PM2.5 對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者巨噬細(xì)胞Toll 樣受體表達(dá)及吞噬功能的影響①

曾曉麗 施 凱 龐 琪 包海榮 劉曉菊 （蘭州大學(xué)第一醫(yī)院老年呼吸科，蘭州 730000）

PM2.5是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5μm 的大氣顆粒物，是大氣污染的重要成分。PM2.5是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）發(fā)病和急性加重的重要危險(xiǎn)因素［1］。本研究小組前期研究顯示PM2.5可降低COPD 患者及健康者單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞（monocyte derived macrophage，MDM）的吞噬功能，機(jī)制有待進(jìn)一步研究［2］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）2 和 TLR4 是巨噬細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體，可識(shí)別并結(jié)合顆粒物上的病原體相關(guān)模式分子，啟動(dòng)TLR 信號(hào)通路，介導(dǎo)吞噬和免疫應(yīng)答［3-4］。因此本文研究PM2.5對(duì)COPD患者M(jìn)DM TLR 表達(dá)及吞噬功能的影響，探討PM2.5 致COPD 患者M(jìn)DM 吞噬功能降低是否與TLR2、TLR4相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取蘭州大學(xué)第一醫(yī)院收治的COPD 急性加重 患 者 14 例，年齡 61~85 歲，符合COPD 診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。選擇同期健康志愿者 14 例作為健康組，年齡60~76 歲。COPD 組與健康組年齡、性別、吸煙者構(gòu)成比、吸煙指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組一般資料詳見表1。排除合并肺炎、支氣管擴(kuò)張癥、肺間質(zhì)纖維化、支氣管哮喘、冠心病、高血壓、糖尿病和惡性腫瘤等疾病患者。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LDYYLL2016-0033），研究對(duì)象簽署知情同意書。

表1 健康組和COPD組一般資料比較（，n=14）Tab.1 General data comparison between healthy group and COPD group（，n=14）

表1 健康組和COPD組一般資料比較（，n=14）Tab.1 General data comparison between healthy group and COPD group（，n=14）

Note：M.Male；F.Female；FEV1.Forced expiratory volume in 1 s；FVC. Forced vital capacity；%pred. %predicted；1）P＜0.01 vs Healthy group.

FEV1%pred/%90±16 44±131）Groups Healthy COPD Gender（M/F）7/7 9/5 Age/year 70±5 71±7 Smoker number/n 10 11 Smoking index/（package·year-1）28±13 30±15 FEV1/FVC/%84±11 50±131）

1.1.2 試劑與儀器 重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）購(gòu)自美國(guó)RD 公司；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；TLR4 多克隆抗體、TLR2 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；熒光標(biāo)記大腸桿菌吞噬試劑盒（FITC-E.coli）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；中流量懸浮微粒采樣器購(gòu)自武漢天虹儀器廠；PCR 儀購(gòu)自澳大利亞Cotbett 公司；蛋白電泳、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5懸液制備 采集蘭州市區(qū)PM2.5，將附著PM2.5 的濾膜剪成1 cm×1 cm 小塊浸于雙蒸水中，超聲振蕩2 h洗脫P(yáng)M2.5顆粒，紗布過濾，4 ℃離心（10 000 r/min，20 min），棄上清，下層懸混液倒入塑料平皿中冷凍干燥，收集PM2.5，稱重后配制成PM2.5懸液儲(chǔ)存液，滅菌備用。

1.2.2 MDM 培養(yǎng)與分組 抽取受試者肘靜脈血20 ml，參照 TAYLOR 等［6］方法，分離單核細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整至 3×106個(gè)/ml，接種于 24 孔板，1 ml/孔，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁的單核細(xì)胞（5×105個(gè)/孔）在含rhGM-CSF（終濃度為2 ng/ml）的RPMI1640 完全培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d獲得MDM。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD14 表達(dá)，鑒定MDM。將MDM 分為4 組，每組6 個(gè)復(fù)孔：①健康對(duì)照組（healthy control），健康者來源MDM；②健康+PM2.5組（healthy+PM2.5），健康者來源 MDM+PM2.5；③COPD組（COPD），COPD患者來源MDM；④COPD+PM2.5 組（COPD+PM2.5），COPD 患者來源 MDM+PM2.5。PM2.5懸液終濃度為100 mg/L。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè) TLR2 和 TLR4 mRNA 表達(dá)提取RNA，合成cDNA。TLR2 正向引物：5'-CAGGAGCTCTTAGTGACCAAGTGAA-3'，反向引物：5'-CACAAAGTATGTGGCATTGTCCAG-3'；TLR4 正 向引物：5'-AGGATGATGCCAGGATGATGTC-3'，反向引物：5'-TCAGGTCCAGGTTCTTGGTTGAG-3'；內(nèi)參GAPDH 正 向 引 物 ：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，基因表達(dá)分析采用2-ΔΔCt法。

1.2.4 Western blot檢測(cè)TLR2和TLR4蛋白表達(dá)提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取40μg 蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入 TLR4 一抗（1∶500）、TLR2 一抗（1∶500）及β-actin 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，對(duì)應(yīng)IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯色并分析灰度值，計(jì)算相對(duì)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)吞噬功能 將蓋玻片置于24 孔板底部，使MDM 生長(zhǎng)于蓋玻片上，洗滌，加入終濃度為0.04 mg/ml 的FITC-E. coli懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，2%臺(tái)盼藍(lán)溶液淬滅未吞噬的FITC-E. coli，洗滌，4%多聚甲醛室溫固定30 min，Hoechst 染色液染細(xì)胞核10 min，洗滌，取出蓋玻片，封片，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，F(xiàn)ITC-E.coli呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。采用Leica Confcal 軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）分析，吞噬FITC-E. coli的數(shù)量越多，MFI 越高，表明吞噬能力越強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDM 鑒定 單核細(xì)胞體積小，呈圓形，細(xì)胞核居中，懸浮生長(zhǎng)；單核細(xì)胞在rhGM-CSF 刺激下培養(yǎng)至第12天時(shí)，細(xì)胞體積明顯變大，貼壁生長(zhǎng)，多數(shù)為圓形或橢圓形，少數(shù)細(xì)胞周邊可見板狀偽足或突起，胞質(zhì)透明，富含顆粒（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞CDl4 陽性率為（93.53±8.40）%，顯著高于MDM（46.37±6.52）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明單核細(xì)胞被誘導(dǎo)成為MDM（圖1B）。

圖1 MDM鑒定Fig.1 Identification of MDM

2.2 TLR2 和 TLR4 mRNA 和 蛋 白 表 達(dá) COPD 組MDM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組；PM2.5 干預(yù)后，COPD+PM2.5 組、健康+PM2.5 組上述指標(biāo)分別較COPD 組、健康對(duì)照組降低（圖2）。

圖2 PM2.5對(duì)單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)的影響Fig.2 Effects of PM2.5 on TLR2 and TLR4 expressions in monocyte derived macrophages

2.3 吞噬能力比較 COPD組MDM吞噬FITC-E.coli的MFI明顯低于健康對(duì)照組；PM2.5干預(yù)后，COPD+PM2.5 組、健康+PM2.5 組分別較 COPD 組、健康對(duì)照組降低。健康+PM2.5 組MDM 形態(tài)不規(guī)則，吞噬的FITC-E. coli明顯少于健康對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)可見PM2.5 顆粒，細(xì)胞核固縮，有微核現(xiàn)象；COPD+PM2.5 組吞噬的 FITC-E. coli明顯少于 COPD 組，細(xì)胞核致密，細(xì)胞內(nèi)可見大小不一團(tuán)塊聚集的PM2.5顆粒，有微核現(xiàn)象（圖3）。

圖3 PM2.5對(duì)單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Fig.3 Effects of PM2.5 on phagocytosis of monocyte derived macrophages

2.4 相關(guān)性分析 健康＋PM2.5 組和COPD＋PM2.5 組 MDM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)與吞噬FITC-E.coli的MFI呈正相關(guān)（表2）。

表2 TLR2、TLR4表達(dá)與吞噬功能相關(guān)性分析（r值）Tab.2 Correlation analysis of TLR2 and TLR4 expressions and phagocytosis（r value）

3 討論

PM2.5 是空氣污染的重要組成部分，已成為危害我國(guó)居民健康的重要因素。PM2.5 與COPD 密切相關(guān)，不僅是COPD 急性加重的高危因素，也是導(dǎo)致COPD 發(fā)生的病因［7］。研究顯示當(dāng)大氣 PM2.5 濃度＞30 μg/m3，COPD 發(fā)生與PM2.5 濃度呈直線相關(guān)［8］。PM2.5濃度每升高10 μg/m3，COPD 患者急診就診率上升5.3%，住院率升高3.1%，病死率升高2.5%［9-10］。

肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage，AM）具有較強(qiáng)的吞噬活性，是呼吸道抵御PM2.5 的第一道防線，大部分顆粒物通過氣管內(nèi)黏液流動(dòng)和纖毛運(yùn)動(dòng)排出體外，進(jìn)入肺內(nèi)的顆粒物則主要依賴于AM 的吞噬作用。研究顯示，COPD 患者呼吸道易發(fā)生感染的原因是AM 吞噬功能降低，從而導(dǎo)致病原微生物定植于下呼吸道，引起COPD 反復(fù)急性加重［11］。研究還顯示，PM2.5 可抑制小鼠AM 吞噬肺炎球菌，導(dǎo)致肺部感染遷延不愈［12］。MIGLIACCIO 等［13］研究也發(fā)現(xiàn)，PM2.5 能抑制AM 對(duì)淋巴細(xì)胞的激活作用，同時(shí)減少肺組織中AM 數(shù)量，使機(jī)體抵御感染能力下降，導(dǎo)致呼吸道病原微生物定植。由于通過支氣管肺泡灌洗獲取COPD 患者和健康體檢者AM 較為困難，而MDM 與AM 在細(xì)胞表型及生理學(xué)功能包括吞噬功能相似，目前已成為體外研究AM 的經(jīng)典細(xì)胞模型［2，6］。本研究顯示，與健康組比較，COPD患者M(jìn)DM 吞噬功能低下，與 TAYLOR 等［6］研究結(jié)果一致，可能與COPD 患者下呼吸道細(xì)菌定植及慢性炎癥導(dǎo)致巨噬細(xì)胞長(zhǎng)期活化而致功能耗竭有關(guān)。

TLR2、TLR4 是巨噬細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體，可識(shí)別病原微生物表面高度保守的病原相關(guān)分子模式。PM2.5中含有少量微生物成分，TLR2和TLR4 是結(jié)合顆粒物的兩種主要效應(yīng)受體［2］。TLR4識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖，而TLR2 識(shí)別革蘭氏陽性菌的酵母多糖和脂多肽成分。ZHAO 等［14］研究顯示，小鼠氣管內(nèi)滴注PM2.5 懸液24 h 后，小鼠肺泡灌洗液中TLR2、TLR4 陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少。BECKER 等［15］研究也顯示 PM2.5 能顯著降低人 AM TLR4 mRNA 表達(dá)。本研究顯示 COPD 患者 MDM 基礎(chǔ)狀態(tài)下TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著高于健康組，PM2.5 能顯著抑制COPD 患者和健康者M(jìn)DM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。

PM2.5 致巨噬細(xì)胞吞噬功能損傷的機(jī)制，目前研究發(fā)現(xiàn)可能與氧化損傷和細(xì)胞骨架重排有關(guān)。PM2.5 表面富含的重金屬如鐵、鋅、錳等及有機(jī)成分如多環(huán)芳烴、脂多糖等可引發(fā)肺部氧化應(yīng)激，活性氧增加，抗氧化成分耗竭?；钚匝鯇?dǎo)致DNA 損傷，干擾線粒體功能并啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡，破壞細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)和吞噬細(xì)胞表面的標(biāo)志物，并導(dǎo)致肺巨噬細(xì)胞的吞噬功能下降［16］。研究還發(fā)現(xiàn)，PM2.5 可能會(huì)抑制肌動(dòng)蛋白聚合，引起細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)障礙，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬能力下降［17-18］。TLR在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫和適應(yīng)性免疫中具有重要作用。一方面AM 通過細(xì)胞表面表達(dá)的TLR 識(shí)別并結(jié)合顆粒物上的病原體相關(guān)模式分子，啟動(dòng)TLR 信號(hào)通路，繼而通過下游信號(hào)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和AP-1，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和趨化因子的合成增加［3］。另一方面，PM2.5可引起AM介導(dǎo)的免疫反應(yīng)延遲或抑制，導(dǎo)致呼吸道細(xì)菌的易感性提高［19］。本研究顯示，PM2.5抑制MDM吞噬功能的同時(shí)也下調(diào)TLR2 和 TLR4 表達(dá)，相關(guān)分析顯示 MDM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)與吞噬FITC-E.coli的MFI呈正相關(guān)，說明巨噬細(xì)胞吞噬能力與TLR2、TLR4表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，PM2.5 可損傷COPD 患者巨噬細(xì)胞吞噬功能，同時(shí)下調(diào)巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4 表達(dá)；PM2.5 致巨噬細(xì)胞吞噬功能下降可能與TLR2、TLR4表達(dá)下降有關(guān)。