雷公藤內(nèi)酯醇通過Nrf2/ARE 信號通路調(diào)控淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制研究①

周 箭 黃純蘭 劉恒偉 曾昭宇 譚 競 （成都市第三人民醫(yī)院血液科，成都 610031）

套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）作為非霍奇金淋巴瘤較為罕見的類型，其臨床特征主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大以及脾臟、外周圍血液、骨髓等結(jié)外病變，具有惰性和高侵襲性特點(diǎn)，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，預(yù)后中位總生存期為4~5年［1-2］。MCL 臨床治療主要以放化療為主，但具有耐藥、毒副作用和治療效果較差等不良效果，因此，尋找淋巴瘤安全有效的治療方法具有重要意義［3］。雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TPL）是從雷公藤根莖提取的二萜類化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等藥理活性，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，又可防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［4-5］。但關(guān)于TPL 在非霍奇金淋巴瘤中的報道較少。核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）和抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant reaction element，ARE）通過參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等影響腫瘤細(xì)胞進(jìn)程，具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等作用，但其在淋巴瘤中的研究較少［6-7］。本研究以人源MCL細(xì)胞JeKo-1為研究對象，探討TPL 通過Nrf2/ARE 信號通路對淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制，為淋巴瘤治療提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 人源MCL 細(xì)胞JeKo-1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；TPL購自上海融禾醫(yī)藥公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、10%胎牛血清購自美國Gibco 公司；青霉素、鏈霉素購自杭州吉諾生物公司；Lipofectamine2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；MTT、二甲基亞砜、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自上海碧云天生物公司；Binding Buffer、BCA 試劑盒購自北京索萊寶公司；Ki67 抗體、Bcl-2 抗體、Bax 抗體、Nrf2 抗體、NQO-1 抗體和 HO-1 抗體購自美國CST 公司；TRIzol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Advantage qPCR Premix 試劑盒購自日本TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將人源MCL 細(xì)胞JeKo-1于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的 RPMI1640 培養(yǎng)基復(fù)蘇解凍，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)細(xì)胞，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞生長至80%融合時，加入胰酶消化傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期JeKo-1細(xì)胞調(diào)整至3×104個/ml，不同濃度 TPL（0、25、50、100 ng/ml）處理 JeKo-1 細(xì)胞。取對數(shù)生長期JeKo-1 細(xì)胞，重懸，胰酶消化，接種至24 孔板，嚴(yán)格按照Lipofectamine2000 試劑盒說明書操作，將質(zhì)粒vector 和Nrf2 pcDNA 轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期JeKo-1 細(xì)胞，加入100 ng/ml MCL 處理細(xì)胞，記為TPL+vector組和TPL+Nrf2 pcDNA組。

1.2.2 MTT 檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期JeKo-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種至96 孔板，加入相應(yīng)TPL培養(yǎng)48 h，加入20μl MTT 溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，繼續(xù)加入150μl 二甲基亞砜溶液，振蕩反應(yīng)10 min 后終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測490 nm 處細(xì)胞OD值，計算細(xì)胞活力（%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期JeKo-1細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞，離心，棄上清，重懸細(xì)胞，加入500μl Binding Buffer，按試劑盒說明書操作，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI 染液，避光反應(yīng)15~20 min，Attune NxT 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 檢 測 Ki67、Bcl-2、Bax、Nrf2、NQO-1 和HO-1 蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期JeKo-1 細(xì)胞，加入蛋白裂解液處理細(xì)胞，BCA 試劑盒測定總蛋白濃度，各泳道加入35 μg 蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE處理，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，加入一抗Ki67、Bcl-2、Bax、Nrf2、NQO-1 和 HO-1（1∶1 000 稀釋）4 ℃培養(yǎng)過夜，洗膜，加入二抗37 ℃孵育2 h，洗膜，加入ECL 發(fā)光液顯影曝光，以GAPDH為內(nèi)參，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值并計算相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.2.5 qRT-PCR 檢測Nrf2 mRNA 表達(dá) 取對數(shù)生長 期 TPL+vector 組 和 TPL+Nrf2 pcDNA 組 JeKo-1 細(xì)胞，TRIzol試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA 濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR Advantage qPCR Premix 試劑盒在熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。Nrf2 正向引物序列：5'-AGCAGGAACAGGGTGATACAGC-3'，反向引物序列：5'-GAGGAAGTGGGAAGCCAGAAT-3'；GAPDH 正向引物序列：5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，反向引物序列：5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPL 對 JeKo-1 細(xì)胞活力的影響 MTT 結(jié)果顯示，不同濃度（0、25、50、100 ng/ml）TPL 處理 JeKo-1細(xì)胞后，隨著TPL 濃度增加（P＜0.05），細(xì)胞活力逐漸降低（P＜0.05，圖1）。

圖1 TPL對JeKo-1細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of TPL on viability of JeKo-1 cells

2.2 TPL 對JeKo-1 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度（0、25、50、100 ng/ml）TPL 處理JeKo-1 細(xì)胞后，隨著TPL 濃度增加（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率逐漸升高（P＜0.05，圖2）。

圖2 TPL對JeKo-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of TPL on apoptosis of JeKo-1 cells

2.3 TPL對JeKo-1細(xì)胞Ki67、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，不同濃度（0、25、50、100 ng/ml）TPL 處理 JeKo-1 細(xì)胞后，隨著 TPL 濃度增加，Ki67、Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05），而Bax蛋白表達(dá)逐漸增加（P＜0.05，圖3）。

圖3 TPL 對 JeKo-1 細(xì)胞 Ki67、Bcl-2 和 Bax 蛋 白 表 達(dá) 的影響Fig.3 Effect of TPL on expressions of Ki67，Bcl-2 and Bax proteins in JeKo-1 cells

2.4 TPL 對 JeKo-1 細(xì)胞 Nrf2、NQO-1 和 HO-1 表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，不同濃度（0、25、50、100 ng/ml）TPL 處理 JeKo-1 細(xì)胞后，隨著 TPL 濃度增加，Nrf2、NQO-1 和 HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 TPL對JeKo-1細(xì)胞Nrf2、NQO-1和HO-1表達(dá)的影響Fig.4 Effect of TPL on expressions of Nrf2，NQO-1 and HO-1 in JeKo-1 cells

2.5 Nrf2 pcDNA 降低 TPL 處理的 JeKo-1 細(xì)胞 Nrf2表達(dá) 選擇100 ng/ml TPL 處理JeKo-1 細(xì)胞，qRTPCR 和 Western blot 檢測 Nrf2 mRNA 和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與 TPL+vector 組相比，TPL+Nrf2 pcDNA 組Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 Nrf2 pcDNA降低TPL處理的JeKo-1細(xì)胞Nrf2表達(dá)Fig.5 Nrf2 pcDNA reduced expression of Nrf2 protein in JeKo-1 cells treated by TPL

2.6 Nrf2 pcDNA 降低了 TPL 對 JeKo-1 細(xì)胞活力和凋亡的影響 與TPL+vector組相比，TPL+Nrf2 pcDNA組細(xì)胞活力、Ki67、Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 Nrf2 pcDNA 抑制TPL 對JeKo-1 細(xì)胞活力和凋亡的影響Fig.6 Nrf2 pcDNA reduced effect of TPL on viability and apoptosis of JeKo-1 cells

3 討論

MCL又屬于B淋巴細(xì)胞類型，其病理學(xué)分型、臨床表現(xiàn)和治療較為復(fù)雜，是一種侵襲性和惰性惡性腫瘤，雖然化療可延長MPL 患者生存期，但治愈效果不甚理想［8-9］。雷公藤作為中國傳統(tǒng)醫(yī)藥，最初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦性寒，臨床多用于治療免疫性疾病和心血管疾病等［10］。TPL含豐富的活性化合物，主要有二萜、三萜、生物堿等，目前發(fā)現(xiàn)的二萜化合物有雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷酚內(nèi)酯、TPL、雷酚酮內(nèi)酯等［4，11-12］。豐小敏等［13］研究顯示，TPL 可明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，與本研究結(jié)果相似。MA等［14］研究發(fā)現(xiàn)，TPL顯著抑制食管鱗狀癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。關(guān)于TPL在淋巴瘤細(xì)胞中的研究較少，因此本研究采用TPL處理JeKo-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著TPL 濃度增加，可明顯抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明TPL 可明顯抑制JeKo-1 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。

Ki67 是一種核增殖抗原，存在于細(xì)胞有絲分裂S期、G1期、G2期及M 期，是常用于評估細(xì)胞增殖的標(biāo)志蛋白，在惡性腫瘤（如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和惡性淋巴瘤）中起重要作用［15］。Ki67 在惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與癌癥分期顯著相關(guān)［16］。Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵成員，有抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促凋亡蛋白（Bax），DNA 干擾可阻斷Bcl-2 基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致多種疾病發(fā)生（如淋巴瘤），Bax和Bcl-2在細(xì)胞程序性死亡中具有重要作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度TPL 處理JeKo-1 細(xì)胞后，可下調(diào)促增殖蛋白Ki67和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，進(jìn)一步證明TPL對JeKo-1細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

Nrf2/ARE 信號通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激中常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，在細(xì)胞增殖、凋亡等過程中具有重要作用［18］。Nrf2 激活后進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核內(nèi)ARE結(jié)合，也可影響NQO-1 和HO-1 蛋白表達(dá)參與細(xì)胞增殖和凋亡等過程［19-21］。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 在淋巴瘤組織中高表達(dá)，與不良臨床表現(xiàn)（貧血、癌癥分期等）相關(guān)［22-23］。姜黃素處理肺癌細(xì)胞 A549 后，Keap1、Nrf2 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，姜黃素可通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)其凋亡［24］。本研究檢測Nrf2、NQO-1和HO-1 mRNA 以及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，TPL 顯著抑制Nrf2/ARE 信號通路蛋白表達(dá)，表明TPL 對Nrf2/ARE 信號通路活性有明顯抑制作用。進(jìn)一步研究顯示，過表達(dá)Nrf2 可明顯上調(diào)JeKo-1 細(xì)胞Nrf2 mRNA 和蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，以及上調(diào) Ki67、Bcl-2 蛋白表達(dá)，下調(diào) Bax 蛋白表達(dá)，說明TPL 對Nrf2/ARE 信號通路活性具有明顯抑制作用，進(jìn)而影響JeKo-1細(xì)胞增殖和凋亡。

本研究顯示，TPL 通過調(diào)控Nrf2/ARE 信號通路抑制JeKo-1 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，為淋巴瘤應(yīng)用研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。