高表達(dá)Gal-9的肝癌血漿外泌體誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞功能失調(diào)的機(jī)制研究①

姚琳芳 王菊英 蘇 明 紀(jì)婷婷 劉瑤瑤 周 每 （寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡原因的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率較高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康［1］。盡管近年HCC 診斷與治療均取得快速進(jìn)展，但由于HCC復(fù)發(fā)率及耐藥性較高等，HCC 患者五年生存率仍不理想，急需研究者積極探索新的肝癌治療策略［2］。

近年免疫治療備受關(guān)注，而肝癌細(xì)胞能夠通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫耐受，從而逃避機(jī)體免疫監(jiān)控及殺傷，最終導(dǎo)致腫瘤不斷進(jìn)展，因此，積極深入探究肝癌誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的相關(guān)機(jī)制具有重要意義［3］。外泌體是由雙層磷脂分子包裹的囊泡樣小體，直徑40~200 nm，廣泛存在于血液、尿液及腹水等多種體液中。近年越來(lái)越多研究證實(shí)，外泌體通過(guò)其內(nèi)包含母體細(xì)胞蛋白、DNA、mRNA/miRNA/lncRNA、脂類(lèi)等多種生物活性成分在腫瘤細(xì)胞增殖、免疫逃逸及播散轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）屬半乳糖凝集素家族，其作為T(mén) 細(xì)胞免疫球蛋白和黏附因子3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3，Tim-3）配體，廣泛存在于生物體內(nèi)，且參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、胚胎發(fā)育及腫瘤免疫逃逸等多種生理病理過(guò)程［5-6］。NK 細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，也是體內(nèi)抵御腫瘤的第一道防線。HCC 發(fā)展過(guò)程中，NK 細(xì)胞功能缺陷與疾病進(jìn)展高度相關(guān)，同時(shí)也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要原因［7］。最新數(shù)據(jù)證實(shí)，HCC 患者外周血NK 細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)顯著增加，可能與患者腫瘤分期、臨床預(yù)后等密切相關(guān)［7］。研究顯示，Tim-3/Gal-9 信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［8］。而外泌體作為一種重要的傳播媒介是否參與HCC 免疫逃逸尚未闡明。本研究將通過(guò)檢測(cè)Gal-9 在HCC 血漿外泌體中的表達(dá)，探究其對(duì)NK 細(xì)胞功能的影響及相關(guān)機(jī)制，以進(jìn)一步闡明HCC誘導(dǎo)免疫逃逸的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本 選取2018年9月至2019年10月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普外科行根治性肝癌切除術(shù)的10 例HCC 患者（HCC 組），組織樣本經(jīng)臨床診斷及術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為HCC。其中男性8 例，女性2 例，平均年齡（54.1±4.3）歲；乙肝病毒表面抗原陽(yáng)性（HBsAg）者 7 例，陰性 3 例；腫瘤直徑≥5 cm 者4 例，＜5 cm 者 6 例；Chid-Pugh 系統(tǒng)分級(jí)：A 級(jí) 6 例，B~C級(jí)4例；另選寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院體檢中心體檢者10 例，結(jié)果正常的患者作為正常對(duì)照組（NC 組），其中男性 8 例，女性2 例，平均年齡（53.8±4.1）歲，兩組患者性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HCC 組為臨床資料完整的接受根治性治療的原發(fā)性HCC 患者；②所有患者血、尿、糞常規(guī)及腎功能、心電圖等檢查均正常，NC 組肝功能檢查正常；③HCC 患者術(shù)前均未接受放療、化療、免疫等其他抗腫瘤治療；④所有患者未合并心腦血管、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌等其他器官或組織疾病。取兩組患者晨起空腹靜脈血5 ml 提取血漿外泌體。本研究獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.1.2 主要試劑 人肝癌細(xì)胞細(xì)胞系HepG2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640、DMEM/HG、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone 公司）；TRIzol 試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（100 U/ml，杭州四季青生物公司）；外泌體蛋白提取試劑盒（Thermo）；人重組Gal-9（美國(guó)R＆D公司）；淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma 公司）；MACS NK 細(xì)胞分離試劑盒（德國(guó)Miltenyi biotec 公司）；小鼠抗人Tim-3-FITC、小鼠抗人IFN-γ-APC、CD56-FITC、小鼠抗人 CD3-APC（美國(guó) Biolegend）；Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天）；PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）；PCR 引物由上海生工合成，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體分離及鑒定 取收集的外周血，800 g 離心10 min，取500 μl 上層血清，按照外泌體分離試劑盒說(shuō)明分離血清外泌體，3.5%多聚甲醛固定，滴加至銅網(wǎng)，2%鈾酸鹽染色，晾干，透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察外泌體形態(tài)；PBS 按 100∶1 稀釋適量外泌體，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，Nanosight 納米粒徑顆粒跟蹤分析儀（Nano-Sight particle tracking analysis，NTA）檢測(cè)外泌體粒徑；Western blot 檢測(cè)外泌體特征蛋白CD81、CD63表達(dá)。

1.2.2 NK 細(xì)胞分離及Tim-3 表達(dá) 取外周血離心后所得細(xì)胞沉淀，重懸于5 ml RPMI1640，將其鋪于等體積淋巴細(xì)胞分離液面，于緩升緩降的離心機(jī)中2 000 r/min 離心30 min，吸取中間層“云霧狀”單個(gè)核細(xì)胞，NK 細(xì)胞即位于其內(nèi)。參考MACS NK 細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明分離上述單個(gè)核細(xì)胞中的NK 細(xì)胞，PBS洗滌，流式洗液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，依次加入 CD56-FITC、CD3-APC、Tim-3-PE 流式抗體檢測(cè)兩組患者外周血NK細(xì)胞中Tim-3表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 常規(guī)復(fù)蘇HepG2 細(xì)胞，采用含10%FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%融合時(shí)，0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。按NC 組NK 細(xì)胞處理?xiàng)l件不同將其分為2 組：Gal-9 組（2 μg/ml 人工重組Gal-9 處理）；PBS 組（等體積PBS 處理），培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞表面分子檢測(cè)：取待測(cè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，PBS稀釋?zhuān)尤脒m量CD56-FITC、CD3-APC、Tim-3-PE 和 IFN-γ-APC 流式抗體進(jìn)行標(biāo)記，4 ℃避光孵育30 min，對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體，300 目濾膜過(guò)濾細(xì)胞團(tuán)塊，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。Annexin V 凋亡實(shí)驗(yàn)：取上述 2 組細(xì)胞，800 g 離心5 min，棄上清，4 ℃預(yù)冷PBS 洗滌2 次，按上述方法離心，收集細(xì)胞沉淀，195μl Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，輕輕搖晃離心管充分混勻，4 ℃避光孵育30 min。按前述方法過(guò)濾后上機(jī)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 LDH 釋放法檢測(cè)NK 細(xì)胞殺傷活性 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞（靶細(xì)胞），以NK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。按照NK 細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行LDH 釋放實(shí)驗(yàn)：將分離純化的NK 細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞分別調(diào)整至 5×104個(gè)/孔與 1×104個(gè)/孔，接種至96 孔板作為實(shí)驗(yàn)孔；設(shè)置分別含1×104個(gè)/孔或5×104個(gè)/孔的靶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞作為靶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔；另設(shè)含1×104個(gè)/孔靶細(xì)胞的培養(yǎng)液（孵育結(jié)束45 min 前加入10μl lysis solution）作為靶細(xì)胞最大釋放孔。上述每孔均含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)液 100 μl，37 ℃、5%CO2共培養(yǎng) 4 h，收集上清。取適量上清按1∶1 加入底物，室溫避光反應(yīng)30 min，加入等體積終止液于490 nm 處檢測(cè)各孔吸光度值（OD 值）。以上各組均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，NK 細(xì)胞殺傷活性（%）=（OD實(shí)驗(yàn)孔-OD效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放-OD靶細(xì)胞自發(fā)釋放）（/OD靶細(xì)胞最大釋放-OD靶細(xì)胞自發(fā)釋放）×100%。檢測(cè)Gal-9 處理后對(duì)NK 細(xì)胞殺傷活性的影響時(shí)，預(yù)先將NK 細(xì)胞置于終濃度為2μg/ml 的Gal-9 或等體積PBS 中4 ℃孵育30 min，再將NK 細(xì)胞與靶細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，并按上述方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 Western blot 4 ℃預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白。外泌體中總蛋白采用外泌體蛋白提取試劑盒提取。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入CD63（1∶300）、CD81（1∶300）、Gal-9（1∶300）、p-JNK（1∶500）、JNK（1∶500）、Cleaved Caspase-3（1∶800）、Caspase-3（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST 清洗3 次，5 min/次，加入辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗 3 次，5 min/次。均勻滴加ECL 發(fā)光液后于凝膠成像儀曝光拍照，Image J 軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH比值作為其相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS19.0 和 GraphPad Prism5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gal-3 在外泌體中的表達(dá) TEM 和 NTA 結(jié)果顯示，外泌體呈圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約30~150 nm（圖1A、B）。Western blot結(jié)果顯示，外泌體標(biāo)志分子 CD63、CD81 在 NC-Exo 與 HCC-Exo 中均呈高表達(dá)，而 Gal-3 在 HCC-Exo 中表達(dá)較 NC-Exo 明顯增加（P＜0.01，圖1C）。

圖1 血漿外泌體中Gal-9表達(dá)（×200）Fig.1 Gal-9 expression in plasma exosomes（×200）

2.2 外周血NK 細(xì)胞Tim-3 表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組受試者外周血NK 細(xì)胞Tim-3 表達(dá)，結(jié)果顯示，與 NC 組相比，HCC 組外周血 NK 細(xì)胞 Tim-3 表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖2）。

圖2 HCC患者外周血NK細(xì)胞Tim-3表達(dá)Fig. 2 Tim-3 expression in peripheral blood NK cells of patients with HCC

2.3 Gal-9 對(duì)NK 細(xì)胞Tim-3 表達(dá)及功能的影響與PBS 相比，Gal-9 顯著促進(jìn)NK 細(xì)胞Tim-3 表達(dá)（P＜0.05，圖3A）；Annexin V 凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PBS組相比，Gal-9 顯著促進(jìn) NK 細(xì)胞凋亡（P＜0.05，圖3B）；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與PBS 組相比，Gal-9處理后的 NK 細(xì)胞 IFN-γ 表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖3C）；NK 細(xì)胞殺傷活性結(jié)果表明，Gal-9 處理后的NK 細(xì)胞對(duì)HepG2 細(xì)胞殺傷能力較PBS 組顯著降低（P＜0.05，圖3D）。

圖3 Gal-9促進(jìn)NK細(xì)胞Tim-3表達(dá)及功能損傷Fig.3 Gal-9 promoted expression and functional impairment of Tim-3 in NK cells

2.4 Gal-9 對(duì)NK 細(xì)胞MAPK 信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blot 結(jié)果表明，與PBS 組相比，Gal-9 處理后的NK 細(xì)胞JNK 蛋白磷酸化水平與Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，圖4）。

圖4 Western blot 檢測(cè)Gal-9 對(duì)NK 細(xì)胞信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Gal-9 on expression of signaling pathway and apoptotic proteins in NK cells detected by Western blot

3 討論

Gal-9 是一種具有2 個(gè)重復(fù)碳水化合物識(shí)別區(qū)域的半乳糖凝集素，其最初被鑒定為嗜酸性粒細(xì)胞趨化及激活因子，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)Gal-9 不僅能夠調(diào)控細(xì)胞黏附、增殖、凋亡等功能，還可通過(guò)影響免疫細(xì)胞功能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［9-10］。最近研究發(fā)現(xiàn)Gal-9 可與其受體Tim-3 相互作用，促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞衰竭，并誘導(dǎo)髓源性抑制細(xì)胞增殖負(fù)性調(diào)控 T 細(xì)胞功能［11］。而HBV 感染可顯著促進(jìn)肝細(xì)胞表面Gal-9 表達(dá)，從而抑制NK 細(xì)胞殺傷活性及分泌功能，誘導(dǎo)免疫耐受，并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞癌變［12］。肝癌患者外周循環(huán)中Gal-9 表達(dá)與術(shù)后患者生存率呈負(fù)相關(guān)，提示Gal-9 以某種方式影響患者整體免疫狀態(tài)［13］。NK 細(xì)胞是先天免疫應(yīng)答系統(tǒng)中的重要功能執(zhí)行細(xì)胞，可發(fā)揮類(lèi)似CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞功能，可直接殺傷感染病原體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，而NK細(xì)胞不需要抗原提呈，通過(guò)自身表面激活或抑制性受體識(shí)別環(huán)境中的可溶性配體，如細(xì)胞因子或細(xì)胞在病理?xiàng)l件下呈現(xiàn)的表面抗原分子，并通過(guò)整合所接受到的活化及抑制性信號(hào)發(fā)揮其相應(yīng)免疫功能［14］。大量研究證實(shí) Gal-9 受體 Tim-3 是廣泛存在于HCC 腫瘤微環(huán)境中的明星免疫檢查點(diǎn)分子，最新研究顯示Tim-3 不僅在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)顯著升高，在HCC 外周免疫細(xì)胞（如NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞）中表達(dá)同樣異常增加，且高表達(dá)Tim-3的免疫細(xì)胞均出現(xiàn)功能顯著受損現(xiàn)象［15-16］。

外泌體作為腫瘤細(xì)胞釋放的并攜帶重要信息分子的載體，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用，通過(guò)不同作用機(jī)制抑制免疫細(xì)胞分化及功能，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［17］。本研究通過(guò)分離HCC 患者與正常人群血漿外泌體發(fā)現(xiàn)，HCC 患者Gal-9 表達(dá)顯著增加。流式細(xì)胞術(shù)分析HCC 患者外周血NK 細(xì)胞中Tim-3 表達(dá)，結(jié)果與既往研究一致，Tim-3 在HCC 中的表達(dá)較健康人群顯著升高［15］。進(jìn)一步通過(guò)人工重組Gal-9 處理健康人外周血NK 細(xì)胞，結(jié)果表明Gal-9 能夠顯著促進(jìn)NK 細(xì)胞表面Tim-3 表達(dá)，并誘導(dǎo)其凋亡。同時(shí)，課題組在探究Gal-9 是否影響NK 細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，Gal-9 可能通過(guò)降低NK 細(xì)胞IFN-γ 表達(dá)降低其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gal-9 能夠通過(guò)促進(jìn)NK 細(xì)胞MAPK 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白JNK 磷酸化水平及凋亡蛋白酶Caspase-3表達(dá)而影響NK細(xì)胞功能改變。JNK 屬于MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為。JNK 經(jīng)磷酸化活化后可進(jìn)一步激活下游Caspase-3，而凋亡蛋白酶Caspase-3 是細(xì)胞中各種凋亡途徑的樞紐分子，也是細(xì)胞凋亡的指示劑，其激活表示細(xì)胞已進(jìn)入凋亡早期，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［18］。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)研究報(bào)道，Gal-9 可通過(guò)與Tim-3 相互作用促進(jìn)孕婦外周循環(huán)NK 細(xì)胞中JNK 蛋白磷酸化，從而誘導(dǎo)其免疫表型和細(xì)胞因子產(chǎn)生，有助于維持母胎界面免疫耐受［19］。

綜上，本研究顯示HCC 血漿外泌體中高表達(dá)的Gal-9 能夠促進(jìn)NK 細(xì)胞表面Tim-3 表達(dá)，并通過(guò)MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡，并抑制其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，為Gal-9 在HCC 免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，但Gal-9 是否通過(guò)其他途徑調(diào)控免疫系統(tǒng)有待進(jìn)一步研究。