細(xì)胞器的破壞,包裹淀粉粒的膜數(shù)量減少,細(xì)胞體通過(guò)這種“聚集”來(lái)緩解藥物所帶來(lái)的損耗。

    相關(guān)研究結(jié)果顯示:較難總結(jié)出BFA 處理的推薦抑制濃度,即使在較高濃度的BFA 處理下,僅通過(guò)洗脫藥物,就可以使細(xì)胞表型得到恢復(fù);且對(duì)擬南芥(L.Heynh.)的研究中發(fā)現(xiàn)BFA處理會(huì)導(dǎo)致“BFA-compartments”的形成,即反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)/早期核內(nèi)體膜的大集合體。本研究中的處理組細(xì)胞中基本無(wú)高爾基體堆疊,僅有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹著斷裂的高爾基體片段。這也從另一個(gè)方面驗(yàn)證了本研究的結(jié)論,即處理組卵細(xì)胞中的高爾基體等膜性細(xì)胞器雖然遭到破壞,但不典型的卵膜和受精孔仍然可以形成,與腹溝細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸也可以進(jìn)行。BFA 具體的破壞程度與受精孔的形成的具體關(guān)系,可進(jìn)一步借助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體特異性熒光探針進(jìn)行進(jìn)一步的研究,以期為明確蕨類植物卵細(xì)胞中的細(xì)胞器如何分工合作形成受精孔奠定基礎(chǔ)。下一步通過(guò)洗脫藥物觀察幼嫩頸卵器(即受精孔還未開(kāi)始形成),觀察受精孔是否可以正常形成,來(lái)進(jìn)一步探索細(xì)胞器在頸卵器發(fā)育過(guò)程中的作用。

    綜上所述,BFA 會(huì)對(duì)卵細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等膜性細(xì)胞器造成破壞,影響分泌系統(tǒng)的正常功能,進(jìn)而影響卵膜及受精孔的形成。

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