白芍總苷對HaCaT細胞外泌體的影響及機制研究

李 燕, 秦夏蓮, 沈 艷

(江蘇省無錫市第八人民醫(yī)院 皮膚科, 江蘇 無錫, 214000)

銀屑病為臨床常見皮膚病，激素、免疫抑制劑是其主要治療藥物，但副作用大，復(fù)發(fā)率高。目前，銀屑病的發(fā)病機制尚未闡明，有學(xué)者[1]認為角質(zhì)形成細胞增殖與銀屑病密切相關(guān)。白芍總苷具有抗炎、止痛及調(diào)節(jié)免疫力的功效，已被用于多種疾病的治療中[2-3]。近年來研究[4]發(fā)現(xiàn)，白芍總苷對銀屑病療效顯著(無論是單獨用藥還是聯(lián)合用藥)，且副作用小，但確切機制尚不清楚。外泌體是一種細胞外囊泡，是微環(huán)境中細胞間通訊的重要載體，參與細胞間信息傳遞。相關(guān)研究[5]顯示，銀屑病患者外周血中性粒細胞分泌的外泌體中炎性因子水平相較中性粒細胞更高，提示外泌體在銀屑病發(fā)病中可能發(fā)揮著一定作用。本研究探討白芍總苷對HaCaT細胞生物學(xué)行為、外泌體分泌的影響及其可能機制，以期為銀屑病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞株及儀器

白芍總苷(美國TargetMol 公司), HaCaT 細胞(美國Sciencell Research Laboratories); 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液、雙抗、胰蛋白酶(天津中奧天元生物有限公司); 引物序列(蘇州金維智生物有限公司); 兔抗人CD63、CD81、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)及β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Abcam公司，英國); Transwell小室(美國Coring公司); 四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑盒，RNA提取試劑盒(北京Biosharp公司); 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(大連寶生物有限公司)，蛋白印跡試劑盒(北京索萊寶公司); 酶標(biāo)儀(美國bio-rad公司), ABI 7900 PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司), Tecnai F30 G2型號場發(fā)射透射電子顯微鏡(美國賽默飛公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞(37 ℃, 5%CO2培養(yǎng))，當(dāng)細胞融合度達到80%后用胰酶消化，離心，每孔100 μL(細胞密度2×105個/mL)接種于96孔板中，分別加入50、100、200 μg/L白芍總苷培養(yǎng)液(分別設(shè)為低劑量組、中劑量組、高劑量組)，同時設(shè)對照組(加入等量完全培養(yǎng)液)，每組3個復(fù)孔。

1.3 MTT實驗

按照1×104個/孔細胞密度將細胞于96孔板培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 mL MTT孵育4 h, 去培養(yǎng)液后加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO), 水平搖床30 min, 測量吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組A值-白芍總苷組A值)/對照組A值×100%。

1.4 Transwell實驗

采用無Matrigel基質(zhì)膠和有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室分別進行細胞遷移實驗和侵襲實驗。遷移實驗: 上室加入200 μL細胞密度為5×104個/mL的培養(yǎng)基，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，孵育48 h, 4%多聚甲醛固定10 min, 0.5%結(jié)晶紫染色10 min。清洗曬干，計算細胞數(shù)量。侵襲實驗: 無血清DMEM: 稀釋基質(zhì)膠為1∶6, 每個Transwell小室中加40 μL Matrigel基質(zhì)膠, 37 ℃孵育半小時。去除培養(yǎng)液，其余同遷移實驗。

1.5 外泌體蛋白提取及檢測

取處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細胞，用胰酶消化，采用超速離心法提取外泌體, 1 500 轉(zhuǎn)/min離心10 min, 棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后再以36 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min, 220 nm無菌濾膜過濾, 30 000 轉(zhuǎn)/min離心90 min, 小心吸盡上清液并丟棄，沉淀即為外泌體。用10 μL細胞裂解液孵化20 min, 常溫下36 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min, 留取上清液，即為外泌體蛋白。

1.6 透射電子顯微鏡觀察外泌體

將細胞的純化外泌體重懸于PBS中，滴入電子顯微鏡格柵中吸收10 min, 然后將吸收的外泌體用2%磷鎢酸(pH值6.8)進行5 min負染色，于白熾燈下風(fēng)干后，使用透射電子顯微鏡(PHLIPS-TECNAI 10)在120 kV下進行電鏡觀察。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測外泌體相關(guān)指標(biāo)和通路相關(guān)指標(biāo)蛋白表達量

取處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細胞，加入裂解液，冰浴30 min, 40 ℃ 1 500 轉(zhuǎn)/min離心5 min, 去上清液，離心，取10 μL待測。取此前提取的外泌體蛋白10μL, 按照說明書要求檢測蛋白濃度。配膠，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 2 h, 清洗，轉(zhuǎn)膜, 3%脫脂牛奶4 ℃封閉2 h, 清洗，依次加入CyclinD1(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、PI3K(1∶1 200)、p-PI3K(1∶1 000)、CD63(1∶1 200)、CD81(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000), 清洗，加入二抗，孵育2 h, 清洗，增強化學(xué)發(fā)光法曝光，采用Image J軟件分析處理，結(jié)果用目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。

1.8 實時熒光定量PCR法檢測細胞中CyclinD1、Akt、p-Akt、PI3K的mRNA表達

取處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的各組細胞，加入1 mL Trizol, 然后依次加入氯仿、異丙醇等提取RNA, 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, PCR擴增，目標(biāo)引物序列見表1。反應(yīng)體系: SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL+上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 2μL, 加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至總體積為25 μL。反應(yīng)參數(shù): 95 ℃ 預(yù)變性2 min, 然后進行循環(huán)(94 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s、68 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)), 75 ℃構(gòu)建溶解曲線。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 目標(biāo)引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 白芍總苷對細胞增殖能力的影響

培養(yǎng)0、24 h時, 4組細胞增殖抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 培養(yǎng)48、72 h時，細胞增殖抑制率由高至低排列依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。為進一步探討白芍總苷對細胞周期的影響，本研究檢測了周期蛋白CyclinD1的表達情況，結(jié)果顯示, CyclinD1蛋白表達量和CyclinD1mRNA相對表達量由低至高排列均依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A: 細胞增殖抑制率; B: CyclinD1蛋白表達量; C: CyclinD1蛋白的Western Blot結(jié)果; D: CyclinD1mRNA相對表達量。與對照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖1 各組細胞增殖抑制率、CyclinD1蛋白表達量及CyclinD1 mRNA相對表達量比較

2.2 白芍總苷對細胞遷移、侵襲能力的影響

細胞遷移實驗和侵襲實驗結(jié)果顯示，遷移細胞、侵襲細胞數(shù)量由低至高排列依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

A: 細胞遷移實驗和侵襲實驗結(jié)果; B: 各組遷移細胞數(shù)量比較; C: 各組侵襲細胞數(shù)量比較。與對照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖2 各組遷移細胞、侵襲細胞數(shù)量比較

2.3 各組細胞外泌體鑒定結(jié)果

電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，外泌體表現(xiàn)出典型的圓盤形態(tài)，見圖3。CD63、CD81蛋白表達水平由低至高排列均依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖4。

圖3 外泌體電鏡掃描結(jié)果(放大倍數(shù)20倍)

A: CD81蛋白表達量比較; B: CD63蛋白表達量比較; C: Western Blot結(jié)果。與對照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖4 各組細胞外泌體蛋白CD63、CD81表達

2.4 各組細胞中Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達量和Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K mRNA表達水平

Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達量和Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3KmRNA表達水平由低至高排列依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、圖6。

A: Western Blot結(jié)果; B: 各組p-Akt/Akt蛋白表達量比較; C: 各組p-PI3K/PI3K蛋白表達量比較。與對照組比較, *P<0.05; 與低劑量組比較, #P<0.05; 與中劑量組比較, △P<0.05。圖5 各組Akt、p-Akt、PI3K及p-PI3K蛋白表達水平

A: 各組p-Akt/Akt mRNA相對表達量比較; B: 各組p-PI3K/PI3K mRNA相對表達量比較。

3 討 論

銀屑病是皮膚科常見病，主要病理改變?yōu)榻琴|(zhì)形成細胞增殖、侵襲能力增強，凋亡抑制，同時伴隨炎性細胞、血管的異常浸潤[6]。目前，臨床治療銀屑病的多數(shù)藥物如維A 酸類藥物、甘草酸苷和甲氨蝶呤等均可抑制角質(zhì)形成細胞增殖[7]。白芍總苷是從白芍中提取的化合物，具有抗炎、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等功效，對免疫系統(tǒng)疾病、蕁麻疹及銀屑病等療效顯著[8-9], 但其治療銀屑病的確切機制目前尚不清楚。

研究[10]發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以抑制角質(zhì)形成細胞的增殖及血管內(nèi)皮生長因子的分泌。角質(zhì)形成細胞在銀屑病進展中發(fā)揮重要作用，HaCaT細胞也稱為表皮角質(zhì)形成細胞系，其是由角質(zhì)形成細胞培育而來，保留了角質(zhì)形成細胞分化能力的永生細胞。本研究觀察了白芍總苷對HaCaT細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，結(jié)果表明，白芍總苷可抑制HaCaT細胞的增殖、遷移及侵襲能力，且抑制作用隨著濃度的升高而增強。本研究還檢測了周期蛋白CyclinD1的表達水平，結(jié)果顯示，白芍總苷可抑制細胞CyclinD1蛋白、CyclinD1mRNA表達水平，且抑制作用隨著濃度的升高而逐漸增強，進一步印證了白芍總苷對HaCaT細胞增殖的抑制作用。由此推測，白芍總苷通過抑制角質(zhì)形成細胞的增殖、遷移等達到治療銀屑病的目的。

外泌體是一種杯狀、脂質(zhì)雙層的膜囊泡，也是細胞間信息交流的載體[11]。外泌體中有微小RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，這些物質(zhì)被轉(zhuǎn)運到其他細胞內(nèi)后發(fā)揮著重要的作用。本研究采用超速離心法分離出HaCaT細胞外泌體，檢測其特異性蛋白表達情況，結(jié)果顯示，白芍總苷可抑制外泌體蛋白CD63、CD81的表達，且具有劑量依賴性，說明白芍總苷能夠抑制HaCaT細胞外泌體的釋放，從而抑制細胞惡性生物學(xué)行為。

研究[12]顯示, Akt與P13K形成P13K/Akt信號通路。Akt通路的激活能夠抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Akt通路異常有關(guān)[13]。銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中, HaCaT細胞的增殖和凋亡失衡發(fā)揮重要的作用[14]。CHAMCHEU J C等[15]發(fā)現(xiàn)，在咪奎莫特誘導(dǎo)的鼠淀粉樣皮炎模型中, PI3K/Akt信號活性是增強的，且抑制PI3K/Akt信號通路可緩解咪奎莫特誘導(dǎo)的鼠淀粉樣皮損。JEON Y J等[16]報道，抑制PI3K/Akt信號通路可以緩解皮膚的炎癥反應(yīng)。王昊等[17]利用免疫組化法檢測尋常型銀屑病組織中角質(zhì)形成細胞內(nèi)PI3K、Akt蛋白表達情況，結(jié)果顯示, PI3K、Akt蛋白在尋常型銀屑病組織中高表達，與抑制凋亡蛋白Survivin表達呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示, 3種劑量白芍總苷組HaCaT細胞PI3K、Akt蛋白表達水平均低于對照組，且隨著白芍總苷濃度的升高，蛋白含量越來越低，提示白芍總苷通過PI3K/Akt信號通路抑制HaCaT細胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，白芍總苷能夠抑制HaCaT細胞分泌外泌體，并抑制HaCaT細胞增殖、侵襲及遷移，其作用機制可能與下調(diào)PI3K/Akt信號通路有關(guān)，具體的分子機制有待進一步研究。