增殖性玻璃體視網(wǎng)膜疾病的細(xì)胞機(jī)制及其動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

龔學(xué)春, 武志峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二人民醫(yī)院 眼科, 江蘇 無錫, 214000)

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜疾病(PVR)是指孔源性視網(wǎng)膜脫離(RRD)及其術(shù)后眼內(nèi)細(xì)胞在視網(wǎng)膜和玻璃體廣泛增殖形成纖維增殖膜，隨后纖維增殖膜收縮、牽拉視網(wǎng)膜的一種病變[1]。RRD患者并發(fā)PVR的概率為5%～10%，主要發(fā)生在RRD術(shù)后，是RRD手術(shù)失敗最常見的原因之一[2]。合并PVR的RRD患者術(shù)后視力和視網(wǎng)膜解剖復(fù)位率都較差，其需要的社會(huì)醫(yī)療資源是無PVR的RRD患者的2倍[3]。手術(shù)是PVR目前最主要的治療手段，然而手術(shù)無法預(yù)防和阻止眼內(nèi)細(xì)胞的活化及過度增殖。本文對PVR形成過程中各種視網(wǎng)膜細(xì)胞作用機(jī)制及其動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，為探索不同治療方法提供依據(jù)。

1 視網(wǎng)膜細(xì)胞與PVR

PVR是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅涉及缺血性組織損傷，還涉及局部炎癥以及細(xì)胞的增殖[4]。PVR形成的基本步驟是視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞遷移到視網(wǎng)膜表面和玻璃體內(nèi)，隨后增殖形成纖維膜，收縮的纖維膜最終牽拉視網(wǎng)膜，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。在這個(gè)過程中，細(xì)胞增殖被認(rèn)為是必不可少的[1]。有研究對PVR形成的纖維膜進(jìn)行免疫組化，證明纖維膜主要由多種細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中細(xì)胞主要包括: RPE細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞(主要是Müller細(xì)胞)、炎癥細(xì)胞(主要為巨噬細(xì)胞)、成纖維/肌成纖維細(xì)胞等。在上述這些細(xì)胞中, RPE細(xì)胞在纖維膜細(xì)胞成分中所占比例最多，被認(rèn)為在PVR發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[5]。

1.1 RPE細(xì)胞與PVR

RPE細(xì)胞在生理?xiàng)l件下保持著細(xì)胞-細(xì)胞間接觸，維持極化的上皮表型，是非增殖的，處于有絲分裂的靜止?fàn)顟B(tài)。然而，當(dāng)視網(wǎng)膜破裂或受到創(chuàng)傷時(shí), RPE細(xì)胞間連接復(fù)合體破壞, RPE細(xì)胞暴露在由激活的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的各種生長因子和炎癥因子中被活化[6]。隨后，活化的RPE細(xì)胞從Bruch膜分離，通過視網(wǎng)膜缺損遷移、增殖，最終參與形成纖維膜。在此過程中, RPE細(xì)胞經(jīng)歷了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT), 這是分離的極化細(xì)胞失去上皮特性的一種生物學(xué)過程，在PVR的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[7]。在EMT過程中, RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，其主要特征是活力增強(qiáng)及增殖、抗凋亡和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的能力增強(qiáng)，從而參與PVR纖維膜的形成，形成牽引力，是纖維膜牽引力構(gòu)成的最主要成分。

目前對于PVR的研究主要集中于阻止RPE細(xì)胞的EMT, 研究[8-10]發(fā)現(xiàn)阻止RPE細(xì)胞的EMT進(jìn)程往往能夠延緩甚至阻止實(shí)驗(yàn)性PVR的進(jìn)程。LYU Y L等[8]研究發(fā)現(xiàn), PKA通路激活參與了PVR的發(fā)病過程，而PKA抑制劑H89可以在體外抑制RPE細(xì)胞的EMT進(jìn)程，也能抑制PVR大鼠的病情進(jìn)展。CUI L等[10]也發(fā)現(xiàn)微小RNA-194(miR-194)通過功能靶向ZEB1抑制RPE細(xì)胞EMT進(jìn)程，從而抑制PVR大鼠的病情進(jìn)展。CHEN X Y等[5]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素(IL)-6可以通過JAK1/STAT3通路誘導(dǎo)RPE細(xì)胞EMT，而阻斷此途徑可以阻止細(xì)胞EMT, 也可延緩小鼠PVR進(jìn)程。MA X Q等[9]發(fā)現(xiàn)MettL3基因過表達(dá)可以通過Wnt/β-catenin通路減弱RPE細(xì)胞的EMT, 也可抑制大鼠的PVR進(jìn)程。上述研究說明在PVR過程中RPE細(xì)胞起著關(guān)鍵性的作用。

1.2 Müller細(xì)胞與PVR

Müller細(xì)胞的表現(xiàn)更像是一把雙刃劍，一方面，在RRD中，脫離的視網(wǎng)膜缺血會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，而在損傷早期, Müller細(xì)胞的膠質(zhì)增生對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，這種保護(hù)作用涉及許多不同的機(jī)制，包括緩沖升高的鉀水平、抗氧化劑的釋放、過量谷氨酸的攝取以及神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子等的產(chǎn)生[11-14]。另一方面，當(dāng)視網(wǎng)膜脫離時(shí), Müller細(xì)胞會(huì)被激活，并被誘導(dǎo)遷移、增殖, Müller細(xì)胞增殖在脫離后3～4 d達(dá)到高峰，并可能以較慢的速度持續(xù)數(shù)周至數(shù)月。在此期間, Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜表面，在視網(wǎng)膜下及視網(wǎng)膜內(nèi)增殖、遷移，并且可以轉(zhuǎn)化為具有成纖維/肌成纖維細(xì)胞表型的膠質(zhì)細(xì)胞，參與PVR纖維膜的形成，是牽引力產(chǎn)生的組成成分之一[15-16]。隨著時(shí)間進(jìn)展，在中晚期PVR, 特別是在一些視網(wǎng)膜下和視網(wǎng)膜內(nèi)PVR中, Müller細(xì)胞的肥大和膠質(zhì)增生，逐漸占據(jù)了原本視網(wǎng)膜神經(jīng)元的位置，導(dǎo)致了視網(wǎng)膜縮短和變形，加大了手術(shù)難度[4, 17-18]。

同時(shí)，Müller細(xì)胞分泌了大量的生長因子和炎癥因子，如G-CSF、MCP-1、PDGF-BB、VEGF和TGFβ等[19], 這些因子既刺激RPE細(xì)胞和Müller細(xì)胞的遷移和增殖，也刺激這些細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，還能刺激肌成纖維細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，從而增強(qiáng)PVR纖維膜產(chǎn)生的牽引力[15]。但Müller細(xì)胞在PVR纖維膜牽引力的產(chǎn)生中更趨向于輔助的作用, PETERS M A等[20]發(fā)現(xiàn)，往玻璃體內(nèi)注射不同數(shù)量的Müller細(xì)胞，在7 d時(shí)眼內(nèi)形成的增殖膜纖維收縮反應(yīng)的嚴(yán)重程度與注射的細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，但在接下來的3周內(nèi)幾乎沒有觀察到這一過程的進(jìn)展。相反，將Müller細(xì)胞和RPE以不同的比例注射，可以產(chǎn)生更強(qiáng)且是漸進(jìn)性的纖維收縮反應(yīng)。

1.3 成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞與PVR

成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是PVR纖維膜中主要的收縮細(xì)胞表型，并在PVR的收縮期發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。研究[16]表明, PVR纖維膜中的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞大多來自RPE細(xì)胞和Müller細(xì)胞(主要是RPE細(xì)胞)。肌成纖維細(xì)胞可以看作是“被激活”的成纖維細(xì)胞，具有與平滑肌細(xì)胞相似的超微結(jié)構(gòu)和生理特征，胞質(zhì)內(nèi)突出的肌成纖維細(xì)胞微絲束形成應(yīng)力纖維，可以使細(xì)胞收縮[21]。而且肌成纖維細(xì)胞在各種生長因子、炎癥因子的刺激下，可以迅速合成和積累過多的細(xì)胞外基質(zhì)(主要包括膠原及纖連蛋白)[22]。肌成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間形成特殊連接復(fù)合體，同時(shí)也與其他細(xì)胞間形成纖維連接，收縮并重塑細(xì)胞外基質(zhì)，在組織中傳遞機(jī)械力，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)扭曲和隨后的瘢痕形成[21-23]。

1.4 炎性細(xì)胞與PVR

在視網(wǎng)膜脫離發(fā)生后幾小時(shí)內(nèi)，血-視網(wǎng)膜屏障被破壞，中性粒細(xì)胞開始局部浸潤，隨后局部浸潤的中性粒細(xì)胞開始釋放一些生長因子及炎癥因子[4], 如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，進(jìn)一步刺激了單核細(xì)胞的聚集及其向巨噬細(xì)胞的分化。分化的巨噬細(xì)胞開始吞噬受損的組織和細(xì)胞，并釋放致炎因子，進(jìn)而刺激成纖維/肌成纖維細(xì)胞的增殖、遷移[24]。MARTN F等[25]比較了合并PVR的RRD患者和單純RRD患者玻璃體，最終證明，在RRD術(shù)后1個(gè)月內(nèi)，合并PVR的RRD患者的玻璃體內(nèi)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增多，即玻璃體中巨噬細(xì)胞的存在與PVR的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。由此對以上細(xì)胞參與PVR形成機(jī)制進(jìn)行假設(shè)。首先，在RRD發(fā)生時(shí)，局部的缺血、炎癥導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障破壞，炎性細(xì)胞局部浸潤，釋放炎癥因子及生長因子，進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集并向巨噬細(xì)胞分化。巨噬細(xì)胞吞噬損傷的細(xì)胞和組織，并釋放致炎因子。與此同時(shí)，Müller細(xì)胞在損傷早期被激活，細(xì)胞肥大、增生，隨著時(shí)間的推移，肥大、膠質(zhì)增生的Müller細(xì)胞逐漸占據(jù)了原先視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的位置，導(dǎo)致視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜皺縮、變形。同時(shí)，活化的Müller細(xì)胞也釋放出大量的生長因子和炎癥因子，導(dǎo)致玻璃體內(nèi)含有大量成分復(fù)雜的細(xì)胞因子。RPE細(xì)胞、Müller細(xì)胞接觸到了含有大量細(xì)胞因子的玻璃體液，在這些因子的作用下開始去極化、增殖、遷移并轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞(主要源于RPE細(xì)胞)，甚至進(jìn)一步被激活為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞又迅速合成和積累大量的膠原及纖連蛋白，這些細(xì)胞外基質(zhì)與肌成纖維細(xì)胞形成特殊復(fù)合體，收縮并傳導(dǎo)機(jī)械力，形成對組織的牽拉，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的破壞和扭曲。

玻切或外傷后PVR的形成更可能是因?yàn)槭中g(shù)或外傷加重了血視網(wǎng)膜屏障的破壞，從而加重了炎癥等一系列反應(yīng)，最終引起PVR。

2 PVR動(dòng)物模型

由于PVR的主要病理變化是細(xì)胞過度增生，因而動(dòng)物模型多以細(xì)胞增生模型為主，輔以其他手段。目前關(guān)于PVR模型的構(gòu)建方法多種多樣，主要分為以下幾類: 玻璃體腔內(nèi)注入各種細(xì)胞，包括RPE細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等; 玻璃體腔注入各種生長因子，如PDGF、TGF-β等; 玻璃體腔內(nèi)注入血液或血液制品，如富含血小板的血漿(PRP); 手術(shù)、外傷誘導(dǎo)。成模過程中，往往采用玻璃體腔內(nèi)注入細(xì)胞，加上另外1種或2種方法相結(jié)合。此外，還有如在玻璃體腔內(nèi)注入分散酶等方法。以下介紹幾種主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的PVR模型的發(fā)展。

2.1 兔

兔因其性格溫順、眼球較大而晶狀體相對較小以及便于操作觀察等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用于PVR模型構(gòu)建的動(dòng)物。1975年的研究發(fā)現(xiàn)，往兔玻璃體腔內(nèi)注入自體真皮成纖維細(xì)胞可以引起纖維增生并牽拉視網(wǎng)膜 。但該研究注入細(xì)胞為自體真皮成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞與PVR形成過程無關(guān)。相關(guān)研究往兔玻璃體腔內(nèi)注入了RPE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的纖維膜與注入成纖維細(xì)胞模型的相似，之后將同種成纖維細(xì)胞注入了進(jìn)行玻璃體切割術(shù)后的兔子玻璃體腔內(nèi)，造模成功率達(dá)到了100%。但在兔眼內(nèi)行玻切手術(shù)較為復(fù)雜，相關(guān)研究對上述模型進(jìn)行了改良，提出用氣體壓縮形成類似玻璃體切除的效果，隨后注入成纖維細(xì)胞，也可形成類似PVR的效果。之后有研究[26]嘗試在兔玻璃體腔內(nèi)注入活化巨噬細(xì)胞，也形成了纖維膜增殖并牽拉視網(wǎng)膜的效果。

隨著對PVR認(rèn)識的逐步加深，依次有人提出了在兔玻璃體腔內(nèi)注射人類RPE細(xì)胞[27], 玻璃體腔內(nèi)注射分散酶(dispase酶)[28]、氣體壓縮和注射RPE細(xì)胞[29]、注射RPE細(xì)胞和CTGF[30]及注射RPE細(xì)胞和PDGF[31]等方法，這些方法都取得成功。目前，比較常用的方法是兔玻璃體腔內(nèi)注射RPE細(xì)胞和PDGF[32-33]，該方法具有操作簡單、成功率高、成模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。然而上述方法的PVR模型形成迅速，與臨床PVR的長期過程也存在一定的差異。HIROSE F等[34]將bFGF和IFNβ制成一種明膠微球緩釋系統(tǒng)，成功設(shè)計(jì)了一種長期、慢性、穩(wěn)定的PVR動(dòng)物模型。MOON S W等[35]利用基質(zhì)膠及VEGF視網(wǎng)膜下注射也形成了一種慢性PVR模型。隨著對PVR認(rèn)識的加深，動(dòng)物模型也在不斷發(fā)展，也越來越接近人PVR的發(fā)展過程。

2.2 大鼠和小鼠

鼠類具有管理方便、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，然而鼠類眼球小、晶狀體呈球形及操作不方便且不利于觀察，故鼠類模型相較于兔模型較少。

目前的大鼠模型有以下幾種: 視網(wǎng)膜下注射分散酶(dispase酶)[36]; 玻璃體腔注射RPE細(xì)胞和TGF-β1[37]; 玻璃體腔內(nèi)注射刀豆蛋白A或分散酶(dispase酶)[38-39]; 玻璃體內(nèi)注射巨噬細(xì)胞[40]; 玻璃體腔內(nèi)先注射透明質(zhì)酸酶，液化玻璃體后，再注射RPE細(xì)胞及PRP[8, 10], 此模型也是目前最常用的大鼠模型。

小鼠既往最常用的PVR模型為在玻璃體腔內(nèi)注入dispase酶，該方法最早在2002年建立，并一直沿用至今[41]。然而該方法視網(wǎng)膜的完整性會(huì)受到嚴(yán)重影響，dispase酶會(huì)破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生明顯的出血，并不能完全模仿人類PVR的發(fā)病進(jìn)展。HEFFER A 等[42]在2020年仿照兔PVR模型成功構(gòu)建了一種新的小鼠PVR模型: 先在玻璃體腔內(nèi)注射氣體促進(jìn)玻璃體后脫離，隨后注入RPE細(xì)胞，該模型也更加接近人類PVR的發(fā)病進(jìn)展[43]。然而小鼠眼球小，該方法操作難度較大。

2.3 其他動(dòng)物

豬、除人以外的靈長類動(dòng)物的模型相對較少。其中，豬因其眼球大小與人類相似，手術(shù)操作方便等優(yōu)點(diǎn)而備受某些研究者的青睞，然而飼養(yǎng)場地限制、價(jià)格高等因素還是制約了豬PVR模型的使用。目前，主要的豬PVR模型于2012年由UMAZUME K等[44]構(gòu)建: 首先對豬眼行玻璃體切割手術(shù)，形成玻璃體后脫離，隨后在該眼的視網(wǎng)膜下注射平衡鹽溶液形成視網(wǎng)膜脫離，最后向玻璃體腔注入RPE細(xì)胞成模，目前使用最多的豬PVR模型也是這種[45]。WONG C W等[46]在比較內(nèi)源性和外源性RPE細(xì)胞形成的PVR模型時(shí)，對此模型做了一些改良，在操作最后向玻璃體腔內(nèi)注入了RPE細(xì)胞和PRP, 而非單純注入RPE細(xì)胞。

3 總結(jié)與展望

PVR是RRD及其術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響手術(shù)的成功率和患者視力。PVR的發(fā)病機(jī)制主要涉及各種視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖，目前手術(shù)是PVR治療的主要方法，相關(guān)研究仍在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒粩鄬ふ夷軌蝾A(yù)防甚至阻止RRD術(shù)后PVR發(fā)展的輔助治療方法，將來的治療手段很可能為聯(lián)合使用藥物抑制眼內(nèi)細(xì)胞增殖。本文有助于深刻認(rèn)識PVR, 并為探究PVR治療方法提供依據(jù)。