異源表達(dá)菊芋HtHCT基因?qū)κ荏w植物木質(zhì)素相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響

張新業(yè)，蘇彥蘋，朱 姝，王聰艷,2，侯曉強(qiáng)，李文靜

(1. 廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,河北廊坊 065000; 2. 河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北廊坊 065000; 3. 廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北廊坊 065000)

木質(zhì)素是植物體內(nèi)重要的大分子高聚物，含量?jī)H次于纖維素，是維管植物細(xì)胞壁的重要成分。木質(zhì)素是植物由水生向陸生進(jìn)化的重要標(biāo)志，在支撐植物體，保持細(xì)胞內(nèi)的水分，長(zhǎng)距離運(yùn)輸水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及抵御干旱、病原微生物等方面具有重要的生物學(xué)功能[1-4]。然而，木質(zhì)素的存在卻不利于植物資源的利用。在造紙工業(yè)中，紙漿內(nèi)木質(zhì)素的去除，不僅高能耗、高成本，而且污染環(huán)境。木質(zhì)素含量過高還會(huì)影響牲畜對(duì)飼草植物的消化及木質(zhì)纖維生產(chǎn)燃料乙醇的效率。因此，植物資源木質(zhì)素含量的改良越來越受到重視[3,5]。

木質(zhì)素通常由3種木質(zhì)素單體—對(duì)羥基苯基木質(zhì)素(H型木質(zhì)素)、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G型木質(zhì)素)和紫丁香基木質(zhì)素(S型木質(zhì)素)氧化聚合而成[6]。羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)是一種?；D(zhuǎn)移酶，其以香豆酰輔酶A(p-coumaroyl CoA)為底物，將苯丙烷代謝引入木質(zhì)素單體的合成[7]。到目前為止，已有多個(gè)物種內(nèi)的HCT基因被鑒定，HCT基因在植物體內(nèi)多以基因家族的形式出現(xiàn)，其蛋白結(jié)構(gòu)中通常含有保守基序HXXXD和DFGWG[4,8-10]。由于物種的不同，HCT基因家族成員數(shù)目會(huì)有所差異。如Ma等[9]從蘋果(Malus×domestica)、桃(Prunuspersica)、草莓(Fragariavesca)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和梨(Pyrusbretschneideri)基因組中分別鑒定到90、60、72、50和82個(gè)HCT基因。茄科植物的HCT基因數(shù)目較少，煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)和辣椒(Capsicumannuum)中分別存在4、2和6個(gè)HCT基因[4]。最近，Chao等[11]從毛果楊(Populustrichocarpa)中鑒定到10個(gè)HCT基因家族成員。功能研究表明，HCT基因能夠參與并調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成，其下調(diào)表達(dá)能夠顯著降低木質(zhì)素含量并改變木質(zhì)素單體的組成[9]。

菊芋(Helianthustuberosus)是菊科、向日葵屬的一種多年生草本植物，又名洋姜、鬼子姜。菊芋抗鹽堿、抗旱、抗寒能力較強(qiáng)，且具有較好的防風(fēng)固沙作用[12]。目前關(guān)于菊芋的研究主要集中在種質(zhì)資源收集評(píng)價(jià)、生物能源開發(fā)、飼草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、抗逆生理及糖類代謝等方面[13-14]，而關(guān)于菊芋木質(zhì)素代謝相關(guān)基因的研究鮮見報(bào)道。此外，菊芋中木質(zhì)素含量較高，亦不利于其在造紙、飼料及生物能源等領(lǐng)域的應(yīng)用[15-17]。廊坊師范學(xué)院植物分子遺傳學(xué)研究室前期從菊芋品種‘廊芋8號(hào)’中克隆了HCT基因—HtHCT，其開放閱讀框(open reading frame,ORF)長(zhǎng) 1 293 bp，編碼430個(gè)氨基酸，HtHCT在菊芋莖中的表達(dá)量顯著高于其他被測(cè)組織，且能響應(yīng)干旱、鹽脅迫處理[18]。本試驗(yàn)構(gòu)建HtHCT基因的植物表達(dá)載體，并對(duì)擬南芥和本氏煙(Nicotianabenthamiana)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，初步研究其對(duì)木質(zhì)素及類黃酮合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥(Col)種子經(jīng)5%的次氯酸鈉溶液消毒后，接種到MS培養(yǎng)基上，4 ℃春化48 h，置于人工氣候室中(22 ℃、光照16 h/黑暗8 h、光照強(qiáng)度80 μmol·m-2·s-1)萌發(fā)生長(zhǎng)。選取萌發(fā)后7～10 d的健壯幼苗，移栽到營(yíng)養(yǎng)土中 [V(泥炭)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=2∶7∶1]，繼續(xù)培養(yǎng)，條件同上。

本氏煙種子經(jīng)5%的次氯酸鈉溶液消毒后，接種到MS培養(yǎng)基上，置于人工氣候室中(23 ℃、光照16 h/黑暗8 h、光照強(qiáng)度70 μmol·m-2·s-1)萌發(fā)生長(zhǎng)，待長(zhǎng)出2～3片葉后，將幼苗移至培養(yǎng)瓶中，并在同一條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

含HtHCT基因CDS序列的原核表達(dá)載體pET-28a-cHtHCT及植物表達(dá)載體pCAMBIA1390(含CaMV 35S啟動(dòng)子、卡那霉素抗性、潮霉素篩選標(biāo)記)均由廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以原核表達(dá)載體pET-28a-cHtHCT為模板，利用含有酶切位點(diǎn)PstⅠ、EcoRⅠ的引物對(duì)HCT4F/HCT4R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用限制性內(nèi)切酶[寶生物工程(大連)有限公司]對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pCAMBIA1390分別進(jìn)行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京莊盟科技有限公司)回收純化目的基因片段和pCAMBIA1390載體骨架，二者經(jīng)Ligation high(日本TOYOBO公司)連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans 10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切鑒定后送出測(cè)序，獲得重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-HtHCT。

1.3 植物遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

將植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-HtHCT導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受態(tài)細(xì)胞GV3101中，經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽(yáng)性克隆用于遺傳轉(zhuǎn)化。利用蘸花法[19]轉(zhuǎn)化擬南芥(Col)，收獲T0代種子。T0代種子經(jīng)消毒后，點(diǎn)播到1/2MS培養(yǎng)基上(含30 μg·mL-1潮霉素)，進(jìn)行抗性篩選，提取抗性苗基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，得到的陽(yáng)性苗進(jìn)一步提取RNA，并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(表1)，收獲T1代陽(yáng)性植株的種子。T1代種子繼續(xù)使用潮霉素抗性平板篩選，抗性苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，利用PCR進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，獲得T2代陽(yáng)性植株，長(zhǎng)至開花期后，將T2代陽(yáng)性植株按T1代來源混收莖稈，用于生理生化指標(biāo)測(cè)定。

用手術(shù)刀將生長(zhǎng)至4～5周的本氏煙無(wú)菌苗葉片切成小塊，利用葉盤法[20]進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，提取T0代植株DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得的陽(yáng)性苗進(jìn)一步利用RT-PCR鑒定(表1)，陽(yáng)性植株自交收種。將T0代種子按株系點(diǎn)播于營(yíng)養(yǎng)土中，長(zhǎng)至3～4葉時(shí)，提取葉片DNA，進(jìn)行PCR鑒定，剔除陰性苗，保留T1代陽(yáng)性植株，將生長(zhǎng)約7～8周的T1代陽(yáng)性植株按T0代來源混收莖稈，用于生理生化指標(biāo)測(cè)定。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.4 轉(zhuǎn)基因植株生理生化指標(biāo)測(cè)定

將上述混收的植物材料105 ℃殺青15 min，70 ℃烘干至恒量，粉碎后過80目篩，用于以下性狀的測(cè)定(江蘇三黍生物科技有限公司)。

1.4.1 總木質(zhì)素含量測(cè)定 采用乙酰溴法[23]測(cè)定總木質(zhì)素含量。稱取50 mg樣品，加入1 mL 70 %的乙醇，10 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；加入1 mL氯仿/甲醇(1∶1)溶液重懸沉淀，離心后棄上清液；加入1 mL丙酮混勻，干燥后再加入1.5 mL 0.1 mol·L-1pH 5.0的醋酸鈉緩沖液，80 ℃加熱20 min；加入10 μL 0.01 %的疊氮化鈉、10 μL 0.1 mg·mL-1淀粉酶和10 μL 1.10～1.30 g·mL-1普魯蘭酶，37 ℃過夜；加熱至100 ℃終止反應(yīng)，離心棄上清液，加水清洗沉淀；加入1 mL丙酮，混勻并干燥丙酮。稱取約1 mg上述沉淀，加入100 μL乙酰溴(25%)溶液，50 ℃加熱3 h；然后加入400 μL 2 mol·L-1氫氧化鈉和70 μL 0.5 mol·L-1鹽酸羥胺，混勻后，用乙酸定容至2 mL，取200 μL于280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。總木質(zhì)素含量計(jì)算公式為：總木質(zhì)素含量(μg·mg-1)=[ΔOD280/(C×L)]×(V/m)×100%×10，其中C為吸光系數(shù)15.69，L為光程0.539 cm，V為反應(yīng)體積2 mL，m為樣品質(zhì)量。

1.4.2 木質(zhì)素單體含量測(cè)定 稱取10 mg樣品，加入500 μL硫解液(2.5%三氟化硼、10%乙硫醇、87.5%二氧六環(huán))；100 ℃加熱4 h；加入300 μL 0.4 mol·L-1碳酸氫鈉，混勻后加入0.2 mL水和0.3 mL乙酸乙酯；14 000 r·min-1離心10 min，取上清液；干燥后加入150 μL吡啶(含內(nèi)標(biāo)反式肉桂酸)和50 μL三甲基硅烷，60 ℃反應(yīng)1 h后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液利用Agilent7820A-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀[24]進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 總黃酮含量測(cè)定 采用亞硝酸鈉-氯化鋁法測(cè)定總黃酮含量[25]。稱取50 mg樣品于2 mL離心管中，加入1 mL甲醇，60 ℃抽提4 h。取50 μL提取物，加入950 μL甲醇和4 mL水，再加入300 μL 5%亞硝酸鈉溶液，室溫靜置5 min。加入300 μL 10%氯化鋁溶液，靜置6 min。加入2 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉，最后定容到10 mL，靜置15 min。于510 nm處測(cè)定吸光值。類黃酮含量測(cè)定公式：類黃酮含量=C×V/M，其中C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的結(jié)果，V為提取液總體積，M為樣品質(zhì)量。

以蘆丁為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取蘆丁 1 mg，加入甲醇配制成濃度為0.1 mg·mL-1、 0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建

以引物對(duì)HCT4F/HCT4R擴(kuò)增質(zhì)粒pET-28a-cHtHCT，得到長(zhǎng)約1 300 bp的HtHCT基因片段，經(jīng)PstⅠ、EcoRⅠ雙酶切后連入經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的pCAMBIA1390，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后得到長(zhǎng)度一致的目的基因片段(圖1)，酶切鑒定無(wú)誤后送公司測(cè)序，從而獲得重組表達(dá)載體pCAMBIA1390-HtHCT。

A. HtHCT基因片段的PCR擴(kuò)增; M.DL2000; 1～2. HtHCT基因片段; B. 植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-HtHCT構(gòu)建示意圖; C. 植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-HtHCT的雙酶切鑒定; M. DL5000; 1. pCAMBIA1390-HtHCT; 2. PstⅠ/EcoRⅠ的雙酶切產(chǎn)物

2.2 植物遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

分別利用蘸花法和葉盤法對(duì)擬南芥和本氏煙進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得轉(zhuǎn)基因材料(圖2)。以重組質(zhì)粒pCAMBIA1390-HtHCT和野生型材料分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，利用引物對(duì)HCT4F/HCT4R對(duì)擬南芥T1代抗性植株和本氏煙T0代抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性植株均擴(kuò)增出長(zhǎng)約1 300 bp的目的片段，說明HtHCT基因已整合到受體材料的基因組中，而陰性對(duì)照和未轉(zhuǎn)化成功的材料則沒有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3-A、C)。

A～E. 擬南芥轉(zhuǎn)化流程; A. 種子萌發(fā); B. 幼苗移栽; C. 花序侵染; D. 轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育; E. 種子采集; F～J. 本氏煙轉(zhuǎn)化流程; F. 侵染后共培養(yǎng); G. 愈傷誘導(dǎo); H. 愈傷篩選及幼苗分化; I. 幼苗生根; J. 幼苗移栽

分別以擬南芥Actin基因和本氏煙60Sribosomalprotein基因作為內(nèi)參，利用引物對(duì)AtActin2sqF/AtActin2sqR和NbL23qF/NbL23qR對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥和T0代轉(zhuǎn)基因本氏煙進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，野生型擬南芥和本氏煙中均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，而經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的植株均擴(kuò)增出特異性片段，說明HtHCT基因已成功轉(zhuǎn)錄(圖3-B、D)。

A. T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè); M. DL2000; 1. 重組質(zhì)粒pCAMBIA1390-HtHCT; 2. 野生型; 3～8. 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株; B. T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的RT-PCR檢測(cè); W. 野生型; 4,5,8. 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株; C. T0代轉(zhuǎn)基因本氏煙的PCR檢測(cè); M. DL2000; 1. 重組質(zhì)粒pCAMBIA1390-HtHCT; 2. 野生型; 3～9. 轉(zhuǎn)基因本氏煙植株; D. T0代轉(zhuǎn)基因本氏煙的RT-PCR檢測(cè); W. 野生型; 3,7,8,9. 轉(zhuǎn)基因本氏煙植株

2.3 轉(zhuǎn)基因材料生理生化指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 轉(zhuǎn)基因材料總木質(zhì)素含量測(cè)定 將載體pCAMBIA1390-HtHCT轉(zhuǎn)入擬南芥和本氏煙中，分別測(cè)定野生型和轉(zhuǎn)基因株系的總木質(zhì)素 含量。

在擬南芥中，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)tL4和AtL5的總木質(zhì)素含量高于野生型，其中株系A(chǔ)tL5與野生型之間差異極顯著。而轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)tL8的總木質(zhì)素含量則極顯著低于野生型。在本氏煙中，轉(zhuǎn)基因株系NbL3和NbL7的總木質(zhì)素含量極顯著地高于野生型，株系NbL9的含量則低于野生型(表2)。以上結(jié)果表明，HtHCT基因能夠影響木質(zhì)素的合成。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因材料木質(zhì)素單體含量測(cè)定 木質(zhì)素單體含量的測(cè)定結(jié)果表明，擬南芥和本氏煙中的木質(zhì)素單體均以G型木質(zhì)素和S型木質(zhì)素為主，而H型木質(zhì)素含量最低。在擬南芥中，HtHCT基因的導(dǎo)入對(duì)G型木質(zhì)素含量的影響最大，S型木質(zhì)素次之，而對(duì)H型木質(zhì)素含量的影響最小。在本氏煙中，僅有轉(zhuǎn)基因株系NbL7的木質(zhì)素單體組成與野生型之間存在顯著差異，表明HtHCT基因?qū)Ρ臼蠠熌举|(zhì)素單體構(gòu)成的影響較小。無(wú)論在擬南芥還是本氏煙中，G型木質(zhì)素的含量一般與S型木質(zhì)素的含量呈負(fù)相關(guān)，而H型木質(zhì)素含量變化規(guī)律不明顯(表2)。

2.3.3 轉(zhuǎn)基因材料的類黃酮含量測(cè)定 鑒于HCT與查爾酮合成酶均可以香豆酰輔酶A為底物，并分別將苯丙烷代謝引入木質(zhì)素單體合成及類黃酮合成途徑[6]。因此，本研究也測(cè)定了轉(zhuǎn)基因材料的類黃酮含量。

以吸光度值為橫坐標(biāo)，不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=31.625x-1.330 2(R2=0.996 6)。據(jù)此，對(duì)類黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，擬南芥轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)tL4和AtL8的類黃酮含量均極顯著地低于野生型，本氏煙中亦有2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(NbL3、NbL9)的類黃酮含量顯著或極顯著低于野生型含量(表2)。

表2 轉(zhuǎn)基因植株生理生化指標(biāo)測(cè)定Table 2 Determination of physiological and biochemical indicators of transgenic plants

3 討 論

木質(zhì)素是重要的植物代謝產(chǎn)物，通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段調(diào)節(jié)植物木質(zhì)素代謝已成為研究熱點(diǎn)，這不僅有利于抗倒伏植物新品種的培育，而且有利于植物資源在造紙、生物能源等方面的應(yīng)用。

HCT是將苯丙烷代謝產(chǎn)物香豆酰輔酶A引入木質(zhì)素單體合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在木質(zhì)素合成過程中具有重要作用[26]。HCT基因表達(dá)量的變化對(duì)植物木質(zhì)素的含量及組成具有重要影響。擬南芥HCT基因沉默后，葉片顏色加深，S型木質(zhì)素含量降低，植株生長(zhǎng)受抑制，部分材料出現(xiàn)不育現(xiàn)象，但類黃酮含量增加。本氏煙HCT基因沉默后，木質(zhì)素含量降低，木質(zhì)素組成亦發(fā)生改變(S型木質(zhì)素減少，H型木質(zhì)素增多)，其部分植株矮化[7,27]。紫花苜蓿(Medicagosativa)HCT基因的下調(diào)表達(dá)，會(huì)顯著降低木質(zhì)素含量并改變其組成，但卻提高了類黃酮含量、紫花苜蓿消化率及其對(duì)逆境脅迫的抗性[28-29]。為解析菊芋HtHCT基因的功能，本研究構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-HtHCT，并分別轉(zhuǎn)化了擬南芥和本氏煙草。與野生型擬南芥相比，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的總木質(zhì)素含量表現(xiàn)不一，其中兩個(gè)株系含量升高，而AtL8卻顯著降低。本氏煙草中亦有兩個(gè)株系含量增加，一個(gè)株系(NbL9)含量降低。說明HtHCT基因的導(dǎo)入能夠影響受體木質(zhì)素代謝，與前人研究結(jié)果[27-28,30]一致。與野生型相比，擬南芥轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)tL8和煙草轉(zhuǎn)基因株系NbL9的木質(zhì)素含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是外源HtHCT基因的表達(dá)抑制了擬南芥和本氏煙中自身HCT基因的表達(dá)而出現(xiàn)了共抑制現(xiàn)象[31]，與韓伯濤等[32]的研究結(jié)果相近。從木質(zhì)素組成看，轉(zhuǎn)入HtHCT基因后，擬南芥和本氏煙的木質(zhì)素組成均發(fā)生了不同程度的改變，且G型和S型木質(zhì)素含量之間存在此消彼長(zhǎng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而H型木質(zhì)素含量變化規(guī)律不明顯。HCT基因通常以基因家族的形式存在于植物基因組中，且不同物種間HCT基因家族成員的數(shù)目亦有不同[9]。本試驗(yàn)在前期同源克隆‘廊芋8號(hào)’HtHCT基因的基礎(chǔ)上，對(duì)該基因進(jìn)行初步功能研究。由于菊芋是向日葵屬六倍體物種(2n=6x=102)，其基因組大小及全基因組序列均未知[33]，對(duì)全基因鑒定和分析菊芋HCT基因造成了極大困難，并導(dǎo)致有關(guān)菊芋HCT基因數(shù)目、結(jié)構(gòu)、染色體分布及表達(dá)特性的信息十分匱乏。因此，在以后的研究中，可以借助轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其他已公布基因組序列的向日葵屬物種信息來挖掘更多的菊芋HCT基因，并結(jié)合基因表達(dá)分析和HCT酶活分析，篩選在木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮主要作用的HCT基因[9]用于菊芋木質(zhì)素含量的遺傳改良。查爾酮合成酶也可以香豆酰輔酶A作為底物，從而將苯丙烷代謝引向類黃酮物質(zhì)的合成，因此其與HCT間可能存在一定的底物競(jìng)爭(zhēng)，故本研究也測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植物中的類黃酮含量。除本氏煙轉(zhuǎn)基因株系NbL7外，在其余的擬南芥和本氏煙轉(zhuǎn)基因材料中，類黃酮含量較野生型材料均發(fā)生不同程度的下降，這與Besseau等[7]在HCT基因發(fā)生沉默的擬南芥株系中測(cè)得較高的類黃酮含量結(jié)果相近。木質(zhì)素合成過程復(fù)雜，受多種酶的調(diào)控及時(shí)間、空間和外界環(huán)境的影響[34]，而相較于單個(gè)酶基因的調(diào)節(jié)，同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因?qū)δ举|(zhì)素的改良效果更明顯[35]。此外，植物木質(zhì)素含量的調(diào)節(jié)應(yīng)在一定的范圍內(nèi)，既要保證植物的正常生長(zhǎng)，還要兼顧實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)木質(zhì)素含量和組成的要求[36]。

本研究在擬南芥和本氏煙中異源表達(dá)菊芋HtHCT基因，初步探明了該基因在木質(zhì)素合成過程中的作用。在后續(xù)的研究中，筆者將繼續(xù)挖掘菊芋木質(zhì)素代謝相關(guān)基因，建立和完善菊芋的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為菊芋木質(zhì)素含量的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。