枯草芽孢桿菌DNKAS對(duì)分枝列當(dāng)?shù)姆佬?、安全性及作用機(jī)理

崔華星，許俊鋒，崔衛(wèi)東，包慧芳，詹發(fā)強(qiáng)，韋龍石，龍宣杞，楊 蓉，史應(yīng)武,王 寧

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

列當(dāng)是列當(dāng)科(Orobanchaceae) 列當(dāng)屬(OrobancheL.) 多年生、兩年生或一年生肉質(zhì)寄生草本。以吸根寄生在茄科、豆科、亞麻科、傘形科、十字花科等根上，吸收寄主養(yǎng)分、生長(zhǎng)激素和水分以維持自身生長(zhǎng)[1-2]，造成寄主作物減產(chǎn)甚至絕收。中國(guó)新疆由于優(yōu)異的地理氣候條件，從20世紀(jì)90年代后期大力發(fā)展以番茄為代表的“紅色產(chǎn)業(yè)”，2016年新疆加工番種植面積6.9萬(wàn)hm2，產(chǎn)量761萬(wàn)t,番茄醬年產(chǎn)160萬(wàn)t，是亞洲最大的番茄生產(chǎn)和加工基地。然而，近年新疆地區(qū)加工番茄受列當(dāng)危害日益嚴(yán)重，每年受列當(dāng)影響加工番茄的種植面積約為7000hm2左右,嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3]。

如何減輕列當(dāng)對(duì)作物的危害是世界性難題。目前，常見措施有化學(xué)防治(污染環(huán)境)、培育抗性品種(影響番茄品質(zhì))、種植誘捕和捕獲作物(需要輪作倒茬)、人工拔除(輕度地塊有效)等[4]。微生物防除由于綠色高效的特點(diǎn)日益受到人們重視[5],關(guān)于生防菌的研究主要集中在真菌[6]和放線菌[7]的應(yīng)用。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)廣泛應(yīng)用于植物病害防治，并取得良好效果，但用于列當(dāng)防治的研究較少。新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌DNKAS菌株會(huì)抑制分枝列當(dāng)種子萌發(fā)，在此基礎(chǔ)上針對(duì)生防菌對(duì)分枝列當(dāng)寄生體系的影響進(jìn)行研究，為日后分枝列當(dāng)?shù)姆莱ぷ魈峁├碚撝С帧?/p>

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株為枯草芽孢桿菌DNKAS，由北京達(dá)農(nóng)生物科技有限公司提供；番茄品種：盆栽試驗(yàn)為易感品種‘87-5’，購(gòu)自新疆天地禾種業(yè)有限公司，大田試驗(yàn)為‘亨氏TH1601’，由中糧昌吉番茄公司提供；DNKAS菌粉，由北京達(dá)農(nóng)生物科技有限公司提供，施用劑型為可濕性粉劑，活菌濃度達(dá) 1×1011CFU·g-1；人工合成獨(dú)腳金內(nèi)酯類似物GR24，購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司；酶活試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 菌株DNKAS對(duì)分枝列當(dāng)?shù)呐柙苑佬y(cè)定

培養(yǎng)土配制：土壤過(guò)0.5 cm×0.5 cm篩，將過(guò)篩土壤、蛭石和草炭按體積比2∶1∶1配制培養(yǎng)土。接種土配制：每千克培養(yǎng)土添加0.25 g分枝列當(dāng)種子并混勻，備用。取100 g接種土于7 cm×7 cm×11 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，將長(zhǎng)勢(shì)一致4～6葉番茄苗移入營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽2株番茄，采用灌根方式于移栽當(dāng)天、第20天、第30天將 5 mL 1×107CFU·g-1DNKAS菌液隨水澆入營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，以不加菌液為對(duì)照，并加入等量清水，每個(gè)處理12個(gè)重復(fù)，在溫度 23～30 ℃、相對(duì)濕度 60% 以上的日光溫室中培育，按需澆水施肥，并于60 d后統(tǒng)計(jì)列當(dāng)出土情況，計(jì)算寄生強(qiáng)度和防治效果。

寄生強(qiáng)度=分枝列當(dāng)總株數(shù) / 被寄生的寄主株數(shù)；防治效果=(對(duì)照寄生度-處理寄生度)/ 對(duì)照寄生度×100%。

1.3 菌株DNKAS對(duì)分枝列當(dāng)?shù)奶镩g防效測(cè)定

選新疆昌吉地區(qū)受分枝列當(dāng)寄生嚴(yán)重地塊，供試番茄品種為‘亨氏TH1601’，4月份溫室育苗，6月15日移栽，9月12日采收。生防菌DNKAS菌劑施用面積 32 hm2，以不施菌劑為對(duì)照，分4次隨水滴灌，時(shí)間分別為6月15日7.5 kg/hm2、7月3日15 kg/hm2、7月17日7.5 kg/hm2、8月9日7.5 kg/hm2。待番茄生長(zhǎng)中期列當(dāng)出土后，各處理取3個(gè)樣點(diǎn)采樣，每樣點(diǎn)取長(zhǎng)70 m、寬1.5 m，共105 m2調(diào)查分枝列當(dāng)發(fā)生情況，計(jì)算寄生強(qiáng)度和防效。采收時(shí)每處理取3個(gè)樣點(diǎn)，每樣點(diǎn)取長(zhǎng)3 m、寬1.5 m,共計(jì)4.5 m2測(cè)產(chǎn)，并統(tǒng)計(jì)百果質(zhì)量和病蟲果數(shù)。

1.4 菌劑對(duì)常規(guī)作物的生長(zhǎng)安全性評(píng)價(jià)

在溫室盆栽條件下，將2 kg培養(yǎng)土裝入 25 cm×12 cm×15 cm花盆中，每盆放置甜瓜、棉花、辣椒、向日葵、番茄種子4～6顆，按Z型排布播種，施菌量為1.5 g，以不加菌粉為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每?jī)芍苎a(bǔ)充1次菌劑，每盆劑量為0.01 g，45 d后測(cè)量加工番茄苗株高、莖粗、葉寬、葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)，通過(guò)表觀生長(zhǎng)指標(biāo)初步評(píng)價(jià)菌劑施用的安全性。

1.5 酶活試驗(yàn)

將“1.2”中營(yíng)養(yǎng)缽試驗(yàn)的番茄苗于9月10日取出洗凈，按照南京建成生物工程研究所試劑盒試驗(yàn)步驟測(cè)量番茄根部和列當(dāng)?shù)谋奖彼峤獍泵?Phenylalanine ammonia lyase,PAL)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶 (Ascorbate peroxidase,APX)酶活。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DNKAS對(duì)分枝列當(dāng)?shù)姆佬?/h3>

表1、表2分別是溫室條件及田間條件測(cè)定的菌劑防效結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，盆栽條件下，經(jīng)菌劑處理后，分枝列當(dāng)寄生數(shù)減少15.17，寄生度下降7.58，防治效果達(dá)49.7%。大田試驗(yàn)條件下，施用菌劑后分支列當(dāng)寄生數(shù)下降43.07%，寄生度減少43.01%，田間防效可達(dá)43.1%,同時(shí)，番茄產(chǎn)量增加45.91%，單果質(zhì)量提高45.89%，病蟲果數(shù)降低48.5%。因此，枯草芽孢桿菌DNKAS的施用對(duì)分枝列當(dāng)有顯著防治作用，可提高番茄產(chǎn)量及果實(shí)等級(jí)。

表1 DNKAS菌劑對(duì)分枝列當(dāng)?shù)呐柙苑佬able 1 Control effect of DNKAS bactericide on Orobanche aegyptiaca pot cultivation

表2 DNKAS菌劑對(duì)分枝列當(dāng)?shù)拇筇锓佬able 2 Control effect of DNKAS bactericide on Orobanche aegyptiaca in field

2.2 菌株DNKAS對(duì)常見作物的生長(zhǎng)指標(biāo)影響

為評(píng)價(jià)田間使用安全性，在溫室初步檢測(cè)菌劑施用對(duì)5種常見作物(甜瓜、棉花、辣椒、向日葵和番茄)生長(zhǎng)的影響。在播種45 d內(nèi)，共施菌劑4次。從表3可以看出，菌劑施用對(duì)辣椒的株高、莖粗、葉長(zhǎng)有促進(jìn)作用，增加率分別為19.39%、 20.24%、23.28%，菌劑可增加向日葵的葉寬 (4.11%)，番茄的莖粗(20.60%)及葉寬 (20.76%)，棉花的株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬同樣增加顯著，分別為19.35%、29.64%、40.11%、 16.29%；同時(shí)，對(duì)分枝列當(dāng)?shù)牧硪患闹髦参锾鸸现旮?、葉寬也有促進(jìn)作用。整體而言，該菌劑對(duì)作物有部分益生作用，植株生長(zhǎng)正常，根長(zhǎng)指標(biāo)雖均無(wú)正向促進(jìn)作用，但亦無(wú)抑制作用，可初步判斷施加菌劑對(duì)這5種植物的生長(zhǎng)是安全的。

2.3 菌劑對(duì)寄生體系防御酶活性的影響

由圖1可見，正常寄生情況下，分枝列當(dāng)植株體內(nèi)抗性酶活要比番茄根部同類酶活水平高，苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性分別高出92.48%、 25.84%、84.45%、24.12%。施用菌劑后，分枝列當(dāng)?shù)倪@4種酶活依然比根部酶活性高，相比分別高出43.01%、127.93%、41.42%、25.88%。作為全寄生性植物，已報(bào)道分枝列當(dāng)體內(nèi)分解代謝類酶活整體會(huì)高于寄主植株中的相關(guān)酶類，本試驗(yàn)表明，此結(jié)論也適用于植物的防御酶系。同時(shí)，菌劑的施入可降低番茄與列當(dāng)之間諸如苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性之間的差別，因此相比原體系，可使番茄部分抗性酶活性得到強(qiáng)化，但也會(huì)使分枝列當(dāng)?shù)某趸锲缁傅玫礁嗟脑鰪?qiáng)。從寄生體系中單一植株來(lái)看，施用枯草芽孢桿菌DNKAS后，加工番茄根部苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性與對(duì)照相比差異明顯，加工番茄根部酶活分別增加7.72%、111.41%、24.24%、 14.06%，分枝列當(dāng)酶活與對(duì)照相比，苯丙氨酸解氨酶增加44.32%、多酚氧化酶增加137.59%、超氧化物歧化酶增加53.53%、抗壞血酸過(guò)氧化物酶增加 15.67%。這與先前部分文獻(xiàn)認(rèn)為生防菌劑可提高植物誘導(dǎo)獲得性抗性結(jié)論一致[8-9]。

表3 DNKAS菌劑施用后作物的生長(zhǎng)指標(biāo)Table 3 Crop growth under treatment of bactericidal agent of DNKAS

3 討 論

枯草芽孢桿菌對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，具有可在植物或土壤中大量繁殖和定殖、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)和空間位點(diǎn)、誘導(dǎo)抗性、促生、增產(chǎn)和拮抗等特性，廣泛用于植物病害防治[10-11]，擁有作為列當(dāng)生防菌的潛力。

盆栽試驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌DNKAS通過(guò)降低加工番茄根部分枝列當(dāng)寄生數(shù)量，從而提高防除效果。結(jié)合新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期工作，枯草芽孢桿菌DNKAS主要是通過(guò)抑制分枝列當(dāng)萌發(fā)數(shù)量和縮短已萌發(fā)分枝列當(dāng)芽管長(zhǎng)度雙重作用下，減少列當(dāng)萌發(fā)率和芽管接觸到加工番茄根部的概率來(lái)增加防除效果。加工番茄移栽1個(gè)月內(nèi)是分枝列當(dāng)寄生的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)菌劑的施用是緩解寄生危害的最敏感時(shí)期。

圖1 寄生體系的防御酶變化Fig.1 Changes of defense enzymes in parasitic system

在大田試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌DNKAS通過(guò)降低分枝列當(dāng)寄生數(shù)量，使加工番茄增產(chǎn)。列當(dāng)寄生數(shù)量和產(chǎn)量是評(píng)判生防菌防治效果的關(guān)鍵指標(biāo)。尖孢鐮刀菌Br-2[12]和密旋鏈霉菌[13]能夠減少列當(dāng)寄生數(shù)量，提高防效，使作物增產(chǎn)。本研究中，菌劑通過(guò)降低分枝列當(dāng)出土量，減輕由于分枝列當(dāng)寄生對(duì)加工番茄的影響，使單個(gè)果實(shí)質(zhì)量增加，進(jìn)而增產(chǎn)。病蟲果數(shù)減少，可能是由于枯草芽孢桿菌對(duì)病原菌引起的疾病具有直接和間接的生物抑制作用[14]。

微生物防治具有無(wú)殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最有可能替代化學(xué)殺菌劑的方法之一。但生防菌的大量引入不可避免地會(huì)影響農(nóng)田植物的正常生命活動(dòng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株DNKAS施用后在一定程度上能夠促進(jìn)5種田間常規(guī)作物的生長(zhǎng)。但要開發(fā)出能夠真正在田間使用且對(duì)農(nóng)作物安全、對(duì)列當(dāng)高度致病的生防菌劑，還需要進(jìn)行模式動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)及對(duì)環(huán)境微生態(tài)影響的試驗(yàn)。

被分枝列當(dāng)寄生期間，加工番茄和分枝列當(dāng)酶活力均有所提升，列當(dāng)體內(nèi)酶活力高于加工番茄，且酶活力變化趨勢(shì)與加工番茄根部酶活力變化趨勢(shì)一致。Aybeke等[15]研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌通過(guò)提高寄主多酚氧化酶活性，消除列當(dāng)寄生時(shí)產(chǎn)生的活性氧以減輕列當(dāng)危害。Mabrouk等[16]報(bào)道根瘤菌提高豌豆中多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性，使豌豆根部產(chǎn)生更多的酚類化合物和木質(zhì)素進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)鋸齒列當(dāng)抗性。加工番茄根部酶活力升高是由于生防菌有助于增加加工番茄根部PAL、PPO、SOD、APX酶活力。列當(dāng)種子是通過(guò)穿透植物根部韌皮部和木質(zhì)部完成寄生的。在列當(dāng)種子萌發(fā)寄生前，PAL和PPO升高表明枯草芽孢桿菌DNKAS增加了加工番茄細(xì)胞壁厚度、組織木質(zhì)化程度，提高分枝列當(dāng)芽管穿透加工番茄根部的難度。SOD和APX活性與抗氧化能力呈正相關(guān)，活性增加表明菌劑增強(qiáng)了加工番茄的抗逆性。活性氧是致病菌感染的常見副產(chǎn)物[15]?；钚匝跬ㄟ^(guò)超氧陰離子、過(guò)氧化氫自由基、過(guò)氧化氫等多種有害自由基干擾細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和氧化還原系統(tǒng)，破壞核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。APX和SOD能夠快速消滅活性氧，阻止有害H2O2水平的積累，因此可防止分枝列當(dāng)寄生[17-19]。

導(dǎo)致分枝列當(dāng)根部酶活力總體高于加工番茄根部酶活力，且酶活力變化趨勢(shì)與加工番茄根部酶活力變化趨勢(shì)一致的原因尚不明確。目前，尚無(wú)對(duì)比研究生防菌對(duì)寄主與列當(dāng)之間酶活性變化的報(bào)道。Lilach等[20]通過(guò)研究寄主與列當(dāng)之間內(nèi)生菌群落變化發(fā)現(xiàn)，列當(dāng)寄生植物后，兩者內(nèi)生菌群落變得越來(lái)越相似。造成這種現(xiàn)象的原因是內(nèi)生菌群落可以借助植物體內(nèi)維管束傳播，而列當(dāng)通過(guò)吸器伸入到植物的木質(zhì)部和韌皮部吸收寄主養(yǎng)分和水分，進(jìn)而造成內(nèi)生菌從植物遷移到列當(dāng)中，使內(nèi)生菌群落變化趨于相似。列當(dāng)體內(nèi)大部分免疫抗性酶活性高于寄主植物，可能由于施用生防菌后植物體內(nèi)形成免疫刺激信號(hào)，列當(dāng)吸收植物營(yíng)養(yǎng)代謝時(shí)感知到信號(hào)并在體內(nèi)形成響應(yīng)。

枯草芽孢桿菌DNKAS適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，易于培養(yǎng)，防治效果好，可在移苗時(shí)隨水滴灌用于防治列當(dāng)，是一種潛在的優(yōu)秀生防菌。