甘草酸拮抗雷公藤多苷所致腎毒性的分子機(jī)制研究

李秋紅,胡勇,鞠愛(ài)霞,趙嬌,郄青松,周育生

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

雷公藤多苷是從雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.F.去皮根部提取的皂苷類有效成分,雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯酮等二萜類成分、雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤紅素等三萜類成分、雷公藤次堿和雷公藤晉堿等生物堿類成分是其主要有效和有毒成分[1-4],用于治療慢性腎小球疾病、腎病綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等難治或頑固性疾病,有“中草藥激素”之稱,但易產(chǎn)生腎毒性，臨床使用受限[5-7]。中藥配伍具有中醫(yī)遣方用藥的優(yōu)勢(shì)特色,既可增強(qiáng)療效,又可減輕或消除毒性。甘草GlycyrrhizauralensisFisch.具有“和諸藥,解百毒”之稱,三萜皂苷類化合物甘草酸是甘草主要活性成分。研究表明,甘草酸可保護(hù)腎臟，拮抗藥源性、缺血再灌注性、梗阻性等多種類型腎損傷,臨床上用于病毒性肝炎、慢性腎病和免疫性皮膚病等的治療[8-10]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),雷公藤配伍甘草治療腎病，療效優(yōu)于單用雷公藤,具有增效減毒的作用[11-14],但產(chǎn)生這種效應(yīng)的分子機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的有效方法[15],能從組織、細(xì)胞、分子等層面對(duì)成分復(fù)雜的中藥進(jìn)行研究,是揭示藥物、基因和疾病相互作用的系統(tǒng)和整體方法,為中藥作用機(jī)制的研究提供思路。

因此,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)甘草酸與雷公藤多苷的作用靶點(diǎn),從中選出與腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)的靶基因,并在動(dòng)物水平進(jìn)行驗(yàn)證,以期為臨床兩藥配伍使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及主要試劑

雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司,批號(hào):20180603);甘草酸(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):X12A9C58435,純度>95%);尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒、肌酐(Scr)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20181218、20181214);動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司,批號(hào):EA12KA9784);FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司,批號(hào):R6720);FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)核酸染料(德國(guó)羅氏診斷有限公司,批號(hào):04913914001);Western及IP裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P0013);P-gp一抗、MRP2一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào):bs1468R、bs1092R);β-actin一抗、辣根酶標(biāo)記抗鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào):18AV0409、137699、136080);超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(上海愛(ài)必信生物科技有限公司,批號(hào):EL0419004);戊巴比妥鈉(德國(guó)Merck公司,批號(hào):P11011)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量180～200 g,購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(黑)2018007，飼養(yǎng)在溫度為20～26 ℃,濕度為40%～70%的環(huán)境中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),批號(hào):20190930s1000121[232]。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(SynergyMX,BioTek公司);切片機(jī)(RM2135,Leica公司);顯微攝影成像系統(tǒng)(Moticam3000,Motic公司);qPCR儀(iQ5,Bio-Rad公司);紅外微定量分析儀(Direct Detect,Merck公司);電泳系統(tǒng)(Mini PROTEAN Tetra Cell,Bio-Rad公司);全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+,Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)甘草酸拮抗雷公藤多苷所致腎毒性的作用靶點(diǎn)

2.1.1 構(gòu)建雷公藤多苷主要成分和甘草酸的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取雷公藤多苷中6種主要成分雷公藤甲素(Triptolide)、雷公藤內(nèi)酯酮(Triptonide)、雷公藤晉堿(Wilforgine)、雷公藤次堿(Wilforine)、雷公藤紅素(Tripterine)和雷公藤內(nèi)酯甲(Wilforlide A)及甘草酸(Glycyrrhizic acid)的結(jié)構(gòu)式文件和Canonical SMILES名稱,將結(jié)構(gòu)式文件導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)將Canonical SMILES名稱輸入SwissTargetPrediction中檢索靶點(diǎn)基因,此外,在CTD、GeneCards、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充篩選上述7個(gè)有效成分的靶點(diǎn)基因;所有靶點(diǎn)基因在UnitProt數(shù)據(jù)庫(kù)中更正為官方名稱,剔除重復(fù)靶點(diǎn)基因,將成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因的關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,得到雷公藤多苷和甘草酸成分的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.2 構(gòu)建腎毒性-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Gene子項(xiàng)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索腎毒性的英文名稱“Nephrotoxicity”和“Renal toxicity”,得到關(guān)于腎毒性的靶點(diǎn)基因,剔除重復(fù)的部分,將腎毒性和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因的關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,得到腎毒性-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.3 靶點(diǎn)的富集分析 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge功能,將雷公藤多苷主要成分和甘草酸的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖以及腎毒性-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖合并得到交集靶點(diǎn),將交集靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(Gene ontology,GO)富集分析,獲得雷公藤多苷主要成分和甘草酸作用于腎毒性靶點(diǎn)的分子功能信息。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 雷公藤多苷給藥劑量根據(jù)臨床給藥劑量折算及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定為130 mg·kg-1,甘草酸給藥劑量依據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定為57 mg·kg-1，保肝效果最佳[16-17]。將適應(yīng)性喂養(yǎng)后的SD大鼠隨機(jī)分為空白組(生理鹽水)、甘草酸組(57 mg·kg-1)、雷公藤多苷組(130 mg·kg-1)和聯(lián)合給藥組(甘草酸57 mg·kg-1+雷公藤多苷130 mg·kg-1)，每組10只,每日灌胃給藥1次,連續(xù)干預(yù)29 d。

2.2.2 生物樣本采集 大鼠連續(xù)給藥29 d后,禁食不禁水12 h,2%戊巴比妥鈉(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血,收集血液8～10 mL，室溫靜置40 min,于3 000 r·min-1離心10 min得血清樣本。腹主動(dòng)脈取血結(jié)束后取兩側(cè)腎臟,用生理鹽水沖洗表面并用濾紙吸干多余的水分得腎臟樣本,將血清樣本和腎臟樣本置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 腎損傷生化指標(biāo)測(cè)定 血清中BUN和Scr含量分別按照BUN檢測(cè)試劑盒和Scr檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

2.2.4 HE染色觀察組織病理 大鼠腎臟組織經(jīng)10%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟,梯度水化,蘇木素染色,蒸餾水沖洗,含1%鹽酸的70%乙醇水化,蒸餾水漂洗,70%和80%乙醇浸泡后,90%伊紅醇溶液染色,脫水,透明,中性樹(shù)膠封片,顯微攝影成像系統(tǒng)×400下拍片，記錄結(jié)果。

2.2.5 qPCR法檢測(cè)腎組織中Mdr1a、Mdr1b、MRP2 mRNA的表達(dá)量 采用動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒提取各組腎臟組織總RNA,用核酸蛋白分析儀檢測(cè)總RNA的濃度及純度,FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)合成cDNA,引物Mdr1a、Mdr1b、MRP2及內(nèi)參β-actin的序列由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1),用SYBR?Green Master預(yù)混液于qPCR儀上進(jìn)行測(cè)定,采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列Table 1 Sequences of qPCR primers

2.2.6 Western blot法檢測(cè)腎組織中P-gp、MRP2的蛋白表達(dá)量 采用Western及IP細(xì)胞裂解液提取腎臟總蛋白,紅外微定量分析儀測(cè)定蛋白濃度,5×SDS-PAGE上樣緩沖液配制蛋白樣品,按照SDS-PAGE凝膠試劑盒要求配置8%、12%分離膠及5%濃縮膠,取8 μL樣品上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,待電泳結(jié)束后用半轉(zhuǎn)干機(jī)(恒壓15 V,20～30 min)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜;用5%脫脂奶粉封閉2 h;以1∶500稀釋一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,次日回收一抗,TBST沖洗,以1∶10 000稀釋二抗,室溫孵育1 h,回收二抗,TBST沖洗;超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯影,β-actin作為內(nèi)參,置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。用Image J軟件測(cè)定各組蛋白條帶的光密度值并分析各組灰度值。

3 結(jié)果

3.1 甘草酸拮抗雷公藤多苷所致腎毒性的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 雷公藤多苷與甘草酸靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 各數(shù)據(jù)庫(kù)中篩查到雷公藤多苷和甘草酸靶點(diǎn)基因數(shù)目如下:雷公藤甲素63個(gè),雷公藤內(nèi)酯酮10個(gè),雷公藤紅素263個(gè),雷公藤晉堿103個(gè),雷公藤次堿106個(gè),雷公藤內(nèi)酯甲264個(gè),甘草酸107個(gè),根據(jù)Cytoscape 3.7.2軟件分析雷公藤多苷主要成分和甘草酸的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),圖中包含593個(gè)節(jié)點(diǎn)(7個(gè)成分和586個(gè)相關(guān)靶點(diǎn))和916條線(成分與靶點(diǎn)的關(guān)系),見(jiàn)圖1。

3.1.2 腎毒性-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 獲得腎毒性的相關(guān)靶點(diǎn)281個(gè),根據(jù)Cytoscape 3.7.2軟件分析腎毒性-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,圖中包含282個(gè)節(jié)點(diǎn)(281個(gè)相關(guān)靶點(diǎn))和281條線(成分與靶點(diǎn)的關(guān)系),見(jiàn)圖2。

注：Triptolide.雷公藤甲素;Triptonide.雷公藤內(nèi)酯酮;Wilforgine.雷公藤晉堿;Wilforine.雷公藤次堿;Tripterine.雷公藤紅素;Wilforlide A.雷公藤內(nèi)酯甲;Glycyrrhizic acid.甘草酸圖1 雷公藤多苷主要成分和甘草酸-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Main components of tripterygium glycosides and glycyrrhetic acid-target network

注：Nephrotoxicity.腎毒性圖2 腎毒性-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Nephrotoxicity-target network

3.1.3 靶點(diǎn)的富集分析 通過(guò)Cytoscape 3.7.2中的Merge功能獲得交集靶點(diǎn)73個(gè),說(shuō)明雷公藤多苷主要成分和甘草酸與腎毒性有73個(gè)相關(guān)的共有基因(圖3A)。通過(guò)GO富集獲得GO條目(GOTERM_MF_DIRECT)81個(gè),基因富集數(shù)量最多的10個(gè)條目、各條目富集的基因及所占比例如圖3B所示,其中富集基因數(shù)量占比最多的是蛋白結(jié)合(BP)條目(56個(gè),76.7%)。BP富集的基因中ABCB1和ABCC2是其涉及的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體：ABCB1即P-糖蛋白(P-gp)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，由Mdr1a和Mdr1b基因編碼；ABCC2即MRP2外排轉(zhuǎn)運(yùn)體。二者在腎臟中的腎上腺和腎小管等部位有較高表達(dá),將毒素和有害藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外,進(jìn)而排出體外。研究表明,甘草酸誘導(dǎo)P-gp表達(dá)[18],推測(cè)與雷公藤多苷配伍時(shí)，甘草酸可能是通過(guò)激活P-gp和MRP2蛋白外排作用,使雷公藤多苷中毒性成分外排增加,產(chǎn)生減毒效果。因此,本研究對(duì)P-gp和MRP2兩個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 交集靶點(diǎn)(A)及GO富集分析(B)Fig.3 Intersection target (A) and GO enrichment analysis (B)

3.2 甘草酸拮抗雷公藤多苷腎毒性的分子機(jī)制

3.2.1 大鼠血清BUN和Scr含量的變化情況 與空白組比較,雷公藤多苷組大鼠血清中BUN和Scr含量顯著升高(P<0.01),甘草酸組大鼠血清中BUN含量呈升高的趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Scr含量顯著升高(P<0.05);與雷公藤多苷組比較,聯(lián)合組、甘草酸組大鼠血清中BUN和Scr含量顯著下調(diào)(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清BUN和Scr含量Table 2 Serum contents of BUN and Scr in each group

3.2.2 組織病理觀察 空白組腎組織結(jié)構(gòu)較規(guī)則,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色清晰,腎小管腔、腎小球和囊腔完整,無(wú)充血或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象;甘草酸組腎組織結(jié)構(gòu)較規(guī)則,細(xì)胞核染色清晰,腎小管和腎小球相對(duì)完整,未見(jiàn)充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);雷公藤多苷組腎組織結(jié)構(gòu)紊亂,染色不均,腎小管及間質(zhì)有較明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、混濁,腎小管內(nèi)有大量均勻的紅色染色物質(zhì)(蛋白尿),腎小球萎縮,球囊擴(kuò)張,腎小管出現(xiàn)融合甚至消失形成空腔;聯(lián)合組腎組織結(jié)構(gòu)較雷公藤多苷組完整,腎小管內(nèi)紅色染色物質(zhì)明顯減少,腎小管上皮混濁腫脹等病變也明顯改善，腎小球萎縮、囊腔擴(kuò)張減少。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)的顯微圖(HE,×400)Fig.4 Micrographs of renal histological morphology of rats in each group (HE，×400)

3.2.3 雷公藤多苷配伍甘草酸對(duì)腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)的影響 與空白組比較,甘草酸組大鼠Mdr1a mRNA表達(dá)量升高(P>0.05),Mdr1b、MRP2 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05,P<0.01)，雷公藤多苷組大鼠Mdr1a、Mdr1b、MRP2 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05,P<0.01);與雷公藤多苷組比較,甘草酸組、聯(lián)合組大鼠Mdr1a、Mdr1b、MRP2 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)圖5。

3.2.4 雷公藤多苷配伍甘草酸對(duì)腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp和MRP2蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較,甘草酸組P-gp、MRP2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05,P<0.01),雷公藤多苷組P-gp、MRP2蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01);與雷公藤多苷組比較,甘草酸組、聯(lián)合組P-gp、MRP2蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖6。

注:與空白組比較,*P<0.05，**P<0.01；與雷公藤多苷組比較,圖5 各組大鼠腎臟組織Mdr1a、Mdr1b、MRP2 mRNA表達(dá)量Fig.5 The mRNA expressions of Mdr1a, Mdr1b, MRP2 in renal tissue of rats in each group

注:與空白組比較,*P<0.05，**P<0.01；與雷公藤多苷組比較,圖6 各組大鼠腎臟組織P-gp、MRP2蛋白表達(dá)量Fig.6 The protein expressions of P-gp and MRP2 in renal tissue of rats in each group

4 討論

藥源性腎損傷是由藥物所致的各種腎臟損傷的一類疾病的總稱,主要表現(xiàn)為腎毒性反應(yīng)及過(guò)敏反應(yīng),濫用藥物、不規(guī)范用藥及腎毒性藥物的使用是引發(fā)藥源性腎損傷的重要原因,從而導(dǎo)致腎病患者數(shù)量逐年增多,臨床上20%～33%的急性腎功能損傷由藥物引發(fā)[19]。雷公藤多苷是從雷公藤中提取的有效成分,長(zhǎng)期或過(guò)量使用易產(chǎn)生肝腎毒性等不良反應(yīng),其中腎毒性臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、水腫、腎小管損傷、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及急性腎功能衰竭等[20],為了降低雷公藤多苷的毒副作用,古今醫(yī)家在藥性理論基礎(chǔ)上采用配伍用藥對(duì)其毒性進(jìn)行制約，可有效地保證其安全性[21]。有“解百藥毒”之稱的甘草常與雷公藤配伍用于綜合性腎病的治療,可有效緩解雷公藤對(duì)肝、腎器官的損傷。近年來(lái)甘草配伍雷公藤拮抗肝毒性的研究甚多,研究表明甘草酸可通過(guò)誘導(dǎo)CYP3A酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2活性及激活Nrf2通路,增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化，抑制細(xì)胞凋亡及免疫損傷等發(fā)揮對(duì)雷公藤致肝損傷的拮抗作用[22-24]。但對(duì)于其如何緩解腎損傷的機(jī)理尚不明確,因此有必要對(duì)其中的生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行探索。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)甘草酸與雷公藤多苷作用于腎毒性的潛在靶點(diǎn),并通過(guò)GO富集分析其中涉及的主要分子功能。共獲腎毒性與甘草酸和雷公藤的共同靶點(diǎn)73個(gè),其中76.7%的靶點(diǎn)富集于BP條目,涉及蛋白調(diào)節(jié)(ABCB1、ABCC2)、氧化應(yīng)激(NOS、SOD)、炎癥因子(TNF、IL-6)、細(xì)胞凋亡(PI3K、AKT、MAPK)等,說(shuō)明甘草酸對(duì)雷公藤多苷腎毒性的拮抗具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用。研究表明[25],細(xì)胞毒性作用、免疫損傷、自由基與氧化損傷等均是藥源性腎損傷的機(jī)制。在使用雷公藤甲素治療膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠時(shí),發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟損傷加重,且腎皮質(zhì)中雷公藤甲素濃度高于延髓,此時(shí)腎臟有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Oct2)表達(dá)上調(diào)[26],說(shuō)明腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或功能發(fā)生改變,會(huì)增強(qiáng)毒性藥物的蓄積,產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用,為此本研究選擇GO富集的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1、ABCC2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予大鼠雷公藤多苷后,其血清中腎臟功能指標(biāo)BUN和Scr含量顯著升高。大鼠體內(nèi)BUN和Scr蓄積,會(huì)導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)功能降低。配伍甘草酸后能顯著降低BUN和Scr含量,改善腎小球?yàn)V過(guò)功能的損傷。HE染色結(jié)果顯示,雷公藤多苷對(duì)腎小球、腎小管及腎間質(zhì)均有損害作用,而配伍甘草酸后能減少蛋白尿,改善腎小管上皮腫脹、腎小球萎縮及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),說(shuō)明甘草能拮抗雷公藤的腎毒性,對(duì)腎臟起保護(hù)作用。為進(jìn)一步明確雷公藤多苷所致腎損傷及甘草酸對(duì)腎臟的保護(hù)作用機(jī)制是否與ABCB1(P-gp)、ABCC2(MRP2)轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān),本實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp和MRP2進(jìn)行檢測(cè)。采用qPCR對(duì)編碼P-gp的基因Mdr1a、Mdr1b和MRP2的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),采用Western blot對(duì)P-gp和MRP2蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,雷公藤多苷對(duì)編碼外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp及MRP2基因和蛋白均有不同程度的抑制作用,具有一致性,說(shuō)明雷公藤多苷對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響可能是通過(guò)對(duì)基因表達(dá)的抑制傳遞到蛋白表達(dá)的抑制，在一定程度上限制了轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp和MRP2對(duì)雷公藤多苷有毒成分雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲等的轉(zhuǎn)運(yùn),致使這些有毒成分在腎臟滯留積累,導(dǎo)致腎功能異常;而甘草酸配伍可有效逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷對(duì)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp和MPR2基因和蛋白的下調(diào)作用,使雷公藤多苷有毒成分有效排出,改善轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能,減輕細(xì)胞毒性作用。因此,甘草酸配伍雷公藤多苷拮抗其腎毒性可能機(jī)制之一是逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp和MPR2功能,使雷公藤多苷毒效成分及時(shí)排出體外,減少在腎臟的蓄積,達(dá)到保腎臟作用。甘草酸有2個(gè)差向異構(gòu)體,分別為18α-甘草酸(18α-Glycyrrhetinic acid,α-GL)和18β-甘草酸(18β-Glycyrrhetinic acid,β-GL),有學(xué)者研究α-GL與β-GL對(duì)Caco-2細(xì)胞P-gp功能和表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)α-GL對(duì)P-gp具有抑制作用，β-GL對(duì)P-gp具有誘導(dǎo)作用，但不存劑量依賴性[27-28]。然而,本課題組研究發(fā)現(xiàn),甘草酸對(duì)P-gp具有誘導(dǎo)作用,其可能原因是從不同的層面上對(duì)甘草酸進(jìn)行研究導(dǎo)致α-GL與β-GL在體內(nèi)的含量不同,從而得出不同的結(jié)果[29-30]。

綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)甘草酸拮抗雷公藤多苷腎毒性可能的分子機(jī)制,并對(duì)甘草酸配伍雷公藤的藥效和其中涉及的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,為兩藥配伍的臨床應(yīng)用提供一定數(shù)據(jù)支持,但中藥往往是通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同發(fā)揮作用,對(duì)于其他涉及的可能分子機(jī)制還有待進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,此外網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)使用的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化學(xué)成分收錄不足,本研究主要對(duì)雷公藤多苷6種成分的靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè),今后可通過(guò)UPLC-MS對(duì)雷公藤多苷的成分進(jìn)行進(jìn)一步分析,提高網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的可靠性。